细胞增生和伤口愈合的调节的制作方法

专利名称：细胞增生和伤口愈合的调节的制作方法
说明发明领域本发明涉及方法和组合物，其特征在于聚合物植入物与细胞增生调节剂相关。本发明提供了在紧邻植入物的部位调节细胞增生和/或伤口愈合并抑制细胞粘结到植入物自身上。背景有机体内细胞的不适当增生会引起各种病状。具体的症状随增生细胞的类型和增生细胞的位置而有所变化。这些病状为当细胞是癌细胞时表现为恶性肿瘤，当细胞是正常的成纤维细胞时表现为疤痕，或当增生细胞为形成部分包膜或皮肤的上皮或皮肤细胞时，表现为皮肤病。
眼睛各组织的细胞增生会导致视力损伤。与晶状体囊相连的晶状体上皮细胞的增生使视力减弱，接着是白内障手术，就是一个这样的例子。具体地说，除去白内障的囊外白内障摘除术经常伴随着不期望的晶状体上皮细胞增生，这引起后晶状体囊浑浊。实际上，做过囊外白内障摘除术的所有小儿患者和大约50％成人患者，在手术后3到5年内会产生不透明的继发性白内障。
据报导，已有多种抑制继发性白内障形成或防止后晶状体囊浑浊的细胞毒剂。例如将细胞毒剂，如5-氟代尿嘧啶、氨甲蝶呤、秋水仙素和柔毛霉素，滴入眼房前部来杀死残余的晶状体上皮细胞，以防止后晶状体囊浑浊。这些药物已被输入眼内，例如用注射方法或借助于能使药物在眼内扩散的各种药物输送技术。
青光眼手术后细胞增生导致视力损伤是第二个例子。青光眼包括多种眼病，其特征有三个典型症状眼内压(IOP)升高，视神经损伤和进行性视野缩小。IOP的升高是由于水状液流出减少造成的，水状液是眼睛前部的流体，负责维持整个眼压的平衡。目前，青光眼的药物疗法是使用一种或多种眼药，这些眼药包括β-阻滞剂(如噻吗心安)、缩瞳药(如毛果芸香碱)、肾上腺素能的激动剂(如肾上腺素)和碳酸酐酶抑制剂(如乙酰唑磺胺)。尽管大多数青光眼患者用药物治疗一开始会有效，但长时间后多数变得难治。如果这些人想维持正常的IOP，就得需要外科手术。
外科矫正青光眼的技术包括各种类型的青光眼滤除术(GFS)，矫正时为了降低IOP，需造一引流管使水状液从前房流出。最成功的GFS是利用形成过滤大疱或引流瘘管，来升高手术处的结膜以降低IOP。可以采用多种技术保持大疱或瘘管开放，包括使用生物相容的塑料管或阀，然而引流管的疤痕经常会导致大疱或引流瘘管的阻塞，导致IOP随之升高。最近的临床研究证实，导入能抑制伤口愈合过程的药剂在某些场合可提高GFS的成功率。这些药剂的给药一般无特定的方法，如在手术过程中用海绵涂在引流过滤组织体上，或在手术后对结膜进行多次、伴有痛感的注射。
据报导，既可防止继发性白内障又可抑制GFS的药物输送技术，或多或少取决于所采用的药物向目标细胞处的扩散。但是，不断流过眼房前部的水状流体会改变目标细胞处药物的有效浓度。所以，由于调节剂对目标细胞以外的细胞的固有活性，这些输送技术会产生不期望的副作用，又由于缺少对目标部位的专门定位，从而导致到达目标细胞处的药物有效剂量较低。例如，非特定的输送有效的抗增生剂，如丝裂霉素C和5-氟代尿嘧啶，经常会使伤口愈合不完全，水状液泄漏，和压力过低或非常低的压力，这会导致进一步的并发症。
因此，人们会对手术步骤的治疗规范和成功的结果取决于对细胞增生调节感兴趣，例如抑制白内障手术后晶状体上皮细胞和青光眼滤除术后成纤维细胞的生长，从而在某一场合以某种特定方式确定输送能调节细胞增生和伤口愈合的药剂的方法和组合物。相关文献1989年，《白内障屈光外科学杂志》(J.Cataract Refract.Surg.)第5卷第169页，Heyrman等人描述了通过聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和多种水凝胶眼内晶状体研究药物的吸收和释放。欧洲专利申请0 443 809 A2描述了一种包覆有亲水材料，且含有药理作用活性剂的眼内晶状体(IOL)。美国专利4,918,165描述了共价连接到IOL上的抗体-细胞毒素共轭物。美国专利4,170,043描述了一种包覆有生物相容性的水溶性膜的IOL。美国专利4,240,163描述了一种包覆有药物的IOL。
Wong的美国专利4,853,224公开了用于眼睛的生物可降解微胶囊。1991年《眼科学》(Ophthalmology)第98卷第4期第503页公开了Charles等人的一种包含丝裂霉素含水混合物的生物可侵蚀的聚合物盘。1988年Lee等人的美国专利4,863,457、《眼科学研究和视觉科学》(Invest.Opth.& Visual Science)第29卷第11期第1692页和1987年Lee等人《眼科学》(Ophthalmology)第94卷第1523页描述了一种生物可降解的用来输送治疗试剂的眼植入物。1986年Kay等人《眼外科学》(Ophthalmic Surgery)第17卷第12期第796页描述了一种用于眼睛的含有5-氟代尿嘧啶的胶原海绵体。1993年《白内障屈光外科学杂志》(J.Cataract Refract.Surg.)第19卷第462页，Legler等人描述了一种有扩散限定膜并含秋水仙素的囊剂。还可参见Hartmann的1990年《眼科学》(Ophthalmologie)第四卷第102页。
下述参考文献也与本发明有关1993年Xu等人《眼外科学》(Ophthal.Surgery)第24卷第6期第382～388页；1989年，Tahery和Lee《眼药理学杂志》(J.of Ocular.Pharm.)第5卷第2期第155～179页；1991年Palmer《眼科学》(Ophthalmology)第98卷第317～321页；1976年版，K.Mosbach的《酶学方法，第24卷，固定化酶》(Methods in Enzymology，Vol.24 Immobilized Enzymes)；1991年S.Wong的《蛋白质共轭和交联化学CRC》(Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking CRC)；1990年G.Pietersz的《生物偶合化学公报》(G.Bioconjugate Chem.)第1卷第89页；1994年W.J.Power等人的《白内障屈光外科学杂志》(J.Cat.Refract.Surg.)第19卷第440页；1988年M.Weller等人的《国际眼科学》(International Ophthalmology)第12卷第127页；M.Bruce Shields的《青光眼讲义》(Textbook of Glaucoma)(1992年第三版)第34和36章；和1981年版，H.Alkock和F.W.Lampe的《当代聚合物化学》(ContemporaryPolymer Chemistry)。
以下是综述性文章1992年Maeda等人的《生物偶合化学》(Bioconj.Chem.)第3卷第351～362页；1995年Takakura和Hasida的《肿瘤血液学评论》(Crit.Rev.Oncol.Hematol.)第18卷第207～231页。
发明概述本发明提供了用于调节目标细胞增生的方法和组合物，例如调节眼中的细胞。该组合物是一与细胞生长调节剂相结合的聚合物植入物。该结合可以是共价不稳定的键或非共价可逆结合。一旦调节剂从聚合物上释放出来，就基本上保持在一特定的组织区内，因此主要影响特定区的目标细胞。本发明还提供了一种眼内装置及其制备方法，该装置包括一种与调节剂相结合的生物惰性聚合物。该方法和组合物可用在例如防止继发白内障、提高青光眼滤除术的成功率、在用抗增生剂作为细胞增生调节剂调节移行入植入区细胞的生长时，提高组织植入物的生物相容性。
附图简述

图1为本发明一个实施方案的示意图，其中所研究的组织与一植入物相接触，该植入物是由聚合物和细胞增生调节剂组成。在此实施方案中，柔毛霉素(15)与加工成环状的聚合物尼龙(10)结合后制成柔毛霉素涂覆环(5)。白内障手术后，将柔毛霉素涂覆环(5)插入晶状体(35)的晶状体囊(30)内，因此使得药物与位于囊(30)内表面的晶状体上皮细胞(25)紧密相邻。
图2为本发明另一个实施方案的示意图，其中细胞增生调节剂柔毛霉素(15)与一尼龙膜(100)相结合，制成一植入物形式(105)。在滤过术造成的瘘管(120)处，尼龙一柔毛霉素植入物(105)与结膜(115)后部的组织相接触。在紧邻增生的成纤维细胞处植入细胞毒剂，增生的成纤维细胞若不治疗，则会使手术所造成的引流管(120)产生疤痕。
具体实施方案的描述本发明提供了调节所研究的组织细胞增生和伤口愈合的方法和组合物。在该方法中，所研究的组织与一种组合物相接触，该组合物包括一种细胞增生调节剂和/或伤口愈合剂以及生物惰性聚合物植入物。所选定的调节剂可逆地与聚合物植入物相结合，从而使聚合物植入物在组织植入装置之后可定位地输送药剂。″聚合物植入物″是指一种以适用于通过手术或其它方法放入体内的物理形式存在的聚合物。聚合物植入物的实际物理形状由预定的用途而定。聚合物植入物可通过将植入物浸入调节剂溶液来制备，由此药剂经疏水/亲水作用和/或化学键被吸附到聚合物上。使用时，将聚合物植入物和所结合的药剂在手术中或手术后放入组织内。在进行GFS时，植入物要放在结膜下空间巩膜造口术位置(如果是部分厚度)的上部。为防止继发性白内障，将植入物插入晶状体囊内。调节剂不断地由植入物聚合物以某一足以调节紧邻植入物目标细胞的细胞增生和/或伤口愈合的浓度和速率释放出来，故对植入区以外的细胞极少有或不产生影响。目标细胞包括继发性白内障的晶状体上皮细胞，GFS或任何其它要减少疤痕场合的成纤维细胞和白血球。
所调节的定域范围取决于聚合物的释放特点和调节剂的浓度，采用本发明所描述的实验技术可以容易地优化定域范围。例如，用于防止继发性白内障时，将植入物驻存于剩余的晶状体囊内，使调节剂基本上处于中纬线区。当进行正常愈合过程中，细胞在植入物周围、细胞附着在植入物上和/或细胞嵌入植入物内时，定位就变得更加方便了。一般定域在植入物10毫米范围内，更优选7毫米，最优选5毫米或更少。植入物的调节作用最大地施加于任何与植入物实际接触的细胞。GFS尤其需要这种接触抑制。
本发明的组合物和方法比目前所用的调节细胞增生和/或伤口愈合的方法具有几种优点。例如由于调节剂结合在聚合物植入物上，所以调节剂始终位于伤口处，使此处的调节剂浓度高，并减少或消除了向其它区域的扩散或全身输送。即使抗增生剂存在某些向其它区域的扩散，其浓度一般也不足以影响那些区域的细胞。相反，目前所用的使用抗增生剂而不定位的方法则会导致并发症，如不易控制增生和/或愈合、伤口泄漏以及对植入区以外细胞产生副作用。本发明的其它优点包括可控制调节剂的剂量，防止调节剂对所研究组织的主要细胞产生不期望的影响，因为药物定位于组织某处，可抑制它向其它敏感细胞区，特别是正常细胞区的迁移，故而隔离了可侵入细胞区的生长调节剂。因为药物的定位由植入物来完成，所以没有必要对每个所研究的组织分别制备制剂。当使用恰当时，所得作用范围将是从完全消除不期望细胞类型到抑制植入区细胞的增生，或用于刺激生长，例如刺激愈合不良的伤口生长，如糖尿病人或烧伤患者的伤口。
组合物包括一种生物相容的聚合物植入物，该植入物与调节剂相结合。″调节剂″是指能改变细胞生长或发育的任何化合物，既包括细胞增生调节剂，也包括影响伤口愈合的试剂。实例包括抗代谢物和能杀死细胞的细胞毒素，进一步抑制细胞生长或增生的抗有丝分裂剂；刺激细胞分裂、歧化的生长因子等，或改变伤口愈合过程的化合物，例如有选择地抑制或刺激一群与伤口愈合相关的细胞，如成纤维细胞。
当预定应用是抑制细胞增生和/或防止伤口愈合时，具体的增生调节剂包括柔毛霉素、柔毛红霉素、阿霉素、丝裂霉素C、5-氟代尿嘧啶、胞嘧啶、阿拉伯糖苷、秋水仙素、细胞松弛素B、争光霉素、长春新碱、长春花碱、氨甲蝶蛉等。衍生于微生物或植物源的毒剂也在研究中。实例包括天然存在的毒素，如蓖麻毒蛋白、红豆因和白喉毒素等。当所期望的结果是促进细胞增生或伤口愈合时，增生调节剂则可以是生长促进剂，如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转移生长因子β和由血小板衍生的生长因子等。
聚合物是生物惰性的，并与例如眼组织在生理上相容。也希望聚合物本身不会诱发炎症反应。还优选聚合物能可逆地与一足够量的选定调节剂相结合，并能以适当的方式释放该试剂，以达到所预期目标，例如抑制伤口愈合。聚合物的优选特点包括能可逆地与细胞毒剂相互作用，由此缓慢地将细胞毒剂释放入眼内。聚合物能共价或非共价地吸收细胞毒剂。结合的实例包括通过静电荷结合、疏水或亲水相互作用结合或共价结合。
许多具备所要求特点的分子可用来制备一般类型的聚合物，如可用聚酰胺、多肽、聚酯、聚碳酸酯、聚氨酯、聚缩醛、多糖和聚烯烃来制备聚合物植入物。这类聚合物的具体实例包括，但不局限于，硅氧橡胶、聚氨酯橡胶、聚乙烯、聚氯乙烯、聚异丁烯酸羟乙酯、聚异丁烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、聚乙醇酸、纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、葡聚糖、羧甲基纤维素、透明质酸、尼龙和胶原。另外，植入物还可以是一种聚合物和/或其盐和/或同系物、类似物、衍生物、配合物、片段以及上述物质的共聚物、复合材料或共混物。
特别关心的是生物惰性聚合物植入物，调节剂可以与之共价或非共价地结合，植入物插入后，它所释放出的调节剂量足以提供调节细胞增生所需要的量。一定量的足以抑制细胞增生和/或伤口愈合的柔毛霉素被吸附到尼龙聚合物植入物上，就是这样的一个实例。细胞调节剂所结合的尼龙聚合物的形式可以是膜，或者聚合物可以是粉状，可用不同的技术，即压模，将其制成囊剂或其它的植入物形式。可使用不同的填无剂/粘合剂和包覆剂。粘合剂必须能溶解在水溶液中以使粒子分散。在组织内它会比完整的植入物产生更为不定形的分布。许多其它适宜聚合物的生物性质在本领域中是已知的。调节剂与聚合物可逆结合的能力可由本领域中的技术人员容易地测得，对于不具备所期望生物性质的聚合物，可用本领域中技术人员已知的方法测定。
要求调节剂可逆地或通过一不稳定键结合在聚合物植入物上，以使其只在与植入物相接触的区域进行定域扩散，由此增加了调节剂的局部浓度，同时减少了对植入区以外细胞的副作用和频繁的给药。生长调节剂从聚合物上释放的速率随特定的用途而变。一般而言，在开始的24小时，速率为所释放初始量的约25～50％，随后为每24小时5～10％。
聚合物植入物可用多种方法制备。例如，可以把植入物浸入调节剂溶液，由此调节剂与聚合物可逆地结合，使调节剂结合到植入物上。调节剂也可用本领域中技术人员已知的其它包覆技术可逆地结合到植入物上，如对植入物进行喷雾或使调节剂在植入物旁流动。特别关心的有两个体系。第一个体系是把细胞毒剂(柔毛霉素、阿霉素等)吸收到聚合物即尼龙上。在水溶液中柔毛霉素就会缓慢地从尼龙上释放出来。第二个体系是在存在于聚合物和调节剂上的反应基团之间形成共价键。这样一类键的实例有阿霉素和柔毛霉素的C13羰基的亚胺衍生物，如腙和半卡巴腙。这些类型的键已被Yamamoto等人描述于1972年的《医药化学杂志》(J.Medicinal Chem.)第15卷872～875页中，和被Morrison和Boyd描述于位于波士顿的Allyn and Baeen，Inc.，1966年出版的《有机化学》(OrganicChemistry)第二版第640页中。
为把抗增生剂共价偶合到聚合物上，聚合物上要有反应位置，如-OH、-COOH、-SH或-NH2，或用本领域技术人员已知的方法将其导入到聚合物上。例如，参见Mosbach的《酶学方法》(Methods ofEnzymology)和Wong的《蛋白质的共轭和交联化学》(Chemistry of ProteinConjugation and Crosslinking)。特别关心的是不稳定的共价键，即共价键可以酶促断裂或在酸性或还原条件下断裂。本领域的技术人员已经知道许多将药物偶合到上述反应位置的方法。例如，参见Pietersz 1990年《生物偶合化学》(Bioconjugate Chemistry)第1期89页。例如，聚合物为尼龙时，可用3M HCl控制水解将官能团羧基和氨基导入。羧基可用1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)激活，使之与己二酸二酰肼反应生成酰肼取代尼龙。
经改性的尼龙也可由Morris等人在1975年《生物化学杂志》(Biochem.J.)第147卷593页中所描述的、通过对聚合物用三乙基氧鎓四氟硼酸盐进行初始O-烷基化的方法制备。然后在无水条件下，将所得的尼龙亚氨盐与二酰肼如己二酸二酰肼反应生成酰肼取代尼龙。
当聚合物为例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)时，羧基可用氧等离子体放电导入，然后用丙烯酸处理，生成具有可用羧基的PMMA。例如参见1993年Inn-Kyu Kang等人的论文。用EDC激活羧基并使之与己二酸二酰肼反应生成酰肼取代PMMA。
当聚合物为多糖如羧甲基纤维素、透明质酸、肝素等，或为天然具有可用羧基的蛋白质时，羧基可以直接用EDC和己二酸二酰肼或肼以类似的方法派生，分别生成酰肼取代多糖或酰肼取代蛋白质。例如参见Herwitz等人1980年《应用生物化学杂志》(J.Applied Biochem.)第2卷第25-？页；Pouyani和Piestwich 1994年《杂志？》(Journal？)第5卷第339-347页；Larson等人1989年《生物材料》(Biomaterials)第10卷第511-516页。
植入物的生物相容性可通过例如结合PEG来增强。人们已熟知制备活化的PEG的方法。例如参见1992年Bergstrom等人《生物医学材料研究杂志》(J.Biomed.Mat.Research)第26卷第779-790页。制备带有能与这些活化的PEG分子反应的官能团的聚合物的方法已为人们熟知。已经公开了用PEG改进的植入物材料生物相容的实例。这种改进也允许用在不适于制备植入物的聚合物上，但所制成的植入物无生物相容性或生物相容性差。其它改进植入物生物相容的方法包括使用肝素(例如参见1995年Behar-Cohen等人《眼科学视觉科学研究》(Investigative OphthalmologyVisual Science)第36卷第5802页，其公开了肝素包覆的IOLs)。
聚合物植入物可用多种形式提供。聚合物可以浇铸、制模或加工成适用于特定用途的任何形式。它可以是独立的装置，如IOL，或者植入物可以是能与另一装置结合使用的形式。例如用于防止继发性白内障，植入物可以是基本上为圆环形(″O″)或能装入晶状体囊连同IOL的环。O形环或环的直径约等于晶状体的直径，以使之在放入眼内后，可沿囊的内缘转动。当此装置就位后，插入IOL。另一方面，对GFS而言，植入物可以为薄膜或海绵的形式。当需要在植入区减少疤痕时，还可以用薄聚合物膜包覆聚合物植入物或其它植入物。
可用任何方法制成所需要的无菌植入物，例如用高压釜(蒸气)灭菌法、辐射法、氧化乙烯气法等。随后无菌地将其浸入细胞增生调节剂的无菌液中使二者结合。结合后，用水漂洗除去未结合的试剂，干燥后包装。另一方面，尼龙粉(颗粒)也可用上述方法灭菌，加入到例如柔毛霉素溶液中，用水漂洗除去未结合的试剂，并干燥。随后将结合了柔毛霉素的聚合物与适当的制剂粘合剂(如羟丙基甲基纤维素(HPMC)、蔗糖等)混合，制成片剂、囊剂等。当植入组织后，粘合剂溶解，脱离包埋在组织中的尼龙柔毛霉素颗粒。药物缓慢地从颗粒中释放出来。
聚合物对调节剂的担载量，一部分取决于植入物的表面积，当为共价键时，一部分取决于可用的反应基团数。所以优选具有最大表面积的植入物，例如多孔的或网状的植入物。植入物还可形成提供细胞侵入的自然门，例如凸缘、脊或格栅，被设计用来提高目标细胞和植入物的自然接触。例如在GFS中，植入物可以是一种可以植入瘘管内的膜。膜植入物通常设计成让来自过滤处的水状流体自由通过，一般大小为能覆盖巩膜的手术处。典型的膜植入物的直径约为1厘米，厚度为1～5毫米。膜可以直接放在巩膜手术处的上面或结膜下，因此有助于支持GFS过程中所造的瘘管大疱。在局部厚度手术中，也可以将植入物切割成形，放在巩膜床内。
使用时，将聚合物植入物和所结合的试剂在手术中或手术后导入组织内。例如在GFS中，将聚合物植入物按照如下方法置于手术处。从前端小心地将结膜切开到边缘。切除上覆巩膜上的多余的凸榫(tenons)组织。造一边套，并向前延伸入角膜基质。在进入前房以前，对过滤处外周边清晰的角膜施行穿刺术。然后通过过滤处进入前房，切除一小块(1×3毫米)巩膜组织和有小梁的网络。为了止血，烧灼巩膜切除术的边缘。然后施行周边虹膜切除术。结束前，将柱状聚合物插入巩膜造口术处。
插入植入物后，细胞增生调节剂或伤口愈合剂不断地从植入物聚合物上以某一浓度释放出来，其持续时间足以调节植入物毗邻区的细胞增生或伤口愈合。植入物可以缓慢、稳定地释放调节剂，以便使试剂基本上能保持在植入区内。另一方面，植入物可以表现出多相释放，其中在一开始聚合物进行短期的“剧烈”释放后，便维持低浓度释放。这样一种释放分布还有利地减少了输送到非目标区的调节剂量，同时有利地使定域区内的目标细胞暴露在快速引发所需的调节的初始释放量中，结合在载体上的担载量取决于载体的表面积和细胞调节液的浓度以及时间。当使用高浓度时，较大量结合得弱的药物会剧烈释放出来。该量可以改变，并且可由使用前洗涤植入物的程度来调节释放量。植入物也可以便利地保持所需调节剂的足够浓度，以便能有效地对任何与植入物自然接触的目标细胞施加接触调节，放入植入物后，至少要调节几天。
所以在对目标细胞的影响实现以前，生长调节剂的浓度和释放速率都会影响所花的时间。一般而言，与植入物聚合物相结合的细胞调节剂对细胞增生的作用是在目标细胞与细胞调节剂接触后的24～48小时之内实现的，这取决于所用试剂的浓度。期望该作用能延长到3～5天或更长，这取决于聚合物的释放特征和调节剂的效力。
与细胞调节剂相结合的植入物对其预定用途的有效性可用多种方法测定。可以用许多类型的细胞来检验该配合物，优选采用与所研究组织中细胞类型相似的细胞。例如当植入物的预定用途是用在人眼组织中时，优选使用从手术标本获得的人巩膜成纤维细胞或使用新鲜的眼库组织。当预定用途是用在牲畜眼组织中时，优选从拟受体宿主种类所获得的细胞。例如当所期望的结果是抑制细胞增生，特别是移行入眼伤的细胞增生时，可用把哺乳动物细胞加到含有聚合物植入物的培养槽中，在体外进行细胞培养测定来检测植入物。也可采用治疗时拟用条件下的体内模型，如在治疗青光眼或继发性白内障形成时。例如在体外测定偶合作用抑制能力或刺激细胞增生能力的体外测定。另一方面，可通过功能测定如试验试剂对蛋白质合成的影响来评价生长。例如刺激胶原形成可在体外向胶原酶敏感蛋白质中加入1-[2，3-3H]-脯氨酸来监测(参见Peterkofsky和B.等人1982年《胞外基质免疫化学》(Immunochemistryof the Extracelluar Matrix)第II卷，Furthmayr编，H.CRC Boca Raton，FL第19～42页)。
在聚合物植入物的一个具体应用中，所研究的组织为眼巩膜和眼结膜，本发明的预定应用是促进青光眼滤除术的成功。当进行青光眼滤除术时，作为降低IOP的手段，需手术造一引流瘘管或通道以增加水状液流出量。在青光眼滤除术中聚合物植入物的拟定用途是控制或下调节(down-regulate)手术伤口的愈合，以使之痊愈，但在本方法中，并没有产生过多的疤痕组织阻塞所造的滤过通道或大疱。因为毗邻伤口处的组织中的许多细胞为无丝分裂(没有裂开)，抗无丝分裂剂对这些细胞作用很小或没有作用，所以给予使用植入物另外的选择性。
将聚合物植入物上足够量的调节剂导入手术伤口处，以达到手术后所预期的促进愈合或抑制愈合的效果。有效浓度被定义为用如上文所描述的体外测定方法，与对照盘相比，即与聚合物植入物被单独加入的那些盘相比，抑制细胞增生至少70％的剂量，优选超过80％，和最优选超过95％的剂量，或定义为与对照盘相比，刺激细胞生长至少50％的剂量，优选超过100％，最优选超过200％的剂量。在GFS中，抑制伤口愈合的轭合物有效剂量一般为10～500微克，更优选10～200微克，还更优选10～100微克。
在本发明的另一个应用中，所研究的组织和细胞为白内障手术后的晶状体囊和任何与之相结合的残余晶状体上皮细胞。本发明用于除去初期白内障后，防止晶状体囊上的残余晶状体上皮细胞生长。初期白内障可为任何类型，包括老年型、幼年型和放射诱发型。聚合物植入物可以抑制晶状体上皮细胞的增生，或优选杀死晶状体上皮细胞，所述上皮细胞在除去初期白内障后可穿过后晶状体囊的视轴生长。为了评价本发明在施行初期囊外白内障手术后对防止继发性白内障的效果，可采用已被体外模型所接受的一种技术。根据Ulrich等人(1993年，《白内障屈光外科学杂志》(J.Cat.Refract Surg.)第19卷第462页)所描述的方法，已对宿主动物，例如兔子，施行了白内障手术。手术后，将一聚合物植入物插入囊袋内。植入物被做成张开的环形或圈形，其直径约为晶状体的中纬线直径。环两端用放置眼内晶状体触觉学通用的技术放入囊袋内。不同浓度的细胞增生调节剂被吸收到植入物上。手术后，观察眼睛，确定植入物对后囊表面晶状体上皮细胞增生的作用。在手术后所选定的时间，将动物人道地解剖，把眼睛交付做组织学评定，以鉴定晶状体上皮细胞增生的程度。
人类继发性白内障的发展需要几个月到几年的时间。继发性白内障在临床上由裂隙灯显微测定，表现为在后晶状体囊上出现晶状体上皮细胞的生长(后囊浑浊)。这种浑浊，特别是位于中心时，会导致视觉敏感度下降。后囊浑浊的治疗常规是用YAG激光施行囊切开术，除去浑浊的囊，恢复导致提高视觉敏感度的视觉亮线。本发明在此处描述了在进行初期白内障手术植入时，植入物对晶状体上皮细胞释放出细胞毒剂的治疗浓度。这些试剂会破坏细胞，因此防止了细胞增生。所以可以用裂隙灯显微镜检查来测定，发现未出现后囊浑浊。另一方面，由于后囊浑浊可导致视觉敏感度下降，所以后白内障手术后视觉敏感度水平的保持或YAG囊切开术发生率的下降，可用来测定植入物的效果。
所研究的组合物可以以用具提供而用于一种或多种手术中。用具可包含单独的聚合物植入物和生长调节剂。该试剂可以是浓缩物，包括冻干组合物，以及可用包含一个或多个剂量的若干小瓶来提供。方便地，单一剂量用无菌容器来提供。另一方面，用具可以包括所制备的供直接使用的组合物。一般情况下，通过把不同组分在一无菌环境中组合，而将生长调节剂与固体载体混合在一起，然后将该组合保存在一无菌环境中，直到使用。组合物优选在一无菌容器中干燥贮存或冻干贮存。在这些条件下，可使用赋形剂提高稳定性。一般而言，如果目前该药物在这些条件下稳定，那么在相同条件下与植入物结合时也必须稳定。植入物必须保持干燥，直到准备植入时为止。
下述提供的实施例用来作为说明，并不局限于此。
实施例内容表实施例1与聚苯乙烯相结合的蓖麻毒蛋白的细胞毒素活性实施例2与聚苯乙烯培养槽相结合的蓖麻毒蛋白的释放特征实施例3125I-蓖麻毒蛋白与不同聚合物的结合和释放特征实施例4结合在尼龙膜上的柔毛霉素对细胞增生的影响实施例5与不同聚合物相结合的柔毛霉素的细胞毒素活性实施例6结合到不同类型聚合物上柔毛霉素的定量实施例7柔毛霉素与尼龙膜的结合和释放特征实施例8用尼龙-柔毛霉素植入物防止兔模型的继发性白内障实施例9尼龙-柔毛霉素植入物控制患青光眼比哥猎狗滤除术后疤痕的形成实施例10柔毛霉素通过腙键与聚合物植入物的共价偶合实施例11柔毛霉素与尼龙粉末的结合和释放实施例12柔毛霉素通过腙键与羧甲基纤维素的共价偶合实施例13体外评价植入物的细胞生长调节性能实施例14伤口愈合过程中对植入物促进细胞增生的评价实施例1与聚苯乙烯相结合的蓖麻毒蛋白的细胞毒素活性将蓖麻毒蛋白(Sigma Chemical Company)用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释，制备20、2.0、0.2、0.02和0.002微克蛋白质/毫升的一系列稀释液。将蓖麻毒蛋白稀释液加到具有24槽的聚苯乙烯培养盘(Cornigg)的相同槽中(0.5ml/槽)。将PBS加到两个附加槽中作对照。在37℃孵育1小时，保持4℃过夜后，将培养盘用PBS洗涤3次，除去未结合的蓖麻毒蛋白。将悬浮于1.0ml含10％胎儿牛血清的M199(Gibco)中的ME 180细胞(ATCC No.HTB 33)加到槽中，使得每槽的细胞量为1.0×104个，在37℃孵育8天。孵育过后，将培养基从槽中吸出，每槽加入0.5ml结晶紫溶液(用70％甲醇配成5％的溶液)对细胞单层染色。孵育5分钟后，用水洗涤培养盘，除去过量的色素，风干。然后用倒装显微镜观察培养盘，估算细胞生长(％群集)的程度。结果如下表1所示。
表1在用蓖麻毒蛋白预处理过的聚苯乙烯培养槽中的细胞增生预处理浓度(微克/毫升)1％细胞群集220 02.000.2＜250.02 50～750.002 25～50PBS对照50～751加入培养槽的PBS中的蓖麻毒蛋白浓度2％群集用倒装显微镜目测着色的单层估算。0％群集表示在槽中没有观察到细胞的生长。100％群集表示槽完全被单层细胞覆盖了。
因此，本实施例说明，调节剂如蓖麻毒蛋白和聚合物如聚苯乙烯相结合，抑制了与包覆聚合物相接触的或在聚合物植入物周围的细胞的生长。
实施例2与聚苯乙烯培养槽相结合的蓖麻毒蛋白的释放特征将蓖麻毒蛋白(Sigma Chemical Company)用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释，制备10、5.0、2.5、1.25和0.62、0.31和0.15微克蛋白质/毫升的一系列稀释液。将蓖麻毒蛋白稀释液加到具有24槽的聚苯乙烯培养盘(Corning)的槽中(0.5毫升/槽)。将PBS加到附加槽中作对照。在37℃孵育1小时，保持4℃过夜后，将培养盘用PBS洗涤5次，除去全部未结合的蓖麻毒蛋白。洗涤后，向每个槽中分别加入1.0ml PBS，将培养盘在4℃孵育24小时。收集各槽的上层清液，采用MTT细胞毒性测定法用ME180细胞滴定。通过与已知量蓖麻毒蛋白所产生的细胞毒性进行对照，测得释放入PBS中的蓖麻毒蛋白量。结果如下表2所示。
表2蓖麻毒蛋白从聚苯乙烯细胞培养槽中的结合和释放加入的蓖麻毒蛋白浓度(微克/释放的蓖麻毒蛋白量(纳克)1毫升)10.0 26.25.0 12.22.5 8.31.25 4.60.62 4.20.31 2.30.15 0.841在PBS中孵育24小时后，从聚苯乙烯释放出的蓖麻毒蛋白量。所以，本实施例说明，聚合物可以缓慢地释放所结合的调节剂。
实施例3125I-蓖麻毒蛋白与不同聚合物的结合和释放特征用125I标记蓖麻毒蛋白，并用比活力为5.8×104每分钟计数/微克的蛋白质将其稀释到10微克/毫升。聚合物球(直径1/4英寸)购自Polysciences，并用高压釜灭菌。将聚合物球加入到蓖麻毒蛋白溶液中，在37℃孵育1小时，保持4℃过夜。孵育后，用PBS洗涤球以除去未结合的蓖麻毒蛋白。将各个球装入管内，用LKB compugamma计数器计数，测定结合了放射性的数量。各个球也可以放在24槽培养盘的各个槽中，槽中已装有1毫升含10％ FBS和4.5×104ME 180细胞的M199。将培养盘在37℃孵育5天。孵育后，将各个球从槽中取出，漂洗后做放射性计数。收集培养基等分试样并计数。然后将剩余的培养基从槽中吸出，给槽染色，并用上文所描述的方法观测。
表3与聚合物球相结合的蓖麻毒蛋白4聚合物孵育前1孵育后2％群集3(纳克/球) (纳克/球)聚苯乙烯 0.677 0.3970聚丙烯1.004 0.5980丙烯酸0.192 0.1430聚酰胺0.161 0.08101与聚合物球相结合的蓖麻毒蛋白(纳克/球)，加入细胞培养槽前，需漂洗。2在槽中培养5天后与聚合物球相结合的蓖麻毒蛋白(纳克/球)。3结合在细胞培养槽上的活细胞的相对估计。零表示没有细胞。4对照组(球上无蓖麻毒蛋白)所具有的3+％群集。
实施例4结合在尼龙膜上的柔毛霉素对细胞增生的影响用一打孔器从一张膜上切下若干尼龙膜圆片(Biodyne A，直径7.5毫米，Pall Biosupport)，并将其用高压釜灭菌。然后在室温下，将圆片在一柔毛霉素溶液(200微克/毫升PBS溶液)中孵育2小时。由于圆片吸收了柔毛霉素，观察到颜色是红色。将圆片用PBS漂洗，放入M199中再孵育2.75小时。然后将圆片漂洗、吸干，除去多余的液体。然后将圆片放入24槽培养盘的底部，将10微升悬浮在含10％ FBS的M199中的ME 180细胞放在圆片的中央。将培养盘在37℃孵育1小时，使得细胞粘附，然后除去未结合的细胞。加入含10％ FBS的M199，将培养盘在37℃下孵育48小时。为测定细胞增生的程度，向每个槽中加入1uCi3H-胸苷，再将培养盘孵育24小时。然后将圆片用冰冷的10％三氯乙酸漂洗，用水漂洗，放入闪烁氟计数。结果列于下表4。
表4结合在尼龙膜上的柔毛霉素对细胞增生的影响用于膜处理的柔毛霉 培养基中的柔毛霉 加入3H-胸苷(每分钟素1素2计数3)- - 1627±689- + 62±57+ - 29±41将尼龙膜圆片在柔毛霉素的PBS溶液中培养，洗涤除去未结合的柔毛霉素。对照膜用PBS处理。2加入细胞对照槽后，培养基得到足以抑制细胞增生的柔毛霉素溶液等分试样。3把3H-胸苷加入到DNA中，用于监测细胞增生。数据代表三次测定结果的平均偏差和标准偏差。
实施例5与不同聚合物相结合的柔毛霉素的细胞毒素活性从Polysciences获得聚合物球(直径为1/4英寸)。将各个球(已用高压釜灭菌)放入用PBS稀释到0.5毫克/毫升的柔毛霉素溶液中，在室温下孵育过夜。然后将球充分地用PBS漂洗，除去未结合的柔毛霉素。再将各球放入24槽培养盘(Costar)的槽中。另外将聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)眼内晶状体(IOL)用类似的方法处理。ME 180细胞的单细胞悬浮液通过汇合的单层的变胰蛋白酶作用来制备，并重新悬浮在含10％PBS的M199中。向培养盘的每个槽中加入1毫升细胞悬浮液(1.4×104个细胞/毫升)。将培养盘在37℃孵育，直到对照槽(无球)出现群集。此时，将培养基吸出，将细胞单层如上所述用结晶紫染色。用倒装显微镜观察槽内的染色细胞，确定细胞生长的程度。在含有用柔毛霉素处理过的聚合物球或柔毛霉素处理过的IOL的任一槽内，均未观察到细胞。相反，在不含聚合物球或LOLS的槽中出现了汇合的单层生长细胞。本实施例说明，聚合材料的IOL可以方便地用调节剂处理，以抑制IOL上或IOL附近细胞的不期望生长。
实施例6结合到不同类型聚合物上柔毛霉素的定量将聚合物球(直径为1/4英寸)如上所述在柔毛霉素溶液中孵育。孵育后漂洗，除去未结合的柔毛霉素，将各球放入1毫升甲醇中萃取出其所结合的药物。在476纳米读取甲醇萃取液的吸光度。1％柔毛霉素溶液在1厘米处的消光系数为173，测定聚合物的结合能力-球的表面积。结果示于下表5。
表5不同聚合物结合柔毛霉素的能力聚合物结合的柔毛霉素(微克/平方厘米)聚酰胺球(尼龙) 1.26聚丙烯球0.50聚苯乙烯球 0.71丙烯酸球0.28本实施例说明，有多种聚合物可以结合柔毛霉素，尼龙具有优良的结合力。
实施例7柔毛霉素与尼龙膜的结合和释放特征用一打孔器从一张膜上切下若干尼龙膜(产自Pall的Biodyne)圆片，直径为7.0毫米，并将其用高压釜灭菌。然后在室温下，将圆片在一50微克/毫升在PBS中的柔毛霉素(Sigma)溶液中孵育3小时。由于圆片吸收了柔毛霉素，看到其颜色为红色。将圆片用PBS彻底漂洗，以除去未结合的柔毛霉素。将4张圆片放入含1毫升甲醇的试管中，萃取其所结合的柔毛霉素。通过在476纳米和1％溶液的消光系数为173的情况下，测定甲醇溶液的吸光度以确定柔毛霉素的浓度。将8张圆片加入到含1毫升PBS的试管内，在室温下孵育24小时。孵育后，除去含4张圆片的试管内的PBS。将这些圆片用甲醇萃取，如上所述测定结合到圆片上的药物量。再将另4张圆片继续孵育72小时(在PBS中总计孵育96小时)。孵育后除去PBS，将圆片用甲醇萃取，以测定所结合的药物量。结果示于下表6中。
表6柔毛霉素从尼龙膜上随时间的释放尼龙所结合的柔毛霉素(微克/圆片)起始膜 16.5PBS萃取24小时后 10.3PBS萃取96小时后 6.51每张尼龙膜片所结合的柔毛霉素总量(微克)。柔毛霉素用甲醇从膜上萃取得到。1％柔毛霉素溶液消光系数为173(1厘米)，在476纳米处，用吸光度来测定浓度。
实施例8用尼龙-柔毛霉素植入物防止兔模型的继发性白内障兔子的继发性白内障一般是在其白内障手术后几周内出现，表现为在其后晶状体囊上出现残余晶状体上皮细胞的增生。白内障手术后，用兔活体模型评价了尼龙环-柔毛霉素植入物对晶状体上皮细胞增生的影响。
白内障手术是根据1993年，Ulrich等人在《白内障屈光外科学杂志》(J.Cat.Refract.Surg.)第19卷第462页所描述的方法进行的。随机把雌性新西兰白兔分为两个治疗小组，每组6只。两个小组都被用晶状体乳化技术(phacoemulsification)摘除了一只眼的晶状体。手术步骤模拟了除去初期白内障对人所采用的方法。第1组的动物接受了未经处理的尼龙环。第2组动物接受了环上吸收有所试验的细胞增生调节剂浓度之一的尼龙环。用晶状体乳化技术除去晶状体物质后，将环放在晶状体囊内。
所有的兔子都接受了为期一周的术后标准护理，包括局部甾体和抗菌素(局部庆大霉素)抗炎治疗。然后观察兔眼，测定植入物对后囊表面晶状体上皮细胞增生的影响。在选定的时间(3和6个月)，杀死动物，将其眼作组织学鉴定，以鉴定晶状体上皮增生的程度。
通过把所研究的眼内尼龙-柔毛霉素植入物植入前房，可以抑制残余晶状体上皮细胞的增生，从而防止了继发性白内障。眼内植入物的使用为细胞毒素药物的输送提供了优良的方法，使得药物随时间而释放，保护药物在眼内不发生降解过程。所研究的方法和装置由此提供了一种防止继发性白内障的简单方法。
实施例9尼龙-柔毛霉素植入物控制患青光眼比哥猎狗滤除术后疤痕的形成比哥猎狗天生易患青光眼，是人类青光眼的良好模型。1991年King等人《美国兽医学研究杂志》(Am.J.Vet.Res.)第52卷第2067～2070页。两组患有青光眼的比哥猎狗，每组6只，其特征在于单眼或双眼的IOP大于30毫米汞柱，均在一只青光眼上接受了青光眼滤除术；一组接受了尼龙膜-柔毛霉素植入物，而另一组则用尼龙过滤对照处理。用Zeiss裂隙灯生物显微镜对比哥猎狗进行手术前眼睛检查。手术前IOP是通过向眼内滴加一滴0.5％的丙美卡因盐酸(局部麻醉药)后，用pneumototometry方法和扁平呼吸描记器(Applanation Pneumatograph)(BioRad)进行三次测定所获取的平均值。对狗施行一般麻醉，放置一睑张开器，在缘后约8毫米造一缘基结膜portame，施行锐器和钝器解剖，直到可以清楚地看到角膜巩膜缘。然后在缘上形成一个三角形局部厚的巩膜瓣，约达50％巩膜深，再用锐器15度剃刀造一到前房内的入口创伤。然后施行1毫米×3毫米的巩膜造口术，切除局部厚瓣下的组织。用Vannus剪和珠宝商(jewelers′)弯钳施行外周虹膜切除术。用10-0尼龙缝线缝合巩膜瓣。然后将涂覆有柔毛霉素的尼龙膜放置在巩膜和结膜之间。结膜用滑动的吸收性缝线缝合。
随后给动物的每只眼睛涂上一种混合的抗菌素/甾体软膏，并保暖，每小时观察一次，连续观察8小时，第二天，每隔4小时观察一次。此后继续每天观察，同时滴注抗菌素甾体软膏约21天。手术后的开始5天，每天要进行包括对大疱开放情况、毒性和并发症的例行检查，裂隙灯生物显微检查和pneumotonometry检查，然后每隔3天检查一次，直到第6周，然后每周检查一次，直到第12周。对包括IOP变化情况的观察进行标准的统计分析，以找出降低的IOP的维持法。
实施例10柔毛霉素通过腙键与聚合物植入物的共价偶合将具有游离羧基的尼龙膜圆片(Biodyne C，孔径1.2微米，直径7毫米，Pall Biosupport)浸入30毫升己二酸二酰肼(100毫克/毫升水溶液)中。将1-乙基-3，3-(二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)加入到溶液中，使最终浓度为3.0毫克/毫升，将膜圆片在室温下孵育90分钟。通过滴加1.0摩尔/升的盐酸，使pH保持在4.75。孵育后，将膜片用水充分地洗涤，然后加到在pH为4.5的0.2摩尔/升乙酸钠缓冲液中的柔毛霉素溶液(3.0ml，2.0mg/ml)中，在室温下孵育48小时。孵育后，将膜圆片用PBS漂洗，除去未结合的柔毛霉素。将膜圆片放入100％的甲醇(1毫升/圆片)中2小时，除去非共价结合的柔毛霉素。通过该步骤除去的总量为37.2微克/圆片。将圆片放入1∶1的甲醇和pH为4.5的0.2摩尔/升乙酸钠缓冲液的溶液(1毫升/圆片)中，在室温下孵育以萃取通过腙键结合到尼龙上的柔毛霉素。24小时后，移去圆片，留下萃取缓冲液。将圆片放入1毫升新鲜的萃取缓冲液中。用分光光度法测定释放入萃取缓冲液中的柔毛霉素量。在48小时和96小时下重复此过程。在开始的24小时内，释放量为37.4微克/平方厘米。48小时时又释放出12.15微克/平方厘米。96小时时又释放出8.6微克/平方厘米。萃取出的总量为58.2微克/圆片。经过上述的孵育以后，圆片略微呈红色，表明尚有一些柔毛霉素结合在尼龙上。未接受腙处理的对照膜也结合有柔毛霉素。全部柔毛霉素在开始的甲醇萃取过程中就基本上被除去了。
实施例11柔毛霉素与尼龙粉末的结合和释放将尼龙6小丸(Polysicences Inc.，3克)悬浮在100毫升含20％CaCl2的100％甲醇中。然后将其在室温搅拌下，连续孵育(4天)，将尼龙溶液在室温和搅拌下滴入大大过量的水中(2升)。用抽滤器将这样得到的粉末分离，用水和无水乙醇连续洗涤，并真空干燥。
称取尼龙粉(15.5毫克)，将其在研钵中研磨。将粉末加入到0.5毫升用PBS配成的柔毛霉素溶液(2.2毫克/毫升)中，在室温下孵育过夜。孵育后，将粉末用PBS洗涤两次，离心除去未结合的柔毛霉素。将与柔毛霉素相结合的粉末重新悬浮在1.0毫升甲醇中，在室温下孵育过夜。孵育后，将甲醇回收，将粉末再萃取两次以上。用分光光度法测定萃取溶液中柔毛霉素的浓度。每毫克尼龙粉所萃取出的柔毛霉素总量为51.9微克。
实施例12柔毛霉素通过腙键与羧甲基纤维素的共价偶合把100毫克低粘度羧甲基纤维素(Sigma Chemical Company)溶于水中，使最终浓度为4.0毫克/毫升。用盐酸将pH调节到4.75。在室温搅拌下，将己二酸二酰肼(1.75克)加入到溶液中。将EDC(200毫克)加入到溶液中，滴加盐酸使pH维持在4.7。孵育60分钟后，加入另外200毫克EDC，再孵育60分钟。将溶液在室温下用水渗析72小时，然后用pH为4.5的0.1摩尔/升乙酸钠缓冲液渗析24小时。渗析后，将衍生的CMC在4℃下贮存。最终体积为30毫升。
把含有约为3.3毫克/毫升的5毫升衍生CMC(CMC-Hz)与溶于0.1毫升水中的1毫克柔毛霉素混合，在4℃下孵育48小时。通过测定473纳米处的吸光度，可确定与DMD-Hz相结合的柔毛霉素量。加入14毫升冷的无水乙醇沉降1毫升CMC-柔毛霉素配合物的等分试样，然后离心，干燥沉淀物。将干小丸加入1毫升PBS进行水合，然后在室温下孵育。3小时后，小丸溶胀，呈现凝胶的表观和稠度。
酰肼衍生物的形成程度可在反应过程中通过调节所用EDC的量来控制。孵育后，用磷酸盐缓冲液渗析聚合物-药物混合物，可除去游离的柔毛霉素。通过测定473纳米处的吸光度，可以确定柔毛霉素与CMC-Hz的结合程度。
柔毛霉素从羧甲基纤维素上释放的速率是pH的函数，把小丸分别在含有10％丙酮、pH为4.5、5.0和7.4的稀释水溶液(0.1摩尔/升)缓冲液的等分试样中孵育，可测得其释放速率。各缓冲液在37℃条件下孵育。每过一段时间，用无水乙醇沉降结合有柔毛霉素的聚合物，通过测定残存在溶液中的柔毛霉素的吸光度(476毫升)，可以确定溶液中游离的柔毛霉素量。
实施例13体外评价植入物的细胞生长调节性能可以在体外评价包覆有调节细胞增生的试剂的聚合物植入物。细胞培养槽中装有1毫升含有10％ FBS的M199培养基。将包覆有细胞增生试剂的植入物聚合物加入到槽中。然后用所研究组织的细胞给培养槽接种，例如接种巩膜或结膜衍生的成纤维细胞或晶状体上皮细胞，用生长调节组合物培养足够长时间后，观察预期的结果。用本领域技术人员已知的任何方法，如台盼蓝染料排除法、氚化了的胸苷加入法等，可测定每个培养盘的生长。还可通过直接用显微镜观察染色或没有染色的细胞来测定细胞的生长。另外，也可用活体染料MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物来测定细胞的生长。这种染料可被生物活细胞而非死细胞，转化为一种蓝色的甲
产物(Mosman，1983年《(免疫方法杂志)》(J.Immunol.Methods)第65卷第55页)。随后可将该蓝色产物用十二烷基硫酸钠/盐酸溶解，用ELlSA读取器在590纳米处定量。与未处理的对照槽相比，用导致杀死50％细胞的试剂浓度来测定IC50值。
实施例14伤口愈合过程中，对植入物促进细胞增生的评价可用本领域中已接受的许多伤口愈合模型中的任何一个来评价结合有细胞增生调节剂的聚合物植入物。与本发明特别相关的是含有手术伤的模型。将包覆有细胞增生调节剂例如β型转移生长因子(β型TGF)的聚合物植入物放在兔眼的结膜下。将新西兰白兔全身麻醉，眼内放入眼睑张开器。切开结膜并锐器向前解剖到缘，造一缘基结膜瓣。注意，不要切下巩膜外层。将植入物放在瓣下，用9-Ovicryl缝线以流畅的形式缝合结膜。
在植入后第3、5和7天，将动物杀死。摘出眼睛，并将其固定在中性福尔马林缓冲液中。制备含有植入物的组织的石蜡部分，然后将其用苏木紫和曙红染色，观察植入处纤维脉管增生的程度。用Massons三铬将各部分进行染色，观察植入处新形成的胶原纤维。接受包覆有β型TGF植入物的组织中的植入处及其周边，与植入物上不含试剂或未接受植入物的组织相比，其纤维脉管增生的程度和新形成的胶原相当大地更大些。
上述实施例证明，生长调节剂，如蓖麻毒蛋白和柔毛霉素，可以可逆地与聚合物如聚苯乙烯、聚丙烯、丙烯酸、聚酰胺和尼龙相结合。另外，可用不稳定的共价键把生长调节剂连接到聚合物上。然后调节剂从聚合物上释放。结合和释放可以容易地用上述试验方法测定。聚合物可以被加工成适用于所需应用的植入物形式，并植入动物内。例如可用该方法防止继发性白内障，或维持GFS中过滤大疱的开放。
本说明书中所提到的所有出版物和专利申请表明了本发明所涉及领域的技术人员的水平。所有的出版物和专利申请在此引入作为参考，其内容与分别在各处详实引入作为参考的各出版物和专利申请相同。
现在，本发明已经全部阐述完毕了，对于本领域中的普通技术人员，在不偏离附加的权利要求的精神和范围条件下，显然可以对其进行许多改变和修改。
权利要求
1.一种用于调节眼睛指定区域内目标细胞增生的植入物，所述的植入物包括一种聚合物和至少一种与植入物可逆结合的调节剂，所述结合的方式应当是在植入物植入后，所述的调节剂以一定速率释放出来，以保持所述的指定区域有调节剂。
2.一种根据权利要求1的植入物，其中至少一种调节剂为抑制剂。
3.一种根据权利要求2的植入物，其中至少一种抑制剂为抗有丝分裂剂。
4.一种根据权利要求3的植入物，其中抗有丝分裂剂为蒽环型药、阿霉素或柔毛霉素。
5.一种根据权利要求2的植入物，其中至少一种抑制剂为抗代谢物。
6.一种根据权利要求5的植入物，其中所述的抗代谢物为5-氟代尿嘧啶。
7.一种根据权利要求2的植入物，其中所述的抑制剂为毒素。
8.一种根据权利要求7的植入物，其中所述的毒素为蓖麻毒蛋白。
9.一种根据权利要求1～8中任何一项的植入物，用于调节晶状体上皮细胞的增生。
10.一种根据权利要求1～8中任何一项的植入物，用于调节成纤维细胞的增生。
11.一种根据上述权利要求中任何一项的植入物，其中指定区域为过滤处。
12.一种根据上述权利要求中任何一项的植入物，其中指定区域为晶状体囊的中纬线区。
13.一种根据上述权利要求中任何一项的植入物，其为一种膜。
14.一种根据上述权利要求中任何一项的植入物，其为一种眼内晶状体、引流旁路、假体、药物释放植入物或一晶状体囊环。
15.一种根据上述权利要求中任何一项的植入物，其包含一种生物惰性聚合物。
16.一种根据权利要求15的植入物，其中生物惰性聚合物不被腐蚀。
17.一种根据权利要求16的植入物，其中聚合物为硅、聚甲基丙烯酸甲酯或尼龙。
18.一种根据权利要求17的植入物，其中聚合物为尼龙，调节剂为柔毛霉素。
19.一种根据上述权利要求中任何一项的植入物，其中调节剂共价地结合在聚合物上。
20.一种根据上述权利要求中任何一项的植入物，用于杀死白内障手术后残余的晶状体上皮细胞。
21.一种根据上述权利要求中任何一项的植入物，用于防止形成疤痕组织。
22.一种与调节剂可逆结合的聚合物的用途，该聚合物用于制备上述权利要求中任何一项的聚合物植入物，以杀死白内障手术后残余的晶状体上皮细胞。
23.一种与调节剂可逆结合的聚合物的用途，该聚合物用于制备上述权利要求中任何一项的聚合物植入物，以防止形成疤痕组织。
24.一种制造眼内装置的方法，所述的方法包括将一种生物惰性聚合物与一种调节剂相接触，形成可逆结合结果。
全文摘要
本发明提供了能持续不断地释放细胞增生调节剂的眼内装置及其制备和用途。增生调节剂与用于制备眼内装置的材料共价或非共价地结合,所述材料一般为一种与眼组织生理相容的生物惰性聚合物。当眼内装置被植入组织后,药物从眼内装置上释放出来使得植入区内基本上保持有药物。该装置可用来抑制植入区附近的细胞增生。该装置可用无菌盒提供,优选以适宜于立即使用的形式。
文档编号A61K9/00GK1179725SQ95196849
公开日1998年4月22日 申请日期1995年10月24日 优先权日1994年10月26日
发明者P·J·凯莱赫 申请人:休斯顿生物技术有限公司