在真核细胞中表达神经生长因子的基因构建物的制备方法

专利名称：在真核细胞中表达神经生长因子的基因构建物的制备方法
技术领域：
本发明涉及从转化细胞获得叫作神经生长因子(β-NGF)的多肽，更特定地说，涉及通过将基因构建物插入合适的真核细胞系的重组DNA技术，获取具生物活性人类成熟型(β-亚单位)的方法。
神经生长因子(NGF)首先在鼠肉瘤中发现(Levi-Monta lcini，R.et al.，J.Exp.Zool.116321，1951)然后被纯化，从雄鼠唾液下颌腺(Varon，S.et al.，Biochemistry 62202 1967)和蛇毒(Angeletti，R.H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 65668，1970)中达到均一性。已知道许多其它相对富含NGF的来源，包括豚鼠前列腺(Harper，G.P.et al.，Nature 279160，1979)和人胎盘(Goldstein，L.D.et al.，Neurochem.Res，3175，1978.Walker，P.et al.，Life Science 26195，1980，Fidia Patent 47745 A88)。在其它组织如哺乳动物中枢神经系统中已发现少量NGF(Varon，S.，Discussions in Neroscience，Vol.ⅠⅠ，No.3，1985;Hefti F.et al.，Neuroscience 1455，1985)。这些NGF潜在来源与明显的作用位点的生理学关系尚不清楚，但一般认为NGF由各种外周组织分泌，这些组织需来自对NGF产生应答的细胞的刺激。
从鼠下颌腺获取的NGF是用于NGF的体外及体内的活性研究最多的NGF。NGF的体外生物活性范围是在初级神经细胞及克隆细胞系上测定的。初级神经细胞中在体外与NGF产生应答的有发育中从脊神经节根来的胎儿感觉神经元(胎期8-12天)，从交感神经节来的自主去甲肾上腺素能胎儿神经元，从隔膜及嗜铬肾上腺细胞来的胆碱能胎儿神经元。感觉及交感神经元依赖NGF而存在和发育，但是胆碱能神经元不需要依赖NGF而存在，只需要依赖它进行分化，即表达与神经递质相连的表型特征。在嗜铬肾上腺细胞第一期发育中(从神经脊衍生)加入NGF能引起神经表型的表达。细胞系中在体外与NGF产生应答的如参考文献中所述，包括从神经脊肿瘤衍生的嗜铬肾上腺细胞，称为嗜铬细胞瘤细胞(PC12)，和人类成神经细胞瘤细胞。用β-NGF处理后，这些细胞的行为发生了改变，从强增生状态变为分裂期后状况。
从鼠下颌腺获取的神经生长因子是被定性最多的并具有化学和免疫化学特征。从鼠腺来的NGF，其作用象7 S型蛋白质复合物(分子量约140，000道尔顿)，由3个亚单位(α，β，γ)组成，与一个Zn+原子配位。
7 S分子与生物活性有关的最感兴趣部分由两条多肽链组成，每条链分子量为13，250，由118个氨基酸组成。每条链或单体有三个硫桥，它们是在两个半胱氨酸残基间形成共价键，从而使蛋白质的三维结构具有强的稳定性。两个NGF单体由弱键相连形成具分子量为26，500的二聚体。已证明生物活性与称为2.5 S或传统上叫做β亚单位的二聚体有关。目前，并不知道它是否也存在于单体中。
用基因工程技术可以鉴别编码NGFβ亚单位(β-NGF)的基因(Scott，J.et al.，Nature 302∶538，1983;Ullrich，A.et al.，Nature 303∶821，1983，EP Patent Publn，No.0121338)。编码此分子的人体基因位于染色体Ⅰ的短臂上，此基因编码合成一个比组成生物活性分子的分子量为26，500的分子大得多的分子。因此，该基因开始时指示合成较大的NGF前体或前NGF。还进一步证明编码NGFβ亚单位的基因在从鸟到人(Meier，R.et al.，EMBO J.5∶1489，1986)的不同种中高度保守。
对鼠、人、牛和鸡β-NGF的核苷酸顺序的阐明使我们可以比较这些分子的保守位点和非保守位点，以及它们与生物活性和抗原性之间的联系。在进化中β-NGF的总体保守性惊人地高。从雄鼠唾液下颌腺中纯化的成熟型NGF的118个氨基酸，在牛β-NGF中只有16个氨基酸不同，在鸡β-NGF中19个不同，在人β-NGF中11个不同，而牛和人β-NGF只有6个氨基酸不同。还原β-NGF中的三个S-S桥会使它完全丧失生物活性。在氨基酸顺序高水平的总体保守性与免疫化学型的低交又反应活性之间存在的明显差异是由于种间的氨基酸的改变是位于特定的“簇”中。用水疗法跟踪可以证明这些改变几乎全部发生在被认为是潜在抗原决定簇的亲水位点上。就目前所研究的全部种的NGF分子中，只有一个亲水区看来是高度保守的。
用重组DNA技术可以构建能大量表达所感兴趣的蛋白的载体系统。此技术使分子生物学家能装配DNA顺序以产生能生产所感兴趣的蛋白的杂交分子。这个方法采用各种反应，如用限制性内切酶酶切，用连接酶连接所获得的片段，化学合成要装配的寡核苷酸，及其它各实验室所用的此方面的方法(Mariatis，T.et al.，Molecular Cloning.A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Laboratory NY，1982)。为获得高水平的表达，要装配的DNA片段需提供必要信息。如复制原点，对抗生素的选择性，一个表达启动子，所感兴趣的基因转录的激活子，及其它该材料的培养者所知的特性。这些片段以一个合适的方式组合产生一种质粒，如果所感兴趣的基因被自然地插入转录和翻译的调节顺序的下游，所得的质粒在表达上就被限定。这样，质粒或表达载体能在宿主细胞中表达蛋白。然后可通过一纯化系统获得蛋白。自然控制许多基因，如生长因子，表达的元素(启动子)在它们表达中并不强，仅在通常不清楚的天然的合适条件下被活化。为此，要用活性已知的启动子，如乳多空病毒系列，或其它已知的启动基因顺序。因此，用于高水平表达的元素是不同源(真核，细菌，病毒等)的DNA的组合，在不同基因部分的末端，连接而形成杂合子。基因的转录和转译活性依赖于调节和编码区域间的合适的距离。
通过以上介绍可知，使调节顺序合适地工作的一种最佳模式是将所导入的基因置于与天然基因中相同的位置。所用的有一种系统中，调节顺序还包括编码顺序的一些氨基酸。与所导入的基因连接产生一融合蛋白。另一方面，如果除去该融合部分，可能获得更高的生物学价值。如果不用融合蛋白技术，传统的用于获得位于调节顺序邻近区域基因的方法依赖于存在合适的限制性位点，以允许进行克隆。如果相适位点不在邻近而在不同位点处，有可能得到与合成的含所需限制性位点的寡核苷酸或接头的联合片段。如果允许使用接头的限制性位点不在邻近，可用Bal31或S1酶的DNA缺失技术。这种可能性并不能得到精确的缺失，因此，必需对各种克隆进行测序，检查那个是最合适的。这些系统对分子生物学家来说限制性很大，因此需要发展基它策略，作为新技术出现的任务，例如聚合酶链反应(PCR)(Saiki et al.，Science 239∶487，1988;Scharf，S.J.，Science 233∶1076，1986)。
用此技术，可以将一个基因片段扩增到106。其原理是依据用两个可以配对的寡核苷酸，每个分别连在一条欲扩增的DNA链上。与要检测的基因顺序相关的两个寡核苷酸之间的距离给出了要生产的分子的大小。这两个寡核苷酸是这样构建的，使它们在顺序中有一个限制性位点，以供以后克隆。此限制性位点是天然存在的，或者构建的，尤其是通过降解最小数目的碱基。这个方法可被称作位点导向诱变，用它可以在分子生物学家理论上确定的位置上构建限制性位点。与其它基因片段相适的位点的构建在一方面使克隆变得容易，而且尤其给出了按既定的方式连接不同基因片段的可能性。这种技术可被称作通过直接诱变的克隆。实际操作上，通过重组DNA技术，可通过直接表达来表达完整异源多肽，或可表达与一个类似多肽的一部分氨基酸顺序融合的异源多肽。一般来说，这样获得的产品无生物学活性(British Patent Application Publ.No，2007676 A;Wenzel，American Scientist 68，664，1980)。
对神经生长因子β亚单位的人类基因的分离，告诉我们一个重要的可能性。通过重组DNA技术可能产生足够量的此稀有蛋白。实际上，神经生长因子能在临床上应用治疗各种神经退化疾病。这意味着有与用重组DNA技术获得NGFβ亚单位相关的文献(European Patent Publ.No.0121388;Bruce，G.et al.，Neurobiology of Aging 10∶89，1989;Hu，G.et al.，Nucleic Acid Research 70∶57，1988;Edwards，R.H.，Mol.Cell Biol.8∶2456，1988;Emfors，P.，Proc Natl.Acad.Sci.86∶4756，1989)。在生产中时，仅当不能在微生物细胞中较便宜的表达时，才选用哺乳动物细胞，而不是细菌。实际上，在细菌系如大肠杆菌中生产某些蛋白要经济得多，但是总体上说，这个宿主/载体系统只忠实地扩增形成蛋白的氨基酸线性顺序，在细菌中获得一种不溶性物质。假设给出的产物能够从这一材料中以一个经济上有利的方法制备，则可以选用大肠杆菌，就如用于某些较小的分子的情况下，如干扰素和一些动物生长蛋白，对它们来说，分子在体外正确折叠是可行的。这些系统在下面情况下是最多产的，一般涉及只有一个二硫键的蛋白，且在其使用中(作为诊断抗原或疫苗组份)不需明确限定构型的肽或蛋白质。
神经生长因子(β-NGF)所属的治疗性蛋白质需要一个正确的构象以具有活性及可使用性，也需没有抗原性应答。对于从重组DNA获得的蛋白，制备方法包括糖基化，形成正确的二硫键，以及其它转导后修饰。细菌系大肠杆菌不能达到这个要求，而哺乳类真核细胞和酵母则可以。用生物工程技术获得的人类β-NGF作为药剂的潜在用途需考虑这些问题。
已证明NGF活性依赖于二聚体型式，即118个氨基酸装配成二条相似的多肽、用巯基乙醇还原能使生物活性实际上降到零。复性使半胱氨酸之间形成三个二硫键，从统计学角度看，得到具正确结构，而且与天然的相同的分子的概率是15个中1个。因此在大肠杆菌中获取此分子并不保证结构的同源性，及它在人类中作为药剂的应用。实际上，大肠杆菌产生的人类NGF纯化到均一后在免疫印迹上显示出一系列不属于生物活性二聚体型的带，该免疫印迹是通过鼠β-NGF专一性的多克隆抗体进行的。进一步地，此结构和类型的混合物的生物活性与天然来源如胎盘组织纯化的类似人类型相比少10倍。
在大肠杆菌中克隆和获得神经生长因子的方法，如果在一方面产生高表达水平的所感兴趣蛋白，另一方面产生一系列不精确的分子，在体内给药时能引起副反应，如会自然出现能识别和阻遏分子的生物活性的抗体。同时，在大肠杆菌中克隆的成熟分子有一个不能去除的起始甲硫氨酸，它肯定是具有免疫原性的，因为它在分子的暴露部分。
另一个方法涉及在真核细胞中克隆前NGF原，包括利用在真核细胞中天然存在的专一性肽酶的攻击以获取成熟分子。特定地，克隆在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中进行。从现有资料看，人体NGF整个基因组克隆还没完全测序，但已证明基因延伸超过10kd(Ullrich，A.et al.，Nature 303∶821，1983)。这样延伸的基因不允许常规克隆此整个基因顺序。所用方法是克隆仅含此蛋白编码的部分cDNA。现在还没分离人体NGF的完整cDNA(5′位有些顺序缺失)，但其它来源(鼠、牛、鸡等)的NGF遗传信息的情况已经知道(Meier，R.et al.，EMBO J.51489，1986;Selby，H.J.，J.of Neuron Research 18∶293，1987)，从它们可得出有意的推理。鼠NGF以单拷贝形式存在，产生至少四种不同大小的不同遗传信息(Selby，M.J.et al.，Mol.Cell Biol.7∶30 57，1987)。这些不同大小尤其表现在不同起始AUG密码子，对成熟蛋白来说最重要的在位点187和121处。在不同组织中，这些遗传信息以不同的相对多的量存在。在下颌腺中那些在187位起始的比在121位起始的多10倍以上。但是，不同的证据表明在大脑中表达的NGF遗传信息的最符合百分比是精确地用在121位的AUG。
本发明涉及用表达载体获得人类NGFβ亚单位的方法，这样在调节位点和编码该蛋白的位点间存在天然的距离，在真核细胞系如CHO中用载体，能在培养基中获得人体神经生长因子的成熟型β亚单位(hβ-NGF)，在缺少与多肽融合的1个或多个氨基酸时，与以天然顺序存在的那些不同。这样获得的多肽用在合适的靶细胞上能表现生物活性。
本发明描述的h β-NGF能用于保持或预防神经功能的损失，用于慢性或急性疾病下神经功能的恢复，以及神经退化情况下甚至在急性病理学滞缓状态下的恢复，如脑血管性，传染性，发炎，压迫，代谢缺陷以及在免疫系统调节情况下的恢复。所获的多肽进一步去除会呈现不需要的生物活性的其它人类来源的污染蛋白质。
本发明进一步针对能用于细胞转染的基因构建构，包括那些能体内移植的。有些构建物能够在局部水平产生，特别是作为药物起作用的人类生长因子的活化型，即能够控制此基因。
本发明进一步针对含所述载体的转化细胞系，以及它们的培养以产生h β-NGF。本发明的目的还包括药学制剂，它们含有神经营养性因子的β亚单位和天然神经节苷脂或它的一个衍生物或半合成类似物或其一个盐的一个或多个新复合物作为活性组份。


图1 是人类来源的神经生长因子β亚单位多肽的水疗法图。
图2 是构建pM SGphNGF表达载体的图示。
图3 是pM SGphNGF表达载体的图示。
图4 是构建pSV40M TphNGF表达载体的图示。
图5 是pSV40M TphNGF表达载体的图示。
图6 是构建pSV40phNF表达载体的图示。
图7 是构建pSV40phNGF表达载体的图示。
图8 是构建pSV40h NGF表达载体的图示。
基于这些依据，克隆本发明的人类β-NGF精确地从-121位的甲硫氨酸开始。分析水疗法图，证明在-121和-104位之间的氨基酸可作为前导肽，这表明此蛋白可被分泌。此图在图1中表示，即根据所述方法(Hopp et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78∶3824，1981)制得的人类素源神经生长因子亚单位多肽的水疗法图。位点-121/-104作为前导肽，而位点+1/+118表示人类来源神经生长因子β亚单位多肽的氨基酸顺序(Ullrich et al.，Nature 303∶821，1983)。为获得成熟蛋白，需有一种专一性肽酶，通过它可获得从+1到+118对应于生物活性肽的氨基酸顺序。已证明存在于正常合成NGF细胞中的此肽酶也存在于AT-20细胞中。实际上，通过将包括鼠来源的牛痘病毒前NGF原的一个载体引入这些细胞，它们可以分泌成熟NGF，可以在凝胶上在变性和还原条件下得到14kd的分子(Edwards，R.H，.Mol.Cell.Biol 8∶2456，1988)。
上述的作为获得神经生长因子β亚单位的先前经验的一个功能，本发明发明人用革新的方法比较了可用于真核细胞的一个或多个载体的构建。用PCR技术克隆了前NGF原，采用这一技术制备与各种表达载体相适的位点，这些限制性位点的定位使尽可能维持调节顺序和编码顺序之间的距离与天然相同，这是一种与以前文献中描述的表达β-NGF亚单位的基因构建完全不同的情况。前NGF原的部分与修饰成熟人类NGF(h β-NGF)顺序结合，该顺序是从英国技术有限公司(Oxford，Great Brit ain)获得，其中所造的限制性位点可允许随后的诱变。为了本发明的目的，这些限制性位点的存在不能被认为有局限性，就如基因来源不能被认为有局限性。
基于这一假设，本发明人克隆了不同启动子控制下的前NGF原，这些启动子包括SV40(猴病毒40)，MTTV(鼠乳房肿瘤病毒)，h MTⅠⅠa(人金属硫因ⅠⅠa)。基因顺序引入质粒后再转染CHO细胞，表明即使这些细胞也能在培养基中产生生物活性型的h-NGF多肽。这种前NGF原已被证明在装配分子时是很重要的，它能仅使β亚单位表达，并表明整个基因构建物是正确的。
A.所用的一般方法根据生产厂家的说明书，使用限制性内切酶与DNA链作用。总体上，1μg质粒用在20μl溶液中的1U酶酶切;温度和孵育时间依赖于所用的酶，一般是在37℃1小时。孵育后，质粒和基因片段在琼脂糖凝胶LMP Agarose上(BRL，美国)在40mM tris/HCl，20mM乙酸钠，1mM EDTA中纯化，然后用试剂盒GENECLEANTM(BIO 101 Inc.，La Jolla，CA，USA)从琼脂糖上洗脱。至于在5’端的拷贝反应，在15℃用10U聚合酶(Klenow)处理DNA15分钟。对于连接酶，对20μg反应，T4连接酶使用浓度为每0.5 μg DNA为1U，在13℃反应12小时。
分析确定质粒中正确定的顺序是通过在HB101细胞中转化，并在含有50 μg/ml氨苄青霉素LB(Luria Bertani)培养基的琼脂糖平板上选择转化子进行的。在HB101中的质粒在LB，100 μg/ml氨苄青霉素中生长，并纯化，用试剂盒Quiagen(DIAGENGmbH，Duesseldorf，联邦德国)进行小或大规模制备。用Quiagen方法从细菌细胞制备表达载体。
用以下方法从到期的人胎盘中制备用于PCR反应的DNA。用剪刀剪下0.4cm3的绒膜绒毛，悬浮在700 μl 50mM tris/HCl，pH7.8，100mM EDTA，100mM NaCl，1% SD S中。在此中加入35μl蛋白酶(K 100 μg/ml)，在55℃孵育过夜。然后在13μg/ml RNAase A中加入20 μl溶液，并再孵育2小时。用苯酚抽提二次，用氯仿抽提二次。然后在玻璃毛细管中加入1体积的异丙醇使DNA沉淀。在这点上有些用70%和100%乙醇完成此作用，然后干燥。在缓冲液中溶解(10 mM tris/HCl，pH 7.4，1mM EDTA)DNA，并使之在试管中慢慢振荡。数小时后，溶解的DNA可以进行基因扩增了。通常0.1 μg DNA已足以进行PCR。
转染CHO细胞(CCL61)和使CHO缺少脱氢叶酸还原酶基因(DHFR-)是按照生产厂家GIBCO的方法采用脂质体或用磷酸钙法进行的。
A.2.用脂质体转染细胞生长在含5%胎牛血清的α-MEM中，转染前一天用胰蛋白酶作用，并重新涂板，使它们在第二天时达到70-80%融合。欲转染的质粒DNA稀释到50 μl水含10 μg DNA的浓度，然后加入50 μl LipofectinTm(GIMCO)，所有过程均在一个聚氯乙烯管中进行15分钟后，将此混合物加入预先用OPTI-MEM(GIBCO)培养基洗过的细胞中，细胞这样孵育8小时后，加入含胎牛血清的常规培养基以继续生长。
A.3.用磷酸钙转染的方法以获取稳定转化此方法中转染所用的缓冲液为浓缩2倍的BBS(2×BBS)和0.25M CaCl2。2×BBS如下制备50m M N，N-二-2-羟基乙基-2-氨基乙烷磺酸(Calbiochem);280mM NaCl和1.5mM Na2HPO4溶于水中，将pH调到6.5，然后在0.45μm过滤，而10×CaCl2则制成2.5M CaCl2溶液。
细胞涂在5×105细胞/10cm培养皿/10ml生长培养基中，在35℃孵育过夜。20 μg质粒与0.5 μl 0.25 M CaCl2和0.5ml 2×BBS混合，混合物在室温孵育15分钟。然后将混合物滴入培养基中，整个反应物在3%CO2中35℃孵育过夜。为了获得含我们的载体的稳定转化细胞，通过以10比1的比率在表达h β-NGF的载体中加入pSV2 Neo载体进行共转染。转染二天后，用胰蛋白酶消化细胞，并以比转染小10倍的浓度涂于培养皿上，立即开始用1mg/ml G418新霉素硫酸盐(Gibco)选择稳定的转化子。然后用southern blotting分析转化子的基因构建物的整合作用。
A.4表达所有细胞培养基保持为含15m M Hepes和10%胎牛血清的Ham′sF12/DME H-21，以供表达，每三天更换一次培养基，并换以无血清的新鲜培养基以纯化h β-NGF。
B.较佳实施例B.1构建表达载体的描述制备了三种不同载体，第一种和第二种载体中，调节元素依次为可进行化学诱导的MMTV(鼠乳房肿瘤病毒)和h MTⅠⅠA(人金属硫因ⅠⅠa)。这样能有控制地表达h β-NGF基因。相反，在第三种载体中，h β-NGF是在启动子SV40控制下(猴病毒40)进行克隆的。
B.2在pM SG表达载体中的克隆从Pharmacia(Uppsala，Sweden)获得pM SG载体。根据公司的说明书，欲导入的基因需插在NheⅠ和SalⅠ限制性位点之间的多重克隆位点上。基因从第一个AUG开始转译，这种情况下神经生长因子在MMTVLTR(鼠乳房肿瘤病毒长未端重复)启动子控制下。这种启动子的活性可通过加入糖皮质激素如地塞米松诱导。转录中，通过SV40小T-抗原进行拼接，通过SV40大T-抗原进行多聚腺苷化。此质粒还含有黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(xgpt)的细菌基因，它可用来选择稳定的转化CHO KⅠ细胞。
为了能够在此质粒中克隆前NGF原，使用了PCR技术，就在起始ATG前造一个限制性位点，以尽可能使调节顺序和前NGF原编码顺序的距离象天然一样。合成了二个寡核苷酸第一个在碱基9122和9147之间(Ullrich，A.，Nature 303∶821，1983)，需含下列顺序Met Ser Met Leu Phe5′GCATAGCGTA ATG TCC ATG TTG.TTC T3如上可以看到在起始ATG前的碱基经过突变，因而合成的寡核苷酸具下列顺序Xbai Met Ser Met Leu Phe5′TGT CTAG AGT ATG TCC ATG TTG TTC T3这个寡核苷酸叫作(XbaⅠ)。第二个寡核苷酸含有9521和9342之间的碱基(Ullrich，A.，Nature 303∶821，1983)，与此顺序互补以利于进行PCR，具下列顺序ECORⅠ5′GGCGG AATT CTCGGTGGTGGAC3这个寡核苷酸在其内部含EcoRⅠ位点，以允许前NGF原同成熟NGF连接。此寡核苷酸叫作(EcoRⅠ)。
这二个寡核苷酸在寡核苷酸合成仪上固相合成，用氨基磷酸酯方法，根据330B DNA合成仪的标准步骤(Applied Biosystems，USA)进行。它们是(a)在NH3中55℃处理12小时;(b)在真空离心机中干燥;(c)在2.5M乙酸铵中再悬浮;(d)用三倍体积冷乙醇(-20℃)沉淀;及(e)用80%冷乙醇再次洗涤，在水中重悬浮。用分光光度计测定二个寡核苷酸的浓度。扩增步骤是在Perkin Elmer Cetus DNA Termal Cycler Amplificater上进行，扩增所用试剂为那些相关试剂盒DNATmAMplyfer(PerkiElmer-Cetus)。简略地采用由200 μM每个寡核苷酸，0.5 μM每个dATP，dTTP，dCTP，dGTP寡核苷酸，0.1μg人类DNA和反应缓冲液组成的混合物，总混合物体积为100μl，含有0.5U TAQ聚合酶，全部反应物用石蜡油覆盖以防蒸发。扩增反应通过操作仪器进行，对人类DNA进行35个循环。两种情况下的循环如下94℃ 1分钟，45℃ 2分钟，72℃ 3分钟。300bp的扩增片段在低熔点琼脂糖(Nu Sieve)凝胶上，采用GENECLEANTM试剂盒(BIO 101 Inc.，La Jolla，CA1，USA)溶解琼脂糖进行纯化。用XbaⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶酶切DNA，并如前重新纯化。这样纯化得到的片段克隆进pGEM4载体(Promega)的XbaⅠ和EcoRⅠ位点。所获得的质粒称作pGEM4 Xba-NGF。
此质粒(pGEM4 Xba-NGF)d Hind Ⅲ-EcoRⅠ处酶切，所得300bp片段经纯化后克隆进pUC18BBG26载体(英国生物工程有限公司，牛津，英国)。的Hind Ⅲ-EcoRⅠ位点。pUC18BBG26含盒子构成的(cassette-constructed)的hβ-NGF基因，即在其顺序中，有非天然的人造限制性位点，因此可以替换决定区，即换句话说，它们允许诱变。所获载体称作pUC18hNGFC。此载体用BamHⅠ酶切，延伸部分用Klenow聚合酶在5′端补平。在XbaⅠ位点处酶切，760bp片段通过琼脂糖凝胶纯化。这个片段克隆入pMSG表达载体的NheⅠ和SmaⅠ位点之间。取得这个被叫作pMSGphNGF载体的总体图在图2中表示，而同一个载体的图示在图3。
B.3将NGF克隆在金属硫因控制下制作此载体是因为金属硫因ⅠⅠa(MTⅠⅠa)能被Zn++或Cd++或其它重金属阳离子诱导，因此可以控制它的表达。另外，为了加强此启动子的表达，将SV40增强子加在MTⅠⅠa启动子5′末端，而小T-抗原和SV40的polyA永远用做拼接和多聚腺苷化。首先金属硫因启动子如下同前h β-NGF原连接，用限制性内切酶Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切，从质粒(ph MTⅠⅠA)分离得金属硫因启动子(Karin，H.，Nature 299∶797，1982)，含有启动子的841 bp片段克隆进p GEM4载体的Hind Ⅲ-BamHⅠ位点(Promega Madison，WI，USA)。这个载体叫作pGEM4hMTⅠⅠa。这个启动子的部分带一些天然密码子延伸到3′，它含有第一个密码子AUG甲硫氨酸，紧接此后是BamHⅠ限制性位点。通过用h MTⅠⅠa的启动子的起始甲硫氨酸而使前h β-NGF原在此启动子下克隆，在碱基9133和9160之间构建了一个寡核苷酸(Ullrich，A.，Nature 303∶821，1983)，紧接在起始AUG后造一个BamHⅠ位点，它可把基因带入其中。合成的寡核苷酸具有下列顺序Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ⅰle5′TG TCC ATG TTG TTC TAC ACT CTG ATC AC3突变后变成下列顺序
BamHⅠ5′TGG ATCC ATTGTTCTACACTCTGATCAC3这个寡核苷酸叫作BamHⅠ。改变的碱基也包括氨基酸顺序的改变，实际上第二个和第三个氨基酸发生改变，依次从Asp变为Ser及Pro变为Met。但是，这个改变对水疗法图并没多大影响，分子如平常一样分泌。
这个寡核苷酸与EcoRⅠ寡核苷酸一起用来如上所述扩增前NGF原。纯化的片段在BamHⅠ和EcoRⅠ处酶切，然后克隆进pGEM4hMTⅠⅠa载体的BamHⅠ和EcoRⅠ限制性位点之间。这个载体叫作p Gh M TphNGF。
为获取SV40增强子(激活子)，后者如下所述从pMSGphNGF获得pMSGphNGF载体在BamHⅠ处酶切，然后延伸部分用Klenow聚合酶在5′补平。然后用Hind Ⅲ酶切，500 bp的片段克隆进p GEM3的NacⅠ和Hind Ⅲ限制性位点之间。所获得的载体叫作pGSV40。
为获得表达载体，将上述片段如下所述加入三部分片段的联合体中用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性内切酶酶切pM SGphNGF载体，纯化1500 bp片段。用Hind Ⅲ-EcoRⅠ酶酶切pGh HTphNGF载体，纯化1100 bp的片段。这二个片段一起克隆进p GSV40载体Hind Ⅲ和BamHⅠ限制性位点之间。获取这个被叫作pSV40M TphNGF的表达载体的总图在图4中表示，而同一个载体的图示在图5中。
这个载体，p SV40M TphNGF，与p SV2neo质粒一起作为双重转染稳定地导入CHO KⅠ细胞中。并如前所述用新霉素G418(GIBCO，BRL)1mg/ml选择。这个质粒与phMT质粒共转染，以选择含高拷贝数的菌落。在此情况下，CHO KⅠ细胞在50 mM硫酸锌中暴露24小时，以诱导合成金属硫因，用浓度从2.5 μM开始到20 μM的氯化镉选择。含有h NGF高拷贝数的细胞被用来表达分子。
B.4将NGF克隆在SV40的启动子强化因子下pGEM4 XbaNF质粒用Hind Ⅲ和EcoRⅠ限制性内切酶酶切，300 bp的片段被替换入pSV40MTphNGF载体Hind Ⅲ和EcoRⅠ限制性位点之间。获得这个被叫作pSV40phNGF载体的总体图在图6中表示，而同一个载体的图示在图7中表示。
这是一个标准的构成载体，其中调控顺序为SV40启动子/强化因子。这个载体与pSV2neo质粒能稳定地共转染CHO KⅠ细胞，并分析了生产神经生长因子β多肽的克隆。
在CHO KⅠ dhfr细胞中的选择为在CHO KⅠ dhfr中获得以上载体的基因扩增，此载体随后通过将DHFR+基因克隆在h NGF基因的上游而加以修饰。编码DHFR+的pSV2dhfr载体在Hind Ⅲ处酶切，延伸部分在5′用聚合酶补平。然后在BamHⅠ处酶切，1800 bp的片段克隆进pSV40h NGF载体的如前所述用聚合酶使之变成平端的XhoⅠ和BamHⅠ限制性位点之间，这样得到了pSV40NGF表达-选择质粒。获取此载体的总体图在图8中表示。
这个质粒在无核苷酸，有10%胎牛血清的α-MEM培养基中如平常一样转染CHO KⅠ细胞。二天后，细胞用胰蛋白酶消化，然后使之浓度变为先前的1/10，用10μM MTX(氨甲喋呤)到500 μM MTX进行扩增。在最高浓度MTX中存活的细胞被用来表达h NGF。
生物活性的测定如上所述插入三个中的一个载体，趋于稳定后，测定CHO细胞系培养基的生物活性的体外研究，在嗜铬瘤胎细胞PC-12中进行。(Greene L.A.et al.，Rev，Neurosci.3∶353，1982)。反应的专一性通过使用培养未转化的CHO细胞系的培养基，或通过用对鼠来源或牛来源的NGF有专一性的多克隆抗体阻遏培养基中的h β-NGF活性来检测。用如前所述的单个载体转化和稳定的三种细胞系可产生生物活性型的人体NGF β亚单位。
药物组合物可根据已知方法将本发明的h β-NGF进行配制生产药学上有用的组合物。含从重组DNA衍生的人类β-NGF分子(β亚单位)的药物组合物的配剂，在此没有及可能有神经节苷脂和磷脂，包括药学观点上可行的已知的制备组合物的方法，能给病人服用，有效量的hNGF分子可以同药学上可行的赋形剂一起组成混合物。合适的载体及它们含其它蛋白的制剂，在如“Remington′s Pharmaceu-tical Sciences”中描述(Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，USA，1985)。这些载体包括可注射的“沉淀制剂”。
在上述基础上，药物制剂包含，虽然不是唯一地，神经生长因子溶液或它的冰冻干粉，与药学上可行的一个或多个赋形剂或稀释剂一起，并且置于调到合适pH的缓冲介质中，此介质与生理溶液是等渗的。在制备冻干制剂时，可用支持赋形剂，例如，但不是唯一的甘露糖醇或大豆球蛋白，还有所需体积的合适缓冲液，以获得具有所需的pH的合适等渗缓冲液。相似的溶液可用作药物溶液，用于从重组DNA得到的神经生长因子分子的药物组合物，该药物组合物是在所需体积的等渗溶液中，以及包括，但不是唯一的，用合适浓度的磷酸盐或柠檬酸盐制得的生理缓冲液，每次获得具所需pH，如中性，pH的等渗药物制剂。
药物制剂进一步包括，但不局限于它们，用冻干赋形剂作为直肠给药的栓剂，如水溶性，自身乳化甘油明胶型或其它。在这些制剂中，从重组DNA获取的神经生长因子可以从0.01%到1%的整个赋形剂重量的量存在。栓剂可以包含，但不局限于，合适量的乙酰水杨酸盐。
这些药物制剂可以口服，直肠，非肠道，局部使用，吸入大脑内使用。因此，它们可以是固体或半固体形式，如糖衣丸，丸药，胶状盖，胶囊剂，栓剂，软明胶胶囊。非肠道和大脑内使用时，可用用于肌内，皮下给药的形式，或适于静脉内或大脑内输注或注射的形式，因而，可以是活性化合物溶液和活性化合物冻干粉末与药学上可行的一个或多个受体或稀释剂混在一起，适于上述方法的使用，并且具有与生理液体相适的渗透性。局部使用时，乳膏或软膏制剂可供表面使用;用作吸入剂时，可为喷雾型制剂，如可考虑鼻内喷雾。
本发明制剂可用于人类或动物。对溶液，喷雾剂，软膏和乳膏，它们最好含0.01%到10%的活性化合物，对于固体型制剂，最好含5%到50%活性化合物。给药剂量依赖于指征、所需的效果及选用的给药形式。
本发明还包括所有神经节苷脂或含神经生长因子NGF β亚单位衍生物的新复合物用于以上提到指征的治疗用途。注射(皮下或肌内或大脑内)用于人体每天剂量为每千克体重0.05毫克到5毫克活性材料。
以上对发现进行了描述，很明显这些方法可在不同方面加以修饰。这些修饰不能被认为是偏离本发明的宗旨和范围的，所有对本技术领域普通技术人员明显的修饰都将包含在下列权项范围中。
权利要求
1.一种为人类β-TGF编码的能复制的表达载体，可以在用此载体转化的合适哺乳细胞内表达，其特征在于该载体包含(a)一种为人类β-NGF编码的第一DNA顺序；(b)为人类前β-NGF原编码的第二DNA顺序，该顺序与所述的第一DNA顺序的5′端融合；及(c)一种启动子-增强子调节元素，直接与所述第二DNA顺序5′端融合。
2.根据权利要求1所述的可复制的表达载体，其特征在于所述调节元素是鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)启动子。
3.根据权利要求1所述的可复制的表达载体，其特征在于所述调节元素是人类金属硫因ⅠⅠa(hMTⅠⅠa)启动子。
4.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述调节元素是SV40的启动子。
5.一种重组宿主细胞，其特征在于它是用权利要求1-4的任何一种表达载体转化。
6.根据权利要求4的一种重组宿主细胞，其特征在于它是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
7.制备编码人体β-NGF的表达载体的方法，其特征在于它包含(a)制备具一个EcoRⅠ限制性位点的第一300bp DNA片段，以使其与前NGF原连接;(b)将所述第一300 bp DNA片段克隆进含为人类β-NGF编码的基因的第一质粒的Hind Ⅲ和ECoRⅠ限制性位点间，以产生第二质粒;(c)在所述第二质粒的BamHⅠ和XbaⅠ位点处酶切，以产生760bp片段;(d)将所述760bp片段克隆进含有用于人类β-NGF基因的启动子的质粒中，以产生第三质粒;(e)酶切所述第三质粒以分离含NGF基因的片段，该片段含有所述启动子和所述人类β-NGF基因;(f)将所述含NGF基因的片段和前β-NGF原DNA顺序克隆进一个质粒以产生一种质粒，该质粒含前β-NGF原DNA顺序邻接的所述启动子，前β-NGF原DNA顺序又与所述人β-NGF基因邻接。
8.制备为人β-NGF编码的表达载体的方法，其特征在于它包括(a)制备具下列顺序的XbaⅠ寡核苷酸;5′TGT CTAG AGAT ATG TCC ATG TTG TTC T3′(b)制备具下列顺序的EcoRⅠ寡核苷酸5′GGCGG AATT CTCGGTGGTGGAC3′(c)将所述XabⅠ和EcoRⅠ寡核苷酸克隆进p GEM4载体的XabⅠ和EcoRⅠ限制性位点，以产生p GEM4 Xba-NGF质粒;(d)在Hind Ⅲ和EcoRⅠ位酶切所述pGEM4 Xba-NGF质粒以产生第一300bp片段;(e)将所述第一300 bp片段克隆进p UC18BBG26质粒的Hind Ⅲ-EcoRⅠ位点以产生p UC18h NGFc;(f)在BamHⅠ和XbaⅠ处酶切所述pUC18h NGFc以产生一个760bp片段;(g)将所述760bp片段克隆进p MSG载体的NheⅠ和SmaⅠ位点，以产生pM SGph NGF质粒;(b)通过用Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切p BR322，分离含金属硫因Ⅱa(MTⅠⅠa)启动子片段;(i)将所述含MTⅠⅠa启动子片段克隆进p GEM4载体的Hind Ⅲ和BamHⅠ位点，以产生pGEM4hMTⅠⅠa载体;(j)用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切前NGF原DNA顺序，将所得片段克隆进pGEM4hMTⅠⅠa片段的BamHⅠ和EcoRⅠ限制性位点以产生pGh MTphNGF;(k)用BamHⅠ酶切pM SGphNGF，用Klenow聚合酶在5′延伸处补平，用Hind Ⅲ酶切，并将所得500bp片段克隆进pGEM3的NaeⅠ和HindⅢ位点，以产生pGSV40;及(l)用Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切pGh MTphNGF以产生第一片段，用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切pM SGphNGF以产生第二片段，将所述第一和第二片段克隆进pGSV40的Hind Ⅲ和BamHⅠ位点，以产生pSV40MTphNGF。
9.一种方法，其特征在于它包括在用权利要求1-5中任何一个载体转化的重组细胞中进行表达，并且获取这样产生的人类β-NGF。
10.一种方法，其特征在于根据权利要求6的重组宿主细胞的表达，并获取这样产生的人β-NGF。
11.根据权利要求9的方法产生的人类β-NGF多肽。
12.根据权利要求10的方法产生的人类β-NGF多肽。
13.一种药物组合物，其特征在于它包括根据权利要求11的多肽，没有其它人类来源的蛋白污染，并与药学上可行的载体或稀释剂一起。
14.一种药物组合物，其特征在于它包括根据权利要求12的多肽，没有其它人类来源的蛋白污染，并与药学上可行的载体或稀释剂一起。
全文摘要
本发明涉及从转化细胞获取叫作神经生长因子(β-NGF)的多肽，更特定地，涉及通过重组DNA技术使用可插入合适的真核细胞系的基因构建物，获取具生物活性的人类成熟型(β亚单位)的方法。
文档编号A61K38/00GK1051934SQ9010929
公开日1991年6月5日 申请日期1990年11月16日 优先权日1989年11月16日
发明者弗朗切斯科·德拉·瓦莱, 兰弗兰科·卡列加罗, 亚历山德罗·内格罗 申请人:菲迪安股份公司