专利名称：利用2'-取代寡核苷酸负调节基因表达的制作方法
技术领域：
本发明背景本发明涉及基因表达调控。具体地说，本发明涉及利用合成的寡核苷酸来负调节动物的某个基因的表达。
反义寡核苷酸疗法的发展前景是由发表于1977年和1978年的三篇文章首先提出的。Paterson等人(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1977)744370-4374)发现无细胞的mRNA转译可通过mRNA与一种与之互补的寡核苷酸结合而得到抑制。Zamecnik等人(Pro.Natl.Acad.Sci.(USA)(1978)75280-284 and 285-288)发现人工合成的与劳氏肉瘤病毒(RSV)基因组的一部分互补的13mer的寡核苷酸在被RSV感染的鸡成纤维细胞中，能抑制RSV的复制开可抑制RSV介导的从初级鸡成纤维细胞向恶性肉瘤细胞的转化。
合成的寡核苷酸能用来抑制病毒繁殖和瘤形成，这一发现导致人们利用合成的寡核苷酸来抑制各种各样的病毒，例如HIV(见U.S.Patent No4,806,463)；流感病毒(见Leiter等人(1990)(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)873430-3434))；疱疹性口炎病毒(见Agris等人(1986)Biochem.256268-6275)；单纯疱疹病毒(见Gao等(1990)Antimicrob.Agents Chem.34808-812)；SV40(见Birg等(1990)(Nucleic Acids Res.182901-2908)；及人乳头瘤病毒(见Storey等(1990)(Nucleic Acids Res.194109-4114)。Agrawal(Trends in Biotech.(1992)10152-158)对利用合成的寡核苷酸及其类似物作为抗病毒制剂的方法作了详尽的综述。
此外，合成的寡核苷酸还被用来抑制一系列非病毒性病原体及选择性地抑制特定细胞基因的表达。因此，利用合成的寡核苷酸作媒介来抑制病毒的繁殖，非病毒病原体的繁殖及基因的选择性表达的程序已经被完善地建立起来了。
最近一段时间改进的寡核苷酸得到了很快的发展，它们在抑制病毒，病原体及选择性基因表达方面效率更高。其中有一些寡核苷酸对于核苷酸间的键合作了一些修饰，使得这些寡核苷酸的效率比未修饰前提高了。例如，Agrawal等(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1988)857079-7083)发现硫代磷酸寡核苷酸及某些寡核苷酸氨基磷酸酯在抑制HIV-l方面要比常规的磷酸二酯键连接的寡脱氧核苷酸的效率高得多。Agrawal等(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1989)867790-7794)发现硫代磷酸寡核苷酸在抑制早期及慢性感染细胞中的HIV-1方面具有优势。
此外还开发了一些在寡核苷酸内具有一种以上核苷酸间键的嵌合寡核苷酸。Pederson等(U.S.专利5,149,797和5,220,007)公开了一种嵌合寡核苷酸，其含有一个磷酸二酯键或硫代磷酸键连接的寡核苷酸核心序列，该序列旁侧为核苷酸甲基膦酸酯或氨基磷酸酯。Furdon等(Nucleic Acids Res.(1989)179193-9204)披露了一种嵌合寡核苷酸，除具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的寡核苷酸区域外，还包括含有磷酸二酯键的寡核苷酸区域。Quartin等(Nucleic Acids Res.(1989)177523-7562)描述的嵌合寡核苷酸具有磷酸二酯键寡核苷酸区域和甲基膦酸化寡核苷酸区域。Inoue等(FEBS Lett.(1987)215237-250)公开的嵌合寡核苷酸含脱氧核糖核苷酸及2’-O-甲基-核糖核苷酸区域。
很多这类修饰的寡核苷酸有助于提高反义寡核苷酸疗法的效率。然而，在这些已知的寡核苷酸中仍存在着缺陷，这些缺陷限制了此类寡核苷酸作为治疗剂的效率。例如，Wickstrom(J.Biochem.Biophys.Meth.(1986)13；97-102)指出磷酸二酯键的寡核苷酸对核酸酶介导的降解作用敏感，因而其在体内的生物稳定性受到了限制。Agrawal等(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1990)871401-1405)指出氨基磷酸酯化和甲基膦酸化的寡核苷酸在与RNA杂交时不能激活RNase H，而这种激活作用对反义寡核苷酸的功能可能是十分重要的。因此需要利用疗效提高的寡核苷酸来控制基因表达的方法。
关于开发硫代磷酸键连接的寡核苷酸作为潜在的抗艾滋病制剂已有几篇报道发表。尽管对于寡核苷酸的化学及分子机制方面的广泛研究已经表明了这种新的治疗策略的潜在价值，但有关这些化合物在体内的约物代谢动力学及其代谢所知甚少。
最近发表了一些关于这个主题的初步研究。Agrawal等(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1991)887595-7599)描述了向小鼠静脉注射和腹腔注射硫代磷酸键连接的寡核苷酸20-聚体。在此实验中，最初的24小时后注射剂量的30％在尿中排出，同时在肝，肾中优先积累。血浆中的半衰期范围从1小时(t1/2α)到40小时(t1/2β)不等。随后的研究(Iversen(1991)Anti-Cancer Drug Design 6531-538；Iverson(1994)Mol.Pharm.45932-943也得到了类似的结果。然而，当寡核苷酸静脉注射和腹腔注射时其稳定性的问题依然存在。
因此，仍然需要开发更加有效的治疗方法对基因表达进行负调控，这种方法应在操作上更简单以适于动物及待治疗的病症和靶基因。优选的方法应是简单，无痛，且精确地作用于靶基因。
本发明的概述本发明提供了一种负调节动物的某个基因表达的方法，该方法涉及口服给予一种与此基因互补的寡核苷酸，因而避免了由于静脉注射及其他体内给药方式所可能导致的复杂情况。
已发现特定的寡核苷酸(含非磷酸二酯键且最少含一个2’-取代核糖核苷酸)经动物口服摄入后在体内相对稳定，而且这些分子可从肠胃道很好地被吸收并分散至体内各个组织。利用此发现扩展得出了本发明，即对动物的某个基因的表达进行负调节的方法。
本方法也是一种检测动物的各种基因的功能的手段，包括那些对动物的发育有重要作用的基因。目前，基因的功能只能通过繁琐的构建基因敲除动物如小鼠进行检测。这项工作复杂耗时且不适用于那些对动物发育至关重要的基因，因为基因敲除会产生致死的表型。本发明则克服了这种模式的缺点。
在本发明的方法中，利用药物学可接受的载体使携带靶基因动物口服一种含有与靶基因互补的寡核苷酸的药物配制品。此寡核苷酸抑制基因的表达，因而对其表达进行负调节。
就本发明的目的而言，术语“动物”包括人类及其他哺乳动物以及爬行类，两栖类和昆虫。术语“口服给予”指经过口腔消化摄取配制品或通过肠胃系统的其他部分包括食管摄入的过程。
用于本文的术语“寡核苷酸”包括两个或更多的核苷酸或核苷酸类似物组成的聚合物，核苷酸由5’到3’的核苷酸间键连接在一起，这些键可以包括反义寡核苷酸技术领域中任何已知的键。此类分子有一个3’末端和一个5’末端。给予的特定寡核苷酸最少含一个2’取代的核糖核苷酸，且通过非磷酸二酯键的核苷酸间键连接。
就本发明的目的而言，术语“2’取代的寡核苷酸”是指含有一个在其2’位连有一个非羟基化学基团的糖基的寡核苷酸。核糖分子的2’-羟基可被如下基团取代，即含1-6个碳原子的-O-低级烷基，含2-6个碳原子的芳基或取代芳基或烯丙基，例如2’-O-烯丙基，2’-O-芳基， 2’-O-烷基(如2’-O-甲基，2’-卤素，或2’-氨基，但不被2’-H取代，其中烯丙基，芳基，烷基可以是未取代的或被例如卤素，羟基，三氟甲基，氰基，硝基，酰基，酰氧基，烷氧基，羧基，烷酯基或氨基。
本文所用的术语“非磷酸二酯键连接的寡核苷酸”是指这样一种寡核苷酸，其所有的核苷酸都是通过一种合成的键合(即位于一个核苷酸的5’端和另一个核苷酸的3’端之间的除磷酸二酯键以外的键合)共价连接，其中5’核苷酸磷酸酯已经被其他化学基团所替代。优选的合成键合包括烷基膦酸酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硫代烷基膦酸酯，氨基磷酸酯，亚磷酰胺，磷酸酯，氨基甲酸酯，碳酸酯，磷酸三酯，乙酰胺化物(acetamidate)，羧甲基酯。本发明的一个优选实施方案中、寡核苷酸中的所有核苷酸均由硫代磷酸酯键和/或二硫代磷酸酯键连接。
本发明的一些实施方案中，给予的寡核苷酸是经过修饰的。本文所用的术语“修饰的寡核苷酸”，涵盖了含有自然界中没有的经过修饰的核酸，碱基，和/或糖基的寡核苷酸。例如，一个3’，5’-取代的寡核苷酸含有一个其3’和5’端均与一个非羟基(其3’端)和非磷酸基(其5’端)的化学基团相连的糖基。
修饰的寡核苷酸也可以是具有添加的取代基如二胺，胆甾醇，或其他亲脂基团的寡核苷酸或加帽的寡核苷酸。此外，在分子中每核苷酸有一个非桥联氧取代基的非氧化的或部分氧化的寡核苷酸也被认为属于修饰的寡核苷酸。被认为是修饰的寡核苷酸的还包括那些在其3’和/或5’端具有赋予核酸酶抗性的庞大取代基的寡核苷酸和/或具有其他各种在体内非人为情况下无法产生的结构修饰的寡核苷酸。
在本发明的一个优选的实施方案中，给予的寡核苷酸在其3’末端最少含一个2’-取代核糖核苷酸。在一些实施方案中，除寡核苷酸的5’端的4到5个核苷酸外，其余均为2’-取代核糖核苷酸，并且在其中一些实施方案中，这4到5个未取代的5’核苷酸为脱氧核糖核苷酸。在其他方面中，寡核苷酸在其3’和5’末端具有至少一个2’-取代的核糖核苷酸，而在另外一些实施方案中，除了在任何内部位置的至少4或5个连续的脱氧核糖核苷酸以外，寡核苷酸的所有位置上均由2’-取代的核糖核苷酸组成。本发明的另一方面包括给予由均是2’-取代的核糖核苷酸组成的寡核苷酸。某些实施方案包括具有2’-O-烷基-核糖核苷酸如2’-O-甲基的寡核苷酸。
本发明的另一个实施方案中，给予的寡核苷酸最少含一个脱氧核糖核苷酸，在一个优选的实施方案中，所用的寡核苷酸最少含有4到5个能激活RNaseH活性的连续的脱氧核糖核苷酸。
给予的寡核苷酸与病毒的基因，病原体的基因或在一些实施方案中与某个细胞基因互补。某些实施方案中，寡核苷酸与下列疾病涉及的病毒的一个基因互补，即AIDS，口腔或单纯疱疹，乳头疣，流感，口蹄疫，黄热病，鸡瘟，带状疱疹，成人T-细胞白血病，Burkitt氏淋巴瘤，鼻咽癌或肝炎。在一个特定的实施方案中，寡核苷酸与一个HIV基因互补，且包括15到26个由硫代磷酸酯核苷酸间键连接的核苷酸，最少有一个3’端的核苷酸为2’-取代的核苷酸，且最少有4个连续的脱氧核糖核苷酸。
在另一个实施方案中，寡核苷酸与编码一个Alzheimer氏病相关蛋白的基因互补。
在其它实施方案中，寡核苷酸与编码一个在寄生虫中表达的蛋白的基因互补，这种寄生虫可以引起寄生性疾病例如阿米巴病病，南美洲锥虫病，弓形体病，肺孢子虫病(pneumocytosis)，梨形鞭毛虫病，隐孢子虫病，滴虫病，疟疾，蛔虫，丝虫病，旋毛虫病，或血吸虫病感染。
附图的简要说明同附图一起阅读下面的说明，就可以对本发明中前述及其它的目的及其各种特征，以及发明本身有更全面的了解
图1的图表表示口服摄入放射性标记的寡核苷酸后放射性标记的修饰的PS-寡核苷酸1在肝，肾，及血浆中的滞留时间。
图2A是放射性标记的寡核苷酸标准品的HPLC层析结果。
图2B是摄入放射性标记的寡核苷酸12小时后从血浆样品中分离的寡核苷酸的HPLC层析结果。
图3A是放射性标记的寡核苷酸标准品的HPLC层析结果。
图3B是摄入放射性标记的寡核苷酸6小时后从大鼠肝脏中分离的寡核苷酸的HPLC层析结果。
图3C是摄入放射性标记的寡核苷酸24小时后从大鼠肝脏中分离的寡核苷酸的HPLC层析结果。
图4的图表表示口服摄入放射性标记的寡核苷酸后大鼠排出的尿中放射性的变化过程。
图5A是放射性标记的寡核苷酸标准品的HPLC层析结果。
图5B是摄入放射性标记的寡核苷酸6小时后从大鼠尿样中分离的寡核苷酸的HPLC层析结果。
图5C是摄入放射性标记的寡核苷酸12小时后从大鼠尿样中分离的寡核苷酸的HPLC层析结果。
图6的图表表示口服摄入放射性标记的寡核苷酸后大鼠的肠胃道中及粪便中放射性的变化过程。
图7是摄入放射性标记的寡核苷酸1小时，3小时，6小时后从大鼠胃中分离的寡核苷酸的HPLC层析结果。
图8是摄入放射性标记的寡核苷酸3小时，6小时，12小时后从大鼠大肠中分离的寡核苷酸的HPLC层析结果。
优选的实施方案的详细描述本文所引用的专利和科学文献所建立的知识，对于本领域内的熟练人员来说，很易理解。文中引用的美国注册专利、批准的专利申请和文献作为相应的参考文献。
本发明提供了一种通过口服给予一种寡核苷酸来对动物的某个基因的表达进行负调节的方法，此寡核苷酸的核苷酸序列是与靶基因互补的。
我们已经知道一种称为“反义寡核苷酸”的寡核苷酸能通过Watson-Crick或Hoogsteen的碱基配对法则与单链的靶核酸分子结合，结合后通过下面的某种机制来破坏靶分子的功能如通过阻止靶分子同正常转录，剪接，或翻译所需的因子结合；如果寡核苷酸中存在一个连续的脱氧核糖核苷酸区域时通过Rnase H的对mRNA的酶解作用；和/或通过利用直接连接在反义寡核苷酸上的活性基团摧毁靶分子。
因此根据上述的特性，按照本发明的方法，这类寡核苷酸能控制或负调节某种动物的一个特定基因的表达，所以说此类寡核苷酸具有临床应用价值。
适用于本发明所述方法的寡核苷酸长度最少应为6个核苷酸，但优选的应为6到50个核苷酸，最常用的是15到30mer。它们由脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸或二者共同组成，其中一个核苷酸的5’端与另一个核苷酸的3’端通过非磷酸二酯键共价连接，这种键合包括烷基膦酸酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硫代烷基膦酸酯，氨基磷酸酯，磷酸酯，氨基甲酸酯，乙酰胺化物，羧甲基酯，碳酸酯，和磷酸三酯。含这些键的寡核苷酸可以通过已知的方法，如氨基磷酸酯或H-磷酸酯化学来制备，可以手工制备或按Brown描述的通过自动合成仪制备(寡核苷酸合成简介，寡核苷酸及类似物所用程序，分子生物学方法(1994)201-8)。(也可见如，Sonveaux“寡核苷酸合成中的保护基团”Agrawal(1994)分子生物学方法26l-72；Uhlmann等(1990)Chem，Rev.90543-583)组合物中的寡核苷酸还可以通过很多方法在不损害它们与靶核酸分子的杂交能力的情况下进行修饰。类似的修饰包括，例如，在寡核苷酸分子内部或末端的修饰，其包括向分子添加核苷酸间磷酸酯键，例如在氨基和未端核糖之间引入带有不同数目碳原子残基的胆甾醇或二胺化合物，进行脱氧核糖和磷酸酯的修饰使之能切割对应链或与对应链、相关的酶或某些能与病毒基因组结合的蛋白进行交联。这种修饰的寡核苷酸的例子包括带有一个修饰碱基和/或糖基如阿拉伯糖替代核糖的寡核苷酸，或一个带有在其3’和5’端分别连接了一个非羟基基团(在其3’端)和非磷酸基团(在其5’端)的糖基的3’，5’取代的寡核苷酸。其他修饰的寡核苷酸则在其3’和/或5’端添加了一个赋予核酸酶抗性的庞大的取代基或每个核苷酸有一个非桥联氧原子上的取代基。这类修饰可以发生在部分或所有的核苷酸间键上，也可以在寡核苷酸的任意一端或两端和/或在分子内部。制备这种修饰的寡核苷酸可见Agrawal(1994)分子生物学方法26；Uhlmann等，(1990)Chem.Rev.90543-583能自身稳定的寡核苷酸也被认为是本发明的方法中可用的修饰的寡核苷酸(Tang等，(1993)Nucleic Acids Res.202729-2735)。这些寡核苷酸包括两个区域一个与靶序列杂交区，和一个自身互补区，自身互补区具有与自身稳定的寡核苷酸中的一段核酸序列互补的寡核苷酸序列。
制备这些非修饰的和修饰的寡核苷酸的方法是现有技术中公知的(Agrawal等的综述，(1992)Trends Biotechnol 10152-158)(Uhlmann等(1990)Chem.Rev 90543-584；(1987)Tetrahedron Lett.28(31)3539-3542)；Agrawal(1994)Methods inMolecular Biology 2063-80)。
这些寡核苷酸通过获得非磷酸二酯核苷酸间键如烷基膦酸酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硫代烷基膦酸酯，氨基磷酸酯，亚磷酰胺，磷酸酯，氨基甲酸酯，碳酸酯，磷酸三酯，乙酰胺酯，羧甲基酯等增强了其稳定性。由硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯核苷酸间键连接的寡核苷酸特别有用。
给予动物的寡核苷酸可以是杂合的寡核苷酸，以便它们同时含脱氧核糖核苷酸且最少含一个2’取代的核糖核苷酸。根据本发明的目的，术语“2’-取代”指核糖分子的2’-羟基被如2’-O-烯丙基，2’-O-烷基，2’-卤素，或2’-氨基取代，但不被2’-H取代，其中烯丙基，芳基或烷基基团可以是未取代的或被卤素，羟基，三氟甲基，氰基，硝基，酯酰基，酰氧基，烷氧基，羧基，烷酯基或氨基取代。
用于本发明方法的DNA/RNA寡核苷酸可抵抗核酸降解，与RNA或DNA形成稳定的双链，并且优选在与RNA杂交时能激活RNase H活性。它们还可以额外地含至少一个未取代的核糖核苷酸。例如，本发明方法所采用的一个寡核苷酸可以是除其3’末端有一个2’取代的核糖核苷酸外，其余均为脱氧核糖核苷酸。
或者，寡核苷酸可以在其3’和5’端至少含一个取代的核糖核苷酸。
本发明的方法中所用的一类优选的寡核苷酸在一个连续的区段内含四个或更多的脱氧核糖核苷酸，以便可以提供一个RNase H的激活区段。在一些特定的实例中，一个以上的这种激活区段可以随机位于寡核苷酸内部的任意位置。本发明的寡核苷酸可以含很大部分的脱氧核糖核苷酸。事实上，这种寡核苷酸可以除一个核苷酸外，其余均由脱氧核糖核苷酸组成。因此，优选的寡核苷酸含有2到50个核苷酸，更为优选的含12到25个核苷酸，存在的脱氧核糖核苷酸的数目变化范围可从1到24。其它可用的寡核苷酸可仅由2’-取代核糖核苷酸组成。
表1列出了一些用于本发明的方法的代表性的寡核苷酸。2’-取代的核苷酸加了下划线。
表1No. 寡核苷酸1CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCU2CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTUCU3CTCTCGCACCCATCTCTCTCCUUCU4CTCTCGCACCCATCTCUCUCCUUCU5CTCTCGCACCCAUCUCUCUCCUUCU6CTCTCGCACCCAUCUCUCUCCUUCU7CTCTCGCACCCAUCUCUCUCCUUCU8CUCUCGCACCCAUCUCUCUCCUUCU9CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCU10 CUCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCU11 CUCUCGCACCCATCTCTCTCCUUCU12 CUCUCGCACCCATCTCUCUCCUUCU13 CUCUCGCACCCAUCUCUCUCCUUCU14 CUCUCGCACCCATCTCTCUCCUUCU15 CTCTCGCACCCAUCUCUCUCCUUCU16 CUCUCGCACCCAUCTCTCTCCUUCU17 CUCUCGCACCCATCTCTCTCCUUCU18 CUCTCGCACCCAUCUCUCUCCUUCU19 CUCTCGCACCCATCTCTCUCCUUCU寡核苷酸中的2’-取代核糖核苷酸可以在核糖的2’-位含有具1-6个碳原子的-O-低级烷基，含2-6个碳原子的芳基或取代芳基或烯丙基，如2’-O-烯丙基，2’-O-芳基，2’-O-烷基，2’-卤素，或2’-氨基，但不含2’-H，其中烯丙基，芳基，或烷基基团可以是未取代的或被例如卤素，羟基，三氟甲基，氰基，硝基，酰基，酰氧基，烷氧基，羧基，烷酯基或氨基基团取代。可用的取代核糖核苷酸为2’-O-烷基，如2’-O-甲基。
根据本发明，优选的寡核苷酸长度从2到50核苷酸不等，最优选的长度范围在15到25个核苷酸之间。因此，在此优选例中，本发明的寡核苷酸含14到24个非磷酸二酯键的核苷酸间键。
本发明的寡核苷酸在抑制病毒，病原体的多种基因的表达或抑制细胞基因的表达方面是十分有效的。这种抑制能力很明显对于治疗一系列疾病状态是十分重要的。因此，本发明方法的寡核苷酸含有这样一段核苷酸序列，其与来源于病毒，病原体或细胞的基因的核酸序列互补。这类优选的寡核苷酸的长度约在6到50个核苷酸之间。
根据本发明的目的，术语“与一个核酸序列互补的寡核苷酸序列”是指在生理条件下，例如根据Watson-Crick的碱基配对原理(寡核苷酸与单链核酸之间的相互作用)或Hoogsteen的碱基配对原理(寡核苷酸与双链核酸之间的相互作用)或任何其他方式如在寡核苷酸与RNA结合时的假结的形成等，与靶核酸序列结合的寡核苷酸。这种在生理条件下的结合作用(通过Watson Crick碱基配对原理)实际上是以观测核酸序列功能受到的影响作为手段来进行衡量的。
与本发明的寡核苷酸互补的核酸序列根据需要进行负调节的基因的不同而变化。在某些情况下，靶基因或核酸序列是一个病毒的核酸顺序。利用反义寡核苷酸抑制各种病毒已经广为人知(综述见Agrawal(1992)Trends in biotech.10152-158)。已有文献报道了许多病毒的与有效的反义寡核苷酸互补的核酸序列，包括人免疫缺陷性病毒1型(HIV-1)(U.S.专利4,806,463)，单纯性疱疹病毒(U.S.专利4,689,320)，流感病毒(U.S.专利5,194,428)，及人乳头瘤病毒(Storey等，(1991)Nucleic Acids Res.194109-4114)。与这些核酸序列中的任何一个互补的序列均可作为本发明的寡核苷酸，与来源于任何其它病毒的核酸序列互补的寡核苷酸序列也可作为本发明的寡核苷酸。具有已知的能合成相应反义寡核苷酸的核酸序列的其它病毒包括但不仅限于口蹄疫病毒(见Robertson等，(1985)J.Virol.54651；Harris等，(1980)Virol.36659)，黄热病毒(见Rice等(1985)Science 229726)，水痘-带状疱疹病毒(见Davison and Scott(1986)J.Gen.Virol.672279)，E-B病毒，巨细胞病毒，呼吸合胞体病毒(RSV)，及黄瓜花叶病毒(见Richards等，(1978)Virol.89385)例如，设计了一种寡核苷酸，其与HIV-1的基因一部分序列互补，因此具有很强的抗HIV效果(Agrawal(1992)Antisense Res.Development 2261-266)。已经发现这种寡核苷酸的靶序列在各种HIV-1分离物中部是保守的。它的G+C含量为56％，水溶性，在生理条件下相对稳定。此种寡核苷酸在生理条件下与一个互补的靶RNA结合，双螺旋的T值约为56℃。已在几种模型中测试了这种寡核苷酸的抗病毒活性，模型包括急慢性感染的CEM细胞，模拟体内条件的长期培养物，人外周血淋巴细胞和巨噬细胞，及从HIV-l型感染病人得到的分离物(Liszziewicz等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1992)8911209-11213)；Lisziewicz等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1993)903860-3864)；Lisziewicz等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1994)917942-7946)；Agrawal等(J.Ther.Biotech)待发表)。
另外，本发明的寡核苷酸还可具有与一种病原体的核酸序列互补的寡核苷酸序列。已有文献报道描述了很多病原体的核酸序列，包括镰状疟原虫及很多病原性细菌。与来源于任意一种病原体的核酸序列互补的寡核苷酸序列可用作本发明的寡核苷酸。具有已知的能合成相应反义寡核苷酸的核酸序列的真核病原体包括锥虫属的Trypanosom abrucei gambiense和利什曼虫(见Campbell等Nature 311350(1984))，肝片吸虫(见Zurita等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 842340(1987)。
可利用一段具有与例如来源于几丁质合成酶的核酸序列互补的寡核苷酸序列的靶杂交区域来制备抗真菌的寡核苷酸，可用例如丙氨酸消旋酶基因来合成抗细菌的寡核苷酸。根据本发明的方法可以治疗的真菌性疾病有念珠菌病，组织胞浆菌病，隐珠菌病，酵母菌病，曲霉菌病，分支孢菌病，着色芽生菌病，皮肤真菌病，和球孢子菌病。此方法也可用于治疗立克次氏体病(例如，斑疹伤寒，Rocky Mountain spottedfever)，也可治疗由砂眼衣原体或性病性淋巴肉芽肿引起的性传播疾病。本发明的方法也可治疗一系列寄生虫性疾病，包括阿米巴病，南美洲锥虫病，弓形体病，肺孢子虫病，梨形鞭毛虫病，隐孢子虫病，滴虫病，和卡氏肺囊虫肺炎；及蠕虫病，例如蛔虫病，丝虫病，旋毛虫病，血吸虫病，和线虫或绦虫的感染。疟疾可以按本发明的方法进行治疗，无论它是由P.falcip arum，P.vivas，P.orale，或P.malariae引起的。
上述感染性疾病都可以用本发明的方法进行治疗，因为这些疾病的感染原已知，因此能知道对感染原的增殖至关重要的核酸序列如一个重要的基因，从而得到与之互补的寡核苷酸序列，由此可以根据本发明制备相应的寡核苷酸。
根据本发明的方法可以进行治疗的其它疾病状态或症状是那些由于细胞基因的异常表达或异常产物导致的。这些症状可以通过给予本发明的寡核苷酸进行治疗，且在本文的前面部分已经讨论过了。
本发明的其他寡核苷酸可以具有与某个细胞基因或基因转录物互补的核苷酸序列，该细胞基因或基因转录物的异常表达或异常产物引起一种疾病状态。已经描述了几个这种细胞基因的核酸序列，包括朊病毒蛋白(Stahl.等，(1991)FASEB J.5”2799-2807)，与Alzheimer氏病有关的淀粉样蛋白(U.S.专利5,015,570)，及很多广为人知的癌基因和原癌基因，例如c-myb，c-myc，c-abl，及n-ras。此外，抑制那些在精子发生，精子活力，精子与卵细胞的结合或任何其它影响精子活力的步骤中涉及的主要结构蛋白或酶的寡核苷酸可以用作为避孕药。同样的，女用避孕药也可以是抑制那些在排卵，受精，着床，或激素的生物合成中涉及的蛋白或酶的寡核苷酸。
高血压也可以通过能负调节血管紧张素转化酶或在肾素/血管紧张素系统中相关的酶的合成的寡核苷酸来得到控制。血小板凝集可以通过抑制对于合成凝血烷A2所必需的酶的合成而得到控制，而凝血烷A2对于心肌和大脑供血循环失调，梗塞，动脉硬化，栓塞和血栓形成起着重要作用。通过抑制脂肪酸辅酶A即动脉硬化中的胆固醇酰基转移酶的合成，可以阻止胆固醇在动脉壁上的沉积。抑制磷酸胆碱转移酶的合成对于高脂血症是有益的。
有许多神经失调可用杂交捕获降低或消除这些失调带来的不良影响。如抑制单胺氧化酶的合成可用于帕金森症。抑制儿茶酚甲基转移酶可治疗抑郁症；抑制吲哚N-甲基转移酶可用于治疗精神分裂症。
抑制能导致产生前列腺素和白三烯的花生四烯酸级联反应中的特定酶可用于控制血小板凝集，过敏，发炎，疼痛和气喘。
抑制多药抗性基因(mdr-1)表达的蛋白被证明对治疗癌症有益，此蛋白与使肿瘤对一系列抗肿瘤药物产生抗性有关，因而阻碍化疗效果。与来自这些基因的任一种的核酸序列互补的寡核苷酸序列的寡核苷酸可作为本发明的寡核苷酸，那些与任何其它细胞基因的转录物互补的寡核苷酸也能用作本发明的寡核苷酸，所述的细胞基因转录物的异常表达或异常产物导致疾病状态。
本文所述的寡核苷酸以治疗性药物配制品的形式口服或肠道给予动物体，用以有效地治疗病毒感染、病原体导致的感染或由于基因异常表达或异常基因产物的表达导致的疾病。在某些情况下或按照本发明的方法，该寡核苷酸可以与其它治疗药剂，如用于AIDS治疗的AZT，联合给药。
含有寡核苷酸的治疗性药物配制品包括生理学可接受的载体，如惰性稀释剂或可吸收的可食性载体，肽与之一起给药。含有用于通过非注射途径将化合物导入血流的药物学可接受赋形剂的合适的配制品见Remingoton’s Pharmaceutical Sciences(第18版)(Genarro，ed.(1990)Mack Publishing Co.，Easton，PA)。寡核苷酸和其它成分可包裹于硬的或软的胶囊中、压成片剂、或直接掺入个人饮食中。寡核苷酸可以掺入赋形剂并以咀嚼片、口服片、片剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、干糊片等等形式应用。当寡核苷酸以口服给药时，它可以与其它的食物形式及药物学可接受的增味剂混合。当寡核苷酸以肠道摄入时，它可以固体、半固体、悬液、或乳液形式导入，并可与任意数量的常用的药物学可接受的添加剂复合。缓释的口服输送系统和/或肠道包衣的口服摄入配剂形式同样可以考虑，如US专利4,704,295，4,556,552，4,309404和4,309,406中所描述的。
此类药用组合物的寡核苷酸量是能得到适当剂量的量。制备的本发明的优选组合物和配制品是一个口服剂量单位含有每公斤动物体重50至200毫克，更为优选的是每公斤体重10至100毫克。
更理想的是，每种配剂形式的单剂中的活性成分的单位含量不一定本身达到有效剂量，因为可通过摄入多个药剂单位(如胶囊或药片或其合用)而达到有效剂量。
为了确定按照本发明的方法摄入的寡核苷酸是否被体内组织所吸收，如果是，那么被哪种组织吸收，进行了以下的研究。口服摄入放射性标记的寡核苷酸后，随时间增加分析不同机体组织样品的放射性。图1示意口服摄入放射性标记的寡核苷酸后，寡核苷酸在血浆，肝、肾中的滞留时间。这结果表明药物通过肠胃途径吸收并聚集于肾和肝。
血浆中的放射性的化学形式通过HPLC进一步分析表明，口服摄入后12小时，完整的寡核苷酸(A)和代谢物(B)均存在(图2B)。摄入后6小时(图3B)和12小时(图3C)在肝中也可测到完整的寡核苷酸。口服摄入放射性标记的寡核苷酸后48小时，在脑、胸腺、心、肺、肝、肾、甲状腺、胃、小肠、大肠、骨骼肌、睾丸、肾上腺、上皮、全眼、和骨髓中可测到放射性。
支持寡核苷酸吸收的进一步证据来自口服摄入放射性标记的寡核苷酸后的尿样分析。图4显示摄入放射性标记的寡核苷酸后的48小时内，尿中积累排泄的放射性标记的寡核苷酸。寡核苷酸的长时间连续排泄到尿中表明其它组织已有吸收，并且机体能够在较长的一段时间内吸收。图5B和5C表明虽然尿中的放射性主要存在于降解产物，但也测出了完整的寡核苷酸，这说明寡核苷酸是被完整吸收的。
为了确定口服摄入后寡核苷酸的生物利用率水平，测量了肠道途径(胃和肠)和粪便中的寡核苷酸水平。图6表明大约80％的摄入寡核苷酸存在于或排泄于粪便中，这说明20％的摄入寡核苷酸被吸收了。寡核苷酸在胃中稳定，口服摄入后6小时在胃容物中没有测到显著的降解产物(图7)。在大肠内容物中，摄入的寡核苷酸的大部分也是作为完整的化合物存在(图8)。
因此，利用本发明的方法，寡核苷酸的成功吸收可以通过肠胃途径完成，并能作用于全身。完整的寡核苷酸可在血浆和不同组织中测到并排泄至尿中。这些结果表明，通过口服摄入来输送作为治疗试剂的寡核苷酸是一可行的方法。
以下的实施例示意完成和实施本发明的优选模式，但是并非意味对本发明的范围的限制，因为变化的方法也可用以获得相似的结果。实施例1、寡核苷酸的合成与分析如下所示，合成、纯化并分析了一个杂合的25mer的硫代磷酸酯键连接的寡核苷酸，它具有SEQ ID NO1的序列并含有2’-O-甲基核糖核苷酸3’和5’序列和一个内部脱氧核苷酸。
在自动合成仪(8700型，Millipore，Bedford，MA)上，按照US专利5,148,798所述的H-膦酸酯法，以5-6μmol的量在CPG上合成未修饰的硫代磷酸酯脱氧核苷。脱氧核苷H-膦酸酯得自Millipore(Bedford，MA)。2’-O-甲基核苷酸H-膦酸酯或硫代磷酸酯以标准的程序合成(见，如Meth.Mol.Biol.(1993)Vol.20中的“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”)或商业购买(如从GlennResearch，Sterling，VA and Clontech，Palo Alto，CA)。含有2’-O-甲基核苷的寡核苷酸片段通过用2’-O-甲基核苷H-瞵酸酯经所设定的循环而装配。同样地，含有脱氧核糖核苷的寡核苷酸片段通过用脱氧核苷H-膦酸酯经所设定的循环而装配。装配后，CPG结合的寡核苷酸H-膦酸酯经硫氧化而产生硫代磷酸酯键合。寡核苷酸再在浓NH4OH中40℃ 48小时去保护。
粗制寡核苷酸(约500A600单位)在C18反向介质上经反向低压层析分析。DMT基团通过80％的乙酸处理而去除，然后寡核苷酸对蒸馏水透析并冷冻干燥。2、寡核苷酸的放射性标记为了得到35S标记的寡核苷酸，合成分为两步。SEQ ID NO1的序列的3’端起前19个核苷酸用β-氰乙基-亚磷酰胺法合成(见，用于寡核苷酸和类似物的程序中的Beaucage(Agrawal，ed.)，Humana Press，(1992)，pp.33-61)。后6个核苷酸用H-膦酸酯法装配(见，用于寡核苷酸和类似物的程序中的Froehler(Agrawal，ed.))，Humana Press，(1992)，pp.63-80)。受控孔玻璃(CPG)支持物结合的含有5个H-膦酸酯键合的寡核苷酸(30mg的CPG；约1μM)，在60ml的二硫化碳/吡啶/三乙酰胺(10∶10∶1)中经35S8氧化(4mCi，1Ci/mg，Amersham；1Ci＝37GBq)。氧化在室温下偶尔摇动地进行1小时。然后，每30分钟加入2μl，5μl，和200μl处于相同的溶剂中的预冷的5％的35S8以完成氧化。弃去溶液，用二硫化碳/吡啶/三乙酰胺(10∶10∶1)(3×500μl)和乙腈(3×700μl)清洗CPG支持物。产物于浓氨水中去保护(55℃，14小时)并蒸发。终产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(含有7M尿素的20％的聚丙烯酰胺)进行纯化。所要的条带在紫外灯下切下，从凝胶上提取PS-寡核苷酸并经Sep-Pak C18(Waters)柱和Sephadex G-15柱脱盐。产物为20A260单位(600μg；特异活性，1μCi/μg)。3、动物和处理雄性的Sprgue-Dawley大鼠(100-120g，Harlan Laboratories，Indianapolis，IN)用于本研究。实验前动物以商购的食品和水随意饲养一周。
动物通过管饲法服药，剂为50mg/kg。未标记的和35S-标记的寡核苷酸以25mg/ml的浓度溶于生理盐水(0.9％NaCl)。根据处理前的体重给药，精确到0.01ml。给药后各动物放入代谢笼中并随意喂以商购的食品和水。收集全部排尿且每个代谢笼然后在收集间隔清洗。每个动物的全部的排泄粪便在各个时间点收集，粪便样品在放射性定量前进行匀浆。动物的血样在各个时间点收集于加有肝素的管中，离心分离血浆。动物通过戊巴比妥钠麻醉后抽血无痛处死。处死后，收集各个动物的组织。所有的组织/器官都修剪去多余的脂肪或结缔组织，清除所有的内容物，分别称重并记录重量。4、总放射性测量组织和体液的总放射性通过液闪计数仪(LS6000TA，Bechman，Irvine，CA)确定。简要地，生物学液体(血浆，50-100μl；尿，50-100μl)混合以6ml闪烁液(Budget-Solve，RPI，Mt Prospect，IL)从而测定总放射性。粪便先碾磨和称重，然后在9倍体积的0.9％的NaCl溶液中匀浆。一份的匀浆液(100μl)和增溶剂(TS-2，RPI，Mt.Prospect，IL)混合，然后混合以6ml闪烁液从而对总放射性定量。
摘除后，组织立刻用Whatman 1号滤纸吸干并称重，然后于0.9％的NaCl溶液中匀浆(3-5ml/g湿重)。匀浆液与增溶剂(TS-2，RPI，Mt.Prospect，IL)混合，再混合以6ml闪烁液从而对总放射性定量。记录下加入到每个组织样品中的0.9％的NaCl溶液的体积。匀浆后的组织/器官冻存于-70℃以备进一步分析用。5、HPLC分析基本上按照Sands等所述(Mol.Pharm.(1994)45932-943)的方法并加以修改，通过配对-离子HPLC对尿中的放射性进行分析。分析之前尿样品经离心并通过0.2μm的Acro滤器(Celman，Ann Arbor，MI)。血浆样品中的杂合的寡核苷酸及代谢物通过上述的为PAGE制备样品的方法进行抽提。使用Microsorb MV-C4柱(RaininInstruments，Woburn，MA)在Hewlett Packard 1050 HPLC仪进行HPLC，该仪器有一个四泵头的泵进行梯度的制备。流动相包括两种缓冲液；缓冲液A为5mM A试剂水溶液(Waters Co.，Bedford，MA)；缓冲液B为4∶1(V/V)的乙腈(Fisher)/水。柱子以流速1.5ml/分钟，按下列梯度洗脱(1)0-4分钟，0％的缓冲液B；(2)4-15分钟，0-35％的缓冲液B；和(3)15-70分钟，35-80％的缓冲液B。再次运行前柱子用缓冲液A平衡至少30分钟。用一个RediFrac组分收集器(Pharmacia LKBBiotechnology，Piscataway，NJ)将1分钟的收集液(1.5ml)收集入7ml的闪烁管中，混合以5ml的闪烁液进行每一组分的放射性测定。
等价物本领域的熟练人员，仅仅通过常规实验，将会识别或能够确定大量的与本发明在此所述的具体物质和步骤的等价物。这些等价物被认为属于本发明的范围之内，并在下面的权利要求中所涵盖。
序列表(1)一般信息(i)申请人海布里登公司(ii)发明名称一种负调节基因表达的方法(iii)序列数目1(iv)联系地址(A)收信人Lappin&Kusmer(B)街道200 State Street(C)城市Boston(D)州马萨诸塞州(E)国家USA(F)邮政编码02109(v)计算机阅读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIN Relase#1.0#1.25版(vi)本申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类(viii)律师/代理人信息(A)姓名Kerner，Ann-Louise(B)注册号33,523(C)参考/案号HYZ-030PCT(ix)电讯信息(A)电话617-330-1300(B)电传617-330-1311(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度25碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子类型cDNA/RNA(iii)假设无(iv)反义是(xi)序列描述SEQ ID NO1CUCUCGCACCCATCTCTCTCCUUCU
权利要求
1.一种负调节动物的某一基因的表达的方法，该方法包括口服给予一种药物配制品，该药物配制品包括存在于药物学可接受的载体中的与该基因互补的寡核苷酸，该寡核苷酸具有非磷酸二酯键的键合且含有至少一个2’-取代的核糖核苷酸，该寡核苷酸抑制该基因产物的表达，从而对该基因的表达起负调节作用。
2.如权利要求1所述的方法，其中寡核苷酸具有3’和5’末端，且2’-取代的核糖核苷酸位于3’末端。
3.如权利要求2所述的方法，其中寡核苷酸进一步在5’末端含有至少一个2’-取代的核糖核苷酸。
4.如权利要求1所述的方法，其中寡核苷酸的所有核糖核苷酸均为2’-取代的核糖核苷酸。
5.如权利要求1所述的方法，其中2’-取代的核糖核苷酸为2’-O-烷基-核糖核苷酸。
6.如权利要求1所述的方法，其中寡核苷酸含有至少一个脱氧核糖核苷酸。
7.如权利要求6所述的方法，其中寡核苷酸含有一个能激活RNase H活性的至少四个连续脱氧核糖核苷酸的区域。
8.如权利要求1所述的方法，其中寡核苷酸含有一个选自如下一组的核苷酸间键合烷基膦酸酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硫代烷基膦酸酯，氨基磷酸酯，亚磷酰胺，磷酸酯，氨基甲酸酯，碳酸酯，磷酸三酯，乙酰胺化物，羧甲基酯。
9.如权利要求8所述的方法，其中基本上所有的核苷酸均通过硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯核苷酸间键合连接。
10.如权利要求1所述的方法，其中寡核苷酸经过修饰。
11.如权利要求1所述的方法，其中寡核苷酸与病毒的基因、病原体的基因或细胞基因互补。
12.如权利要求11所述的方法，其中寡核苷酸与下述疾病相关的病毒的基因互补AIDS，口腔或单纯疱疹，乳头疣，流感，口蹄疫，黄热病，鸡瘟，带状疱疹，成人T-细胞白血病，Burkitt氏淋巴瘤，鼻咽癌，或肝炎。
13.如权利要求1所述的方法，其中寡核苷酸与编码Alzheimer氏病相关蛋白的基因互补。
14.如权利要求1所述的方法，其中寡核苷酸与编码在寄生虫中表达的蛋白的基因互补，这种寄生虫可以引起寄生性疾病例如阿米巴病，南美洲锥虫病，弓形体病，肺孢子虫病，梨形鞭毛虫病，隐孢子虫病，滴虫病，疟疾，蛔虫，丝虫病，旋毛虫病，或血吸虫病感染。
15.如权利要求1所述的方法，其中的寡核苷酸与编码HIV基因互补且包括15到26个由硫代磷酸酯核苷酸间键连接的核苷酸，最少有一个3’端的核苷酸为2’-取代的核苷酸，至少有4个核苷酸是连续的脱氧核糖核苷酸。
全文摘要
本发明公开了一种负调节动物的基因表达的方法,其中将一种包含与该基因互补的寡核苷酸的药物配制品口服给予动物。给予的寡核苷酸含有非磷酸二酯键的核苷酸间键合,且至少含有1个2′取代的核糖核苷酸,该寡核苷酸抑制基因产物的表达,因而负调节该基因的表达。
文档编号A61P31/12GK1170367SQ95196839
公开日1998年1月14日 申请日期1995年10月17日 优先权日1994年10月25日
发明者苏迪尔·阿格雷瓦尔, 罗伯特·B·迪亚西奥, 张瑞稳 申请人:海布里登公司