专利名称：软骨发育不全致病基因突变检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型提供了一种软骨发育不全致病基因突变检测试剂盒，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
成纤维细胞生长因子受体3(fibroblast growth factor receptor3, FGFR3)位于4pl6.3，cDNA长4. 4kb，编码840个氨基酸残基组成的蛋白，包含19个外显子和18个内含子。FGFR3是骨骼发育过程中重要的调控分子，主要通过抑制软骨细胞增生、分化来抑制软骨形成过程，其功能增强型点突变可以导致软骨发育不全。软骨发育不全是小儿遗传性侏儒症中最常见的类型，发病率为1/15000 1/26000，呈常染色体显性遗传，该病外显率为100%。目前国外以及中国台湾地区报道的突变，97%以上位于FGFR3基因第10外显子的1138位核苷酸，其中95%为G — A的碱基转换，其余为G — C的颠换；两种突变都导致了FGFR3第380位甘氨酸残基被精氨酸残基取代。研究显示FGFR3跨膜区基因1138位核苷酸突变后，引发FGFR3功能持续地、不依赖配体地激活，突变的受体拒绝配体介导的调控，引起FGFR3负向调控骨骼的生长，进而导致软骨发育不全。本实用新型将样本采集、软骨发育不全致病基因突变体检测整合在一个试剂盒内，使用更方便快捷，且成本更低。本实用新型基于直接测序技术，可以对PCR产物直接进行DNA序列分析，明确突变位点，是现有基因突变检测方法中最直接最准确的方法，且可以实现机械化自动化，使测序工作更加简便快捷，结果判读更直观。发明内容本实用新型提供了一种软骨发育不全致病基因是否发生突变的检测试剂盒，包括包装盒体(I)，包装盒体(I)内的中间设有口腔拭子(2)，一侧设有样本保存管(3)、含有正向引物的试管(4)、含有反向引物的试管(5)、另一侧设有含有PCR扩增试剂的试管(6)、含有PCR产物纯化试剂的试管(7)和含DNA测序试剂的试管(8)。能够快速检测软骨发育不全致病基因的突变体。为实现以上目的，本实用新型提供了一种软骨发育不全致病基因突变检测试剂盒，其特征在于将样本采集、软骨发育不全致病基因突变体检测整合在一个试剂盒内，使用更方便快捷，且成本更低。步骤1.采集检测样品用口腔拭子⑵在被测者口腔左右两腮分别各上下刮20次，保证采集到足量的细胞样本，采集完毕，样本保存于样本保存管(3)中。步骤2.采用硅胶吸附法抽提样本的基因组DNA。步骤3:PCR扩增PCR 扩增试剂(6)(总体积为 Iml)的成分包含20mM Tris-HCL(PH8. O)、IOOmMKCL、500uM dNTPs、3mM MgCl2 溶液、0.1U Taq DNA 聚合酶/ul。检测在ABI9700型PCR扩增仪上进行，每个样本分为I个反应孔，每个反应孔放入FGFR3正反向引物(4) (5)各0.5ul (引物浓度为lOumol/L)，加入检测样品2ul，PCR反应液7. 5ul,去离子水4. 5ul,反应孔总体积15ul。反应条件为95°C预热10分钟；再进行35个循环的95°C、45秒，60°C、45秒，72°C、60秒；72°C、7分钟后，降温至4°C。步骤4 =PCR产物纯化每一个反应孔反应体系总体积为7ul，由PCR产物纯化试剂4ul和PCR产物3ul组成。反应条件为37°C、60分钟；80°C、15分钟。步骤5 DNA测序反应每一个反应孔反应体系总体积为5ul，由PCR纯化产物Iul、DNA测序试剂Iul、测序引物Iul和去离子水2ul组成。反应条件为96°C 2分钟；25个循环的96°C、10秒；50°C、5 秒；60°C、4 分钟；60°C、4 分钟。反应结束后每管加入Iul 125mM乙二胺四乙酸EDTA和无水乙醇15ul，室温沉淀15分钟；3650转/分，4°C离心30分钟，轻轻倒去上清液；每孔加30ul 70%乙醇，3650转/分，4°C离心15分钟，倒去上清液；室温放置20分钟后加入HIDI溶液8ul，上测序仪。步骤6:结果分析在测序仪上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果。
图1为本实 用新型的结构示意图；图2为FGFR3基因第10号外显子实验无突变结果示意图；图3为FGFR3基因第10号外显子实验有突变结果示意具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。实施例步骤1.采集检测样品用口腔拭子⑵在被测者口腔左右两腮分别各上下刮20次，保证采集到足量的细胞样本，采集完毕，样本保存于样本保存管(3)中。步骤2.采用硅胶吸附法抽提样本的基因组DNA。步骤3:PCR扩增PCR 扩增试剂(6)(总体积为 Iml)的成分包含20mM Tris-HCL(PH8. O)、IOOmMKCL、500uM dNTPs、3mM MgCl2 溶液、0.1U Taq DNA 聚合酶/ul。检测在ABI9700型PCR扩增仪上进行，每个样本分为I个反应孔，每个反应孔放入FGFR3正反向引物(4) (5)各O. 5ul (引物浓度为lOumol/L)，加入检测样品2ul，PCR反应液7. 5ul,去离子水4. 5ul,反应孔总体积15ul。反应条件为95°C预热10分钟；再进行35个循环的95°C、45秒，60°C、45秒，72°C、60秒；72°C、7分钟后，降温至4°C。每一个反应孔反应体系总体积为7ul，由PCR产物纯化试剂4ul和PCR产物3ul组成。反应条件为37°C、60分钟；80°C、15分钟。[0036]每一个反应孔反应体系总体积为5ul，由PCR纯化产物Iul、DNA测序试剂Iul、测序引物Iul和去离子水2ul组成。反应条件为96°C 2分钟；25个循环的96°C、10秒；50°C、5 秒；60°C、4 分钟；60°C、4 分钟。 反应结束后每管加入Iul 125mM乙二胺四乙酸EDTA和无水乙醇15ul，室温沉淀15分钟；3650转/分，4°C离心30分钟，轻轻倒去上清液；每孔加30ul 70%乙醇，3650转/分，4°C离心15分钟，倒去上清液；室温放置20分钟后加入HIDI溶液8ul，上测序仪。步骤4:结果分析在测序仪上进行结果读取，用软件ChiOmas查阅测序检测结果。1.未检出突变未发现FGFR3基因存在突变，分析结果如图2所示；2.检出突变发现FGFR3基因第10外显子上存在G1138A点突变，分析结果如图3所示。
权利要求1.软骨发育不全致病基因突变检测试剂盒，其特征是由包装盒体(I)，包装盒体(I)内的中间设有口腔拭子(2)，一侧设有样本保存管(3)、含有正向引物的试管(4)、含有反向引物的试管(5)、另一侧设有含有PCR扩增试剂的试管￠)、含有PCR产物纯化试剂的试管(7)和含DNA测序试剂的试管⑶。
专利摘要本实用新型提供了一种软骨发育不全致病基因是否发生突变的检测试剂盒，包装盒体(1)，包装盒体(1)内的中间设有口腔拭子(2)，一侧设有样本保存管(3)、含有正向引物的试管(4)、含有反向引物的试管(5)、另一侧设有含有PCR扩增试剂的试管(6)、含有PCR产物纯化试剂的试管(7)和含DNA测序试剂的试管(8)。试管排列位置固定如图1所示。能够快速检测软骨发育不全致病基因的突变体，可应用于软骨发育不全的早期诊断和产前筛查。
文档编号C12Q1/68GK202865231SQ2012203748
公开日2013年4月10日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者卞雪莲, 张奕, 王校 申请人:上海中优医药高科技有限公司