专利名称：降钙素原多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及刺激成骨细胞和前成骨细胞增生的多肽、该多肽的制造方法、含有该多肽的治疗组合物以及促进哺乳动物骨生长的方法。
骨的生长、保养和修复涉及骨的生成和消溶速率之间的平衡。这两种过程(统称为“再造”)通过一些激素和生长因子进行调节，这些激素和生长因子包括甲状旁腺素、降钙素、胰岛素、促生长因子、甲状腺素、糖皮质激素、维生素D、雄激素、雌激素、表皮生长因子、转化生长因子β、成纤维细胞生长因子和血小板衍生的生长因子。这些化学信使影响成骨细胞和前成骨细胞(骨生成细胞)以及破骨细胞(骨消溶细胞)的发育和活性。骨的再造与骨骼起一种矿质库的作用有关，并与其保持细胞活力、流体交换和骨的强度所起的作用有关。骨代谢的不平衡会导致骨质疏松症和其他疾病。Raisz和Kream(NewEngl.J.Med.30929-35，83-89，1983)及Raisz(NewEngl.J.Med.318818-827，1988)对骨的再造过程作了评论。
虽然健康人通常无需借助药物就能使骨生长和使骨折愈合，但在某些情况下，骨头会变弱或不能完全愈合。例如，老年人和经受皮质类固醇治疗的病人(如移植病人和那些正进行慢性肺病治疗的人)骨折愈合均很慢。而且，骨质疏松症患者往往因骨代谢的不平衡而导致骨折和残废。
通常用雌激素、降钙素、钙、氟化钠、磷酸氢盐或它们的混合物治疗骨质疏松症。这些治疗方法不能根除病因，而且疗效有限。用雌激素治疗会使子宫内膜癌的危险率增加。雌激素的使用是受限制的，因为只有一小部分55岁以下的妇女会发生反应，对年龄更大的人来说，骨头没有对雌激素的反应性。氟化钠的用法正在研究中，但还未被认可。而且，在氟化物刺激下生成的骨可能是畸形的。此外，施用氟化物会产生很大的毒性。单独施用钙是无效的，除非饮食中明显缺钙。即使在缺钙的情况下，用钙治疗的好处也只限于缺少补充维生素D的情况。用降钙素治疗似乎会减少骨的消溶，但骨质的任何增加都可能是暂时的。降钙素最后失效被认为是由成骨细胞活性减少而导致的，后者则是骨生成和消溶相偶联的结果。这不能证明降钙素能减少骨质疏松症患者发生骨折的频率。多种副作用，包括肠胃不适和鼻子出血可限制降钙素的使用。最后，用促生长因子(类腺岛素生长因子)治疗骨质缺乏症可能会发生并发症和副作用，因为这些生长因子对软组织细胞会发生作用。
技术上仍需要能促进骨生成和/或逆转骨损伤的物质。本发明提供的多肽具有这种活性，还具有其他有关的优点。
简单地说，本发明公开了已分离的多肽和编码能刺激成骨细胞和前成骨细胞增生的多肽的DNA顺序。该多肽一般具有如下特征，(a)它们的长度至少为12个氨基酸;(b)它们至少与大鼠N-降钙素原(N-proCT)的一部分基本同源;以及(c)在最能刺激成骨细胞和前成骨细胞的浓度下，与成纤维细胞相比，它们可使成骨细胞和前成骨细胞中DNA合成至少增加两倍。一方面，本发明的肽具有的氨基酸顺序选自由下列构成的一组大鼠、人、鸡和鲑鱼N-proCT以及与大鼠、人和鸡N-降钙素原基因相关的肽(N-proCGRP)顺序，如
图1所示。为方便和清楚起见，本发明的多肽一般根据与大鼠N-proCT的同源性定义。但应该明白，本发明还包括由其他物种衍生的多肽以及这些多肽的衍生物。第二方面，本发明肽具有的氨基酸顺序选自由下列构成的一组(a)VPLRSTLESSPG;(b)APFRSALESSPA;(c)APVRPGLESITD;和(d)APARTGLESMTD。第三方面，本发明肽的长度小于32个氨基酸。
第四方面，本发明公开了刺激成骨细胞和前成骨细胞分裂的肽的分离方法。该方法一般包括(a)制备能表达降钙素或降钙素相关基因的细胞的含水提取物;(b)分离该含水提取物以富集分子量约小于15000的多肽;和(c)用疏水层析和/或阴离子交换层析分离已富集的组分，以从富集组分中分离肽。在本发明的一种优选方案中，分离含水提取物的步骤包括使含水提取物进行反相HPLC和凝胶过滤。本领域的普通技术人员应当明白，改变各步骤的顺序基本上不会影响所需要的结果。
本发明还公开了用一种表达载体转染或转化的宿主细胞，该表达载体含有以可操作的方式连接于编码上述肽的DNA顺序的转录启动子。上述的合适宿主细胞包括酵母宿主细胞。
第五方面，本发明公开了刺激成骨细胞和前成骨细胞分裂的肽的制造方法。该方法一般包括(a)将一个表达载体导入宿主细胞中，该表达载体含有以可操作方式连接编码具有上述特征的肽的DNA顺序的转录启动子;(b)在合适的条件下培养该宿主细胞;和(c)从该宿主细胞中分离肽。
第六方面，本发明提供的治疗组合物含有上述的一种肽和与肽混合的生理上可接受的载体或稀释剂。该治疗组合物可用来促进病人的骨生成。在该方法中，可将该组合物从鼻内加入或注射。在一种具体方案中，组合物可进一步包含有效量的一种物质，加雌激素、氟化钠、降钙素或磷酸氢盐。在另一具体方案中，组合物还可包含一种生长因子，如胰岛素、一种类胰岛素生长因子、血小板衍生的生长因子、转化生长因子α、转化生长因子β或表皮生长因子，它们的用量足以进一步增加成骨细胞和前成骨细胞中的DNA合成。
参看下面的详细说明和附图将对本发明的上述及其他方面一目了然。
图1说明刺激成骨细胞和前成骨细胞生长的典型多肽的氨基酸顺序。方框表示相同的氨基酸顺序。星号表示为使同源性达到最大而引入的空隙。数字表示大鼠的顺序。除非另有表示，N-proCGRP顺序相应于不同的N-proCT顺序。还没有鲑鱼降钙素基因相关肽(CGRP)顺序的报道。用标准的单字母符号命名氨基酸。
图2表示用针对大鼠N-proCT最后6个残基(NCAP)的抗血清，对系列稀释的合成多肽和甲状腺细胞提取物(Ext)进行免疫测定的结果。
图3表示用针对大鼠降钙素原前面12个氨基酸残基(NTP)的抗血清，对系列稀释的肽和大鼠肿瘤细胞(样品)进行免疫测定的结果。倒三角形表示降钙素、C-proCT、NCAP、CGRP和生长激素抑制素。
图4表示从甲状腺肿瘤细胞提取物中分离多肽的反相高效液相层析分离图。使用A300A/辛基反相HPLC柱;收集1ml的组分，干燥后检测免疫反应性NCAP(圆圈)和免疫反应性NTP(方块)。虚线表示乙腈梯度。
图5表示由大鼠髓甲状腺癌(MTC)中得到的部分纯化的N-proCT的凝胶过滤结果。箭头表示分子量标记。N-proCT为7.4KDa峰，该峰同时具有NTP(方块)和NCAP(圆圈)免疫活性。
图6表示典型的降钙素衍生肽对于鸡成骨细胞和前成骨细胞的促有丝分裂作用。圆圈表示合成的NTP-Tyr〔proCT(1-12)-Tyr〕;倒三角形表示合成的降钙素。
图7表示部分纯化的大鼠N-proCT对鸡(A)和大鼠(B)成骨细胞和前成骨细胞的促有丝分裂作用。
图8表示用部分纯化的N-proCT和降钙素对大鼠皮肤细胞和鸡骨细胞的促有丝分裂作用的检测结果。
图9表示纯化的合成人N-proCT对培养的鸡成骨细胞和前成骨细胞的促有丝分裂作用。
图10表示合成的人N-proCT对于从骨关节炎患者制得的人成骨细胞(a)和人骨肉瘤细胞(b)的促有丝分裂作用。
图11表示由含有酵母优选密码的寡核苷酸构成的大鼠N-proCT的编码顺序。
图12为大鼠N-proCT编码顺序的装配图。
图13表示N-proCT的酵母表达载体的构建。
图14表示质粒PCPOT和PDPOT。
图15表示用于生产降钙素原衍生的多肽的几种酵母表达载体。
图16表示用重组N-proCT检测对于鸡骨细胞致有丝分裂作用的结果。对于每一个试验条件，结果表达为平均±标准误差(n＝4-6)。
图17表示啤酒酵母TPI1启动子的亚克隆。
图18表示质粒PMVR1的构建。
图19表示MATa2操纵基因顺序被插入TPI1启动子中。
图20表示质粒PSXR109、PSXR110、PSXR111和PSXR112的构建。
图21表示用N-proCT处理的小鼠和未经处理的对照小鼠骨生长比较试验的结果。
本发明提供的各种多肽特别可刺激成骨细胞和前成骨细胞的增生，因此可用于促进哺乳动物骨的生长。按本发明的优选方案，这些多肽可从降钙素原或proCGRP的氨端区域衍生。它们可被重新合成，从天然产生它们的合适细胞或组织中分离，或通过DNA重组技术制成。
降钙素是一种由甲状腺的C细胞生成的32-残基的肽激素，也由某种甲状腺肿瘤大量生成。该激素可抑制成骨细胞的活性，并通过这种机制减少血中的钙含量。降钙素是根据高钙量和其他营养信号而分泌的。用高脂肪食物喂养的大鼠产生的降钙素增加，表明它能参与脂肪代谢。注射大剂量的降钙素可抑制食欲，还具有止痛作用。
与生物合成其他小肽激素的情况一样，降钙素是由一种大激素原产生的(Roos等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.601134-1140，1974)。降钙素原首先是在大鼠中进行特征鉴定的(Jacobs等人，Science213457-459，1981，Amara等人，J.Biol.Chem.2572129-2132，1982);现在已知道大鼠顺序结构上与人和小鸡前体的顺序相似(Gkonos等人，J.Biol.Chem.26114386-14391，1986;Lasmoles等人，EMBOJ.102603-2607，1985)。大鼠降钙素原有111个残基(Birnbaum等人，J.Biol.Chem.2592870-2874，1984);降钙素顺序(proCT60-91)居于前体内，通过邻接的多元裂解位点与氨基及羧基端分开。为研究降钙素生物合成和分泌而发展的富含降钙素的细胞系，证实了产生降钙素和C端16肽(C-proCT)是加工降钙素原的一种主要途径(Birnbaum等人，J.Biol.Chem.261699-703，1986;Birnbaum等人，J.Biol.Chem.257241-244，1982;Muszynski等人，J.Biol.Chem.25811678-11683，1983)。
降钙素基因表达的研究(Amara等人，Nature298240-244，1982)表明该基因编码两个不同的分泌多肽。第二个称为“降钙素基因相关肽”或“CGRP”，它是由不同的RNA拼接产生的。成熟的CGRP由37个氨基酸组成。生成多肽的前体(降钙素原和proCGRP)其前面51个氨基酸残基是相同的。与降钙素一样，CGRP是通过多元裂解位点与它的氨基和羧基端邻接顺序分开。CGRP(至少在高剂量时)也能降低血钙和抑制骨的消溶。降钙素和CGRP有各自的细胞受体，但它们均能与另一者的受体相结合(Roos等人，Endocrinology11846-51，1986)。已提出用CGRP和CGRP的类似物降低血压和减少胃酸分泌(Evans等人，US4530838和US4549986)。
直接或间接的证据表明，至少存在有另外三种降钙素相关的人基因或假基因。Fischer等人(J.Clin.Endocrinol.Metab.571314-1316，1983)鉴定了人体甲状腺和大脑中具免疫活性的类鲑鱼降钙素物质。Steenbergh等人(A.Pecile编，Calcitonin1984，Elsevier，1985，P.23)提出存在人降钙素假基因。Steenbergh等人(FEBSLett.20997，1986)分离并表征了人CGRP-Ⅱ的一种基因，看来它不能进行另一种表达以产生一种类降钙素肽。现在还有迹象表明存在第三种人降钙素相关基因(ThesisofJ.W.M.Hoppener，UniversityofUtrecht，“人降钙素/CGRP基因”，1988年4月12日)。
发明人发现，通过降钙素原和proCGRP的加工产生稳定的N端多肽(分别称为N-proCT和N-proCGRP)，该多肽长度约为52-57个氨基酸，这取决于前体蛋白质。当进行标准的致有丝分裂作用测定时，发现这些多肽对成骨细胞和前成骨细胞具有特异的细胞增生活性。而且，发现由一个物种产生的多肽对另一物种的成骨细胞和前成骨细胞具有特异的细胞增生活性。
如上所述，已分离和表征了许多物种的降钙素和CGRP，这些物种包括人、大鼠和小鸡，以及鲑鱼降钙素。还研究了编码这些多肽的基因和cDNA顺序。这些研究表明降钙素和CGRP是由相同基因编码的，而且是由不同的RNA拼接产生的。而且，还在人体中鉴定了已知只在肿瘤中表达的一种降钙素假基因和一种类鲑鱼降钙素肽。本发明的多肽可相应于由这些降钙素基因产物的任一前体衍生的氨基酸顺序。典型的多肽包括人、鸡、大鼠和鲑鱼N-proCT(54或57个氨基酸)以及人、鸡和大鼠N-proCGRP(52或55个氨基酸)，其顺序如图1所示。本发明的多肽还包括降钙素原和proCGRP的氨基端部分的片段。例如，现已发现来自降钙素原氨端的12氨基酸片段对成骨细胞和前成骨细胞具有意想不到的特异的促细胞分裂活性。本发明包括这种12氨基酸片段和具有此12残基氨端顺序的较大的降钙素原衍生多肽。该多肽最好包括31氨基酸多肽，它来自人、鸡、大鼠和鲑鱼N-proCT以及人、鸡和大鼠N-proCGRP的氨基端。用蛋白水解酶或溴化氰(CNBr)分裂N-proCT或N-proCGRP可产生另外的生物活性多肽。例如，CNBr分解人的N-proCT可产生36和21氨基酸的多肽。本领域的普通技术人员应该知道，氨基酸顺序的小变化不会改变这些多肽的实用性质。这种变化包括氨基酸的取代和缺失，可以由遗传性多态现象或物种多样性而产生，或通过遗传工程引入该多肽中。当引入变化时，一般最好保留如图1所示的具有高度种间同源性的那些顺序，并避免该多肽的化学性质(如电荷、疏水性等)产生较大的变化。如上所述，本发明的多肽一般根据大鼠N-proCT而定义。一般来说，本发明的多肽与大鼠N-proCT的一部分基本上同源，一般至少约有40%同源性，这反映了图1所示的种间同源性程度。该多肽最好与人N-proCT的一部分基本同源，后者与大鼠N-proCT约有60%的同源性。关于这一点，该多肽最好与大鼠N-proCT氨端最多32个氨基酸中的至少一部分，即大约10个邻接氨基酸基本上同源。
本发明的多肽可从天然产生它们的组织或培养细胞中分离，也可用普通的化学方法合成，或通过DNA重组技术产生。
已知能产生可回收量降钙素、CGRP或相关基因产物的细胞和组织可用作多肽源。合适的细胞包括正常和赘生性C细胞和脑细胞。一种最好的赘生性C细胞源是1-2-4髓甲状腺癌，已由Roos等人(Endocrinology10526-32，1979)所公开。用一种含水缓冲剂从细胞或组织中提取多肽。最好使组织绞碎，并用浓度约为1-2N的一种有机酸热溶液提取多肽。提取温度最好至少为70℃，沸腾温度更好。在一个尤其优选的实施方案中，将组织糜加入约10-20倍体积的1.5N乙酸中，并煮沸20-30分钟。然后冷却所得到的匀浆，从含水提取物中分离不溶解的物质和脂质，最好用离心法分离。然后最好以二步法根据大小分离含水提取液，即分批式反相层析和凝胶过滤法。优选的层析基质为C-18二氧化硅。然后用一种合适的有机溶剂从基质中洗脱多肽。一般在VydacC-18、宽口、30微米二氧化硅的5克柱中进行分离，该二氧化硅已用90%乙腈/0.1%三氟乙酸(TFA)活化，并用0.1%TFA的溶液平衡。样品上柱后，先用25ml0.1%TFA，再用50ml20%乙腈/0.1%TFA洗涤柱子。用45%-90%乙腈/0.1%TFA洗脱N-proCT。然后使部分纯化的肽干燥，并溶于6M胍中，用凝胶过滤法进一步纯化。一种优选的凝胶过滤基质是SephadexG-50(Pharmacia，Piscataway，NJ)。用培养的骨细胞通过免疫测定和/或活性试验测定含有本发明多肽的组分。凝胶过滤峰再用疏水色谱，如反相高效液相色谱分离。关于这一点，特别优选的色谱基质是C-8二氧化硅，10微米反相树脂(Whatman)。从C-8二氧化硅中以37%乙腈洗脱N-proCT，而且能够通过35%-40%乙腈/0.1%TFA的梯度流洗80分钟，以将其从其他蛋白质中分离。最好通过免疫测定检测峰组分。若需要的话，再用常规方法，如阴离子交换层析、高效液相层析和免疫亲和层析作进一步纯化。或者先用免疫亲和层析再用高效液相层析纯化该多肽。
可用常规的化学方法合成短于大约20-32个氨基酸的多肽。已公开的肽合成方法有例如，Merrifield(J.Am.Chem.Soc.852149-2154，1963)和Houghten(Proc.Natl.Acad.Sci.USA825131-5135，1985)。也可从各种市售来源得到多肽，这些市售来源包括PeninsulaLaboratories(Belmont，Calif)，BachemBioscience，Inc.(Philadelphia，Pa.)，Biosearch，Inc.(SanRafael，Calif.)及AppliedBiosystems(FosterCity，Calif.)。
最好用遗传工程细胞制备本发明的多肽。在细菌、真菌细胞和培养的高等真核细胞中生产重组蛋白质和多肽的方法为已有技术。简单地说，将编码所研究的肽的DNA顺序与合适的转录启动子相连接，并与其他成分(转录终止子、多聚腺苷酸信号、增强子、选择标记等)一道插入载体中，并根据所选用的宿主细胞类型进行选择。合适成分的选择、表达载体的构建以及宿主细胞的转化或转染均为普通技术人员所公知。
编码本发明多肽的DNA顺序最好是合成的。使用合成的寡核苷酸时，可根据宿主细胞的偏爱选择密码子。合成DNA的方法已被如Caruthers等人(US4458066)和Itakura等人(Science1981056-1063，1977)公开，但一般最好是自动合成。一般说来，制备长约50-60碱基的寡核苷酸是方便的。设计寡核苷酸对时，应使得退炎后产生重迭的互补末端，这样则有利于较长顺序的装配。然后连接重迭片段以产生较长的顺序。
合适的DNA顺序也可通过编码降钙素或CGRP前体的cDNA或基因组克隆的酶促消化而获得。该克隆已被Amara等人(Nature 298240-244，1982)、Amara等人(J.Biol.Chem.2572129-2132，1982)和Birnbaum等人(J.Biol.Chem.2585463-5466，1983)所公开。
用于进行本发明的原核宿主细胞最好是大肠杆菌的菌株，但也能用芽孢杆菌(Bacillus)和其他属的菌株。转化这些宿主和表达克隆于其中的外源DNA顺序的方法是现有技术(参见如Maniatis等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，冷泉港实验室，1982)。用于在细菌宿主中表达克隆的DNA顺序的载体一般含有一种选择标记，如一种抗菌素抗性的基因，以及能在该宿主细胞中起作用的启动子。合适的启动子包括trp(Nichols和Yanofsky，Meth.Enzymol.101155-164，1983)、lac(Casadaban等人，J.Bacteriol.143971-980，1980)和入噬菌体(Queen，J.Mol.Appl.Genet.21-10，1983)启动子体系。可用于转化细菌的质粒包括PBR322(Bolivar等人，Gene295-113，1977)、PUC质粒(Messing，Meth、Enzymol.10120-78，1983;Vieira和Messing，Gene 19259-268，1982)、PCQV2(Queen，同上)及其衍生物。质粒可含有病毒和细菌二者的成分。
真核微生物，如啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)或丝状真菌〔如曲霉属(Aspergillus)、脉孢菌属(Neurospora)〕也可用作本发明的宿主细胞。啤酒酵母是一种特别好的宿主。在文献中，转化酵母的方法是众所周知的，如Beggs(Nature 275104-108，1978)和Mackay(Meth.Enzymol.101325-343，1983)已作叙述。按已知方法，如Yelton等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA811740-1747，1984)可转化曲霉属。合适的酵母表达载体包括YRP7(Struhl等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA761035-1039，1979)、YEP13(Broach等人，Gene 8121-133，1979)、PJDB249和PJDB219(Beggs，同上)及其衍生物。这些载体一般含有一种选择标记，如营养标记LEU2，它可在携有Leu2突变的宿主菌株中选择出，或最好包含一种“必要基因”，如Kawasaki和Bell(EP171142)所述。必要基因标记最好是粟酒裂殖酵母的三糖磷酸异构酶基因(POT1基因)，它能够使培养在富含葡萄糖基质中的缺乏三糖磷酸异构酶的宿主细胞中的质粒稳定地维持下去。含有这种POT1选择标记的表达载体包括PCPOT(ATCC39685)、PMPOT2(ATCC67788)及其衍生物。在这些载体中，所插入的表达单元的转录方向最好与POT1基因的方向相反。可用于酵母表达载体中的优选启动子包括来自酵母糖酵解基因的启动子(Hitzeman等人，J.Biol.Chem.25512073-12080，1980;Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Genet.1419-434，1982;Kawasaki US4599311)或来自乙醇脱氢酶(ADH)基因的启动子(Young等人，Genetic Engineering of Microoganisms for Chemicals，Hollaender等人编，New YorkPlenum，1982，p.335;Ammerer，Meth.Enzymol.101192-201，1983;Russell等人，Nature 304652-654，1983)以及这些启动子的衍生物和变异体。衍生物和变异体包括天然发生的突变型启动子(如ADH2-4C)、由基因工程产生的杂交启动子(见例如Bitter，WO86/06077;Rosenberg等人，EP164556)和其他基因工程衍生物。一般说来，这种衍生物与其亲本启动子相比具有增强的启动子强度或改变的调节性。特别好的组成启动子是三糖磷酸异构酶(TPI1)启动子和ADH2-4C启动子。特别好的调节启动子包括野生型ADH2启动子和温度调节型杂交启动子。温度调节型杂交启动子的构建方法如美国专利申请889100和036823中所述，即将一个或多个、最好是二个或多个拷贝的酵母接合型调节成分插入启动子如TPI1启动子中而构成。所得到的杂交启动子被用于一种宿主细胞中，该宿主细胞能以温度敏感方式表达接合型成分。就此而言，合适的酵母宿主细胞包括温度敏感的sir和ste突变体。改变转化细胞的生长温度(一般为23°-36℃)可调节启动子的强度。而且，在表达载体中最好含有转录终止信号，例如TPI1终止子。为便于纯化由酵母转化体产生的多肽，最好将编码分泌蛋白质的酵母基因的信号顺序以正确定向与编码本发明肽的顺序相连接。合适的信号顺序包括MFa1基因的前原区(Kurjan和Herskowitz，Cell 30933-943，1982;Kurjan等人，US4546082)或BAR1基因的前原区(Mackay等人，US4613572)。酵母宿主菌株到处都可得到，例如美国典型培养物收集中心(Rockville，Md)或YeastGeneticStockCenter(Berkeley，Calif.)。宿主菌株最好携有pep4突变，以减少本发明肽的蛋白降解。
高等真核细胞也可用作本发明合适的宿主细胞，最好是培养的哺乳动物细胞。用于哺乳动物细胞中的表达载体应含有一种启动子，该启动子能指导转录导入哺乳动物细胞中的克隆的DNA顺序。特别好的启动子是小鼠金属硫因-1(MT-1)启动子(Palmiter等人，Science222809-814，1983)或腺病毒2的主要晚期启动子(Berkner和Sharp，Nuc.AcidsRes.121925-1941，1984)。在该表达载体中还含有位于DNA顺序插入位点下游的多聚腺苷酸信号。还可含有其他顺序，如增强子和RNA拼接信号。一般情况下，本发明肽的编码顺序以正确定向与哺乳动物的分泌信号顺序相连接，以使肽从细胞中分泌出来。
通过例如磷酸钙介导的转染(Wigler等人，Cell14725，1978;Corsaro和Pearson，Somat.CellGenet.7603，1981;Graham和VanderEb，Virol.52456，1973)或电激法(Neumann等人，EMBOJ.1841-845，1982)将克隆的DNA顺序导入培养的哺乳动物细胞中。选择标记一般与所研究的顺序一起导入细胞中，以便鉴定基因组中整合有克隆的DNA的转染子。优选的选择标记包括使其具有抗药性的基因，如新霉素、潮霉素和氨甲喋呤抗性。选择标记可与所研究的顺序同时以不同的表达载体导入细胞，或使它们在相同的表达载体中导入细胞。
当使用某些选择标记如使其具有氨甲喋呤抗性的DHFR时，通过药物选择进行扩增可提高整合的DNA顺序的拷贝数。使药物浓度逐步增加，在每一步都选择抗性细胞。通过对克隆顺序拷贝数的上升进行选择，可显著提高表达水平。
例如，Miyajima等人(Gene58273-282，1987)、Isa和Shima(J.CellSci.88219-224，1987)和Kretsovali等人(Gene58167-176，1987)公开了在其他高等真核生物细胞中表达克隆的DNA顺序的方法。
表达多肽的宿主细胞可在适合于特定宿主的培养基中培养。本领域的普通技术人员应该明白，可得到各种各样的培养基，并可根据宿主细胞的营养要求、质粒选择等选择合适的培养基(关于培养基配方，可参见例如CatalogsoftheAmericanTypeCultureCollection，Rockville，Md.)。
一般说来，根据上述从组织进行提取的方法从细胞基质或透明的细胞溶解产物中纯化重组肽。一般，通过高效液相层析和凝胶过滤的配合分离含有本发明肽的样品。通过免疫测定或生物活性测定检测峰部分。也可用其他常规分离法，包括免疫亲和层析和离子交换层析。
本发明的多肽可用作治疗剂以促进温血动物中骨的生长。这些多肽可用于预防和治疗骨质疏松症、Paget氏病和牙周病以及用于促进骨折的愈合，特别可用于正常情况下不能愈合的病人。一般，将该多肽与一种生理上可接受的载体或稀释剂如无菌水或无菌盐水相混合。或者，将该多肽以冻干形式封装，在用药前再与载体或稀释剂混合。长度约短于32个氨基酸的多肽适于从鼻内给药。从鼻内给药的方法是公知的。简单地说，将所研究的肽溶于一种生理上可允许的缓冲液中，并喷在鼻膜上。不宜从鼻内给药的较长和较短的多肽可通过注射，最好为皮下注射给药。该多肽也可以栓剂给药。合适的剂量一般约为0.2μg-2mg/Kg(病人体重)/天，约为2μg-2mg/Kg/天更好，约为20-200μg/Kg/天最好，这取决于待治疗状况的确切性质。若该多肽从鼻内给药，最好在一天的进程中划分剂量。很大的剂量会导致增生活性的减小。该肽也可与其他治疗剂相混合而给药。关于这一点，添加剂最好包括雌激素、降钙素和磷酸氢盐，已知这些添加剂能减少骨的消溶，因此对本发明的多肽具有互补作用。此外，已发现将该多肽与生长因子结合可增强其活性。特别是，在生长因子剂量等于或低于具有一般的促生长作用时可观测到这种增强。所用的生长因子包括胰岛素、类胰岛素生长因子(促生长因子)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGFα和TGFβ)和表皮生长因子(EGF)、尤其优选的是有或没有IGF-I载体蛋白的类胰岛素生长因子I(IGF-I，也称为促生长因子C)。这些生长因子的制备方法是公知技术。例如，可参见Murray等人，US4766073;Derynck等人，EP200341;Derynck等人，US4742003;Gregory等人，US3883497;Eaton等人，EP46039;Jansen等人，Nature306609-611，1983;和Bell等人，Nature310775-777，1984。将生长因子与本发明的多肽相混合时，其用量为实验中显示能加强肽的增生活性而对软组织影响最小的量。生长因子的用量一般等于或低于它们单独产生临床效果的用量。在一个最佳实施方案中，本发明的肽是与IGF-I混合施用的，IGF-I的剂量为0.02-2mg/天/Kg病人体重。
下述实例是为了说明本发明而不是限制本发明。
实例1大鼠N-proCT的鉴别A.免疫测定方法用制备的针对合成肽(得自Peninsula Laboratories)的抗血清通过免疫检测法在正常和赘生性组织中检测N-proCT，所述合成肽相应于降钙素原氨基端和羧基端区域中的顺序(如表1所示)。NCAP抗血清是用NCAP免疫兔子产生的，该NCAP通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺结合有钥孔
血蓝蛋白，(Birnbaum等人，1982，同上;Goodfriend等人，Science 1441344-1346，1964)。二个NTP抗血清是用结合有钥孔
血蓝蛋白的合成的NTP-Tyr免疫兔子产生的(Goodfriend等人，同上)。
用放射性碘标记的合成的〔Tyr0〕-NCAP作示踪剂和标准进行NCAP放射免疫测定。碘化作用都通过氯胺-T法进行，并用Quso-32二氧化硅吸附进行纯化(Roos和Deftos，Methods of Hormone Radioassay，第2版，Jaffe和Behrman编，New York，Academic Press，1978，p.401-418)。所设计的检测法特异于N-proCT顺序的游离羧基端部分。用含有修饰氨端(酪氨酸或Bolton-Hunter加合物)的放射性标记的NCAP类似物筛选抗血清，从而选择出针对NCAP羧端部分的抗血清。放射免疫测定均在含1mM乙二胺四乙酸二钠、0.005%钠硫柳汞、0.1%牛血清清蛋白(Pentex组分V)和0.03%Brij-35洗涤剂的0.020M磷酸钠缓冲液(pH7.5)中进行。每次测定所用标准为10-10000pg〔Tyr0〕-NCAP。加入最后稀释度为1∶3500的NCAP抗血清(来自兔“Odessa”)、示踪剂和标准或样品，每管的最终体积为500μl，在4℃保温过夜。加入1ml/管的0.1%(W/V)Iggsorb(The Enzyme Center)以实现相分离。对于合成的Tyr-NCAP和NCAP的检测极限约为0.20pmol/管，在大约1.8pmol/管时结合的示踪剂有50%被取代。NCAP的Bolton-Hunter衍生物的取代曲线与Tyr-NCAP和未修饰NCAP肽的很相似。相反，对于proCT46-55〔它缺少NCAP(和N-proCT)的最后两个氨基酸〕，实质上未观察到示踪剂的取代。羧基端扩展的含NCAP的肽proCT46-59，其免疫活性比NCAP小1000倍，这表明在这种NCAP测定中需要一种游离羧基端丝氨酸以使含有NCAP的肽进行交叉反应。虽然NCAP免疫测定可识别N-proCT(proCT1-57)，但它不能检测出降钙素原或其他具有扩展羧基端的含NCAP的肽。
在CGRP前体的氨端中还发现一种NTP-Tyr片段(Amara等人，J.Biol.Chem.2572129-2132，1982;Gkonos等人，同上)，其抗血清可用于检测N-proCT的氨基端区。所用的来自兔“Vanessa”的抗血清其最终稀释度为1∶1000。加入抗血清、示踪剂、标准或样品以及缓冲剂，使每管的最终体积为500μl，在4℃下保温过夜。采用抗血清Vanessa时，NTP-Tyr标准的检测极限一般为150pg、(0.08pmol)/管，在1.2ng(0.74pmol)/管时取代率为50%。在这种NTP测定中，降钙素、C-proCT、CGRP、生长激素抑制素和NCAP没有交叉反应。由于数量为10-20μl/管的6M胍-HCl会干扰Vanessa放射免疫测定，所以用另一种NTP抗血清(来自兔“Peggy”)分析含胍的凝胶过滤组分。选择这种Peggy抗血清是由于当6M胍-HCl的用量高达40μl/管时它仍可使用。在上述的500μl标准测定中所用的Peggy NTP抗血清的最终稀释度为1∶20000。NTP-Tyr标准的检测极限为12pg(7fmol)/管，在185pg(0.11pmol)/管时取代率为50%。
用降钙素抗血清R-2(它特异于酰胺化的羧基端)以及一种能识别降钙素中区的抗血清进行大鼠降钙素的放射免疫测定(Roos等人，1979，同上;Birnbaum等人，1984，同上)。根据前人所述的方法，用以人CGRP抗血清RB-2035为基础的免疫测定法来测定大鼠CGRP(Gkonos等人，同上;Haller-Brem等人，Endocrinology1211272-1277，1987)。
B.细胞提取物的制备将WAG/Rij大鼠饲养在AAALAC认可的动物设备中。所有标准食物都是啮齿动物实验食物＃5001(TekLad Co.，Harlan Sprague Dawley，Inc.)。这种食物含有4.5%脂肪、23%蛋白质、6%纤维及所有普通维生素和矿物添加物。处死6-9月龄的雌性大鼠，切除其甲状腺以得到正常的甲状腺组织。为诱导C细胞增生(Miller等人，Program of the Seventh Annual Meeting of the American Society for Bone and Mineral Research，Abstr.366，Washington，D.C.，1985)，选出几组出生后4-7周的雌性WAG/Rij大鼠，然后用特定的高脂肪食物(在TekLad公司定制的高脂肪食物＃82376)喂养。这种食物含有45%脂肪、23%蛋白质和5%纤维及所有正常量的维生素和矿物添加物;这种高脂肪食物与普通食物(＃5001)的明显差别是其脂肪含量高10倍。当这些大鼠组的年龄为7-10月时将其处死，取其甲状腺用于分析。按下述方法制备组织提取物。
根据前人报道的方法，通过将一系列囊下肾(subcapsularrenal)移植到同源幼鼠中以导致富降钙素系1-2-4髓甲状腺癌(Roos等人，1979，同上)。用外科手术切除10-40克肿瘤，按下述方法进行提取。
为制备组织提取物，将10倍体积(ml/g)的2N乙酸/1%TFA加到精细切碎的组织中，然后将悬浮液煮沸20分钟。用BirnkmannPolytron以10档使样品充分匀浆，然后置于冰上冷却。以15000×g离心所得到的匀浆15分钟，从沉淀中吸出上清液。为使降解减至最少并得到可重复的层析图，用分批式反相法从上清液中提取多肽，在该方法中，将上清液加到2-5克的乙腈活化的、Vydac218TPB30C-18、大孔径二氧化硅颗粒的柱(0.5×2cm)中。先用0.1%TFA洗涤柱子，再用20%乙腈/0.1%TFA洗涤。然后用少量90%乙腈/0.1%TFA洗涤样品，并在SavantSpeedVac系统中干燥。
已建立的CA-77髓甲状腺癌细胞系的单层培养物按常规在无血清的介质中生长，该介质由DMEM/营养混合物F-10(Ham′s)(1∶1)组成，并添加有1.28g/1 NaHCO3，5μg/ml转铁蛋白，30nM亚硒酸和5μg/ml胰岛素。将培养物保存在润湿的空气-8%CO2环境中。根据前人的方法，使来自150-155代的CA-77细胞以5×105细胞/25cm2烧瓶的密度进行传代培养(Muszynski等人，J.Biol.Chem.25811678-11683，1983);然后每48小时更换一次介质。对于分泌试验，细胞只在DMEM中培养，用100mM CaCl2调节该介质的钙浓度。在平板培养10天后开始进行试验，以使各瓶中大约都含有5×106个细胞。在测试和对照保温结束时，以16000×g离心10分钟以澄清组织培养基，制成0.3mg/ml PMSF的溶液，冷冻贮存以用于分析。将从瓶中取出的细胞加入1%TFA中，通过声处理使其匀浆。用离心法除去细胞碎片;将上清液制成0.3mg/ml的PMSF，冷冻贮存以用于分析。用同样的方法使培养基和澄清的细胞提取物如组织提取物一样通过VydacC18柱。
C.C细胞提取物中N-proCT的鉴定来自甲状腺和赘生性C细胞的系列稀释提取物的示踪剂竞争曲线与NCAP和〔Tyr0〕-NCAP产生的相平行(图2)。用纯化的降钙素原、NTP-Tyr和各种其他多肽，包括C细胞产物如降钙素、C-proCT、CGRP和生长激素抑制素都未观测到交叉反应性。
在NTP免疫测定中，系列稀释的C细胞提取物的示踪剂取代曲线与合成的NTP-Tyr标准的相平行(图3)。
D.肿瘤细胞提取物中N-proCT的鉴定用反相高效液相层析分离肿瘤多肽。将来自1-2-4系髓甲状腺癌的干燥的热酸提取物重新悬浮在1%TFA(200-600μl)中，用WatersU6K注射器和标准的Spectra-physicsHPLC体系，将其注入WhatmanProtesil300Octyl-25分析柱中(Birnbaum等人，1984，同上)。用0.1%TFA水溶液中的乙腈梯度进行肽分离。在最初10分钟中，乙腈浓度从30%增加到35%;此后，在其余的70分钟内乙腈浓度从35%线性增加到40%。在48-49分钟洗脱主要峰重合的免疫活性NCAP和NTP(图4)。这些组分没有降钙素免疫活性。免疫活性NCAP和免疫活性NTP的洗脱比降钙素原早(60分钟)，比降钙素晚(18分钟)。在主要的免疫活性峰中，免疫活性NCAP对免疫活性NTP的摩尔比率为1.0，如对N-proCT的预期一样。
通过在6M胍HCl中的凝胶过滤测定免疫活性多肽的大小。以6M胍HCl/0.01%牛血清清蛋白平衡0.9×60cm的SephadexG-50(超细)柱(Birnbaum等人，1984，同上)。进行层析前，将冷冻样品溶于柱缓冲液中，其中补充有5%2-巯基乙醇，加热到70℃1小时。在进行层析前，在样品中加入蓝葡聚糖和酚红标记。按常规收集460μl的组分。用蓝葡聚糖(Vo)、细胞色素C(12800)、大鼠CGRP二聚物(7600)、人促肾上腺皮质激素(4500)、大鼠CGRP(3800)、大鼠降钙素(3450)、γ内啡肽(1860)和酚红(Vs)进行大小的校准。
对凝胶过滤峰进行高效液相层析和对高效液相层析峰进行凝胶过滤证实，高效液相层析和凝胶过滤的主峰是相等的。
在1-2-4肿瘤中，降钙素比CGRP多30倍，主峰含有洗脱的免疫活性NCAP和NTP二者(其表观大小为7.4KDa)，即所预测的N-proCT大小(图5)。未观察到免疫活性NCAP的其他明显峰，但对应于13KDa和4KDa处可观察到洗脱的免疫活性NTP的小峰。在7.4KDa峰中，免疫活性NCAP对免疫活性NTP的摩尔比率高是由于胍干扰了放射免疫测定的缘故。而在降钙素中区放射免疫测定中，降钙素原(13KDa)峰与降钙素发生交叉反应，而7.4KDa和4KDa的免疫活性NTP峰都不。4KDa免疫活性NTP可能是较大的免疫活性NTP的片段，因为部分纯化的7.4KDa免疫活性NTP的贮存(在1%TFA中，在-20℃下)会产生少量的4KDa形式。贮存在0.3mg/mlPMSF和6M胍-HCl中时，会减少所产生的小的免疫活性NTP。在70℃用6M胍-HCl代替冷的1%TFA来提取组织也可以减少4KDa免疫活性NTP的量。
CA-77髓甲状腺癌细胞分泌含7.4KDaNCAP的肽，其高效液相层析图与在1-2-4肿瘤和甲状腺中观察到的细胞N-proCT难以区分。在基本培养基中存在的这种肽与降钙素的摩尔比几乎相等。使胞外钙(一种已知的降钙素促分泌素)由0.5mM上升至1.8或4mM，所刺激的免疫活性NCAP的分泌与降钙素分泌的刺激相等。用4×10-7M的地塞米松处理这些培养物4天可增加NCAP和降钙素的胞内含量以及NCAP和降钙素分泌的基本比率。与未经处理的C细胞培养物一样，钙刺激类固醇处理的培养物可平行增加NCAP和降钙素的分泌。
E.在正常甲状腺和具C细胞增生的甲状腺中的免疫活性多肽通过研究大鼠中食物诱发的C细胞增生可得到N-proCT和降钙素在体内协同调节的证据。免疫活性NCAP和NTP含量的相应增加反映了长期食用高脂肪食物引起的甲状腺中降钙素含量的生理增加(表2)。发现这些甲状腺中的免疫活性NCAP和NTP所具有的凝胶过滤和HPLC迁移率与正常甲状腺和1-2-4肿瘤组织中的难以区分。在这种高效液相层析峰内的免疫活性NCAP与NTP的摩尔比为1.0。
用免疫测定法确定的正常甲状腺中的免疫活性NCAP、NTP和降钙素的摩尔量几乎相等(表2)。正常大鼠甲状腺中的免疫活性NCAP和免疫活性NTP的HPLC洗脱位置与1-2-4肿瘤组织中发现的相同。正常甲状腺HPLC峰中的免疫活性NCAP与免疫活性NTP的表观摩尔比为1.0，与从1-2-4肿瘤HPLC峰中观察到的一样。正常大鼠甲状腺提取液的胍凝胶过滤证实存在一个7.4KDa免疫活性NCAP/NTP主峰，其大小与从1-2-4肿瘤中观察到的免疫活性NCAP/NTP峰是基本一样的。
表2降钙素原产生的免疫活性的组织浓度＊免疫活性降钙素免疫活性NCAP免疫活性NTP1-2-4肿瘤4.50±0.274.75±0.213.25±0.45正常甲状腺0.98±0.290.96±0.320.88±0.29高脂肪喂养的大鼠甲状腺4.63±0.394.25±0.534.25±0.57肝和肌肉＜0.01＜0.01＜0.01＊数值(±标准平均误差)是以每mg组织的pmol当量表示的，并且为四次实验的平均值。
NCAP抗血清的特异性表明，7.4KDa肽的羧基末端是丝氨酸，它紧接降钙素原的第一个二元裂解位点之前(丝氨酸57)。NTP的免疫活性和CA-77细胞放射性标记肽的部分顺序测定表明，其氨基末端与降钙素原的一样。因此，含有免疫活性NTP和免疫活性NCAP的肽的生化性质表明它是57残基的N-proCT分子。
实例2N-proCT的分离大鼠髓质甲状腺癌组织经称重、切碎后，加到10倍体积(每克湿重)的1.5N乙酸中。将该混合物加热至沸后，再沸腾20分钟。热混合物在BrinkmannPolytron中以10档匀浆化。匀浆产物用冰水快速冷却，并在4℃左右保持20分钟，然后于20000×g离心20分钟。小心吸取上清液以便不扰乱沉淀或漂浮的类脂层。
将上清液装入用0.1%TFA平衡过的VydacC-18、宽孔的30微米二氧化硅的5g柱内，柱子预先已用90%乙腈/0.1%TFA活化。接着，该柱用25ml0.1%TFA洗涤，继之用20%乙腈/0.1%TFA50ml洗涤。再用45%乙腈/0.1%TFA洗脱N-proCT，并于不加热的SavantSpeedVac内干燥。
将干燥过的N-proCT溶于6M胍中，再装入用6M胍-HCl(pH5.5)平衡过的Sephadex G-50柱内。合并含有7.4KDaNTP和NCAP的物质(图5)。通过使肽吸附于1g的Vydac C-18柱上然后洗脱，以从合并的胍组分中回收肽，然后如上述在SpeedVac中干燥。
将干的凝胶过滤的N-proCT峰物质再悬浮于300μl的0.1%TFA中，再注入WhatmanC-8二氧化硅、10微米(孔径300A)的反向树脂0.6×25cm柱内。N-proCT肽用37%乙腈由柱上洗脱下来，它能够通过用35-40%乙腈/0.1%TFA梯度流洗80多分钟而使其与其他蛋白质分离(图4)。选择具有恒定的特异免疫活性的峰进行氨基酸分析和顺序测定。
使用离子交换层析进行进一步纯化，使用不同的离子配对剂和HPLC基质进行进一步HPLC纯化，和/或使用适当的高滴度抗血清免疫吸附层析进一步纯化。
实例3氨基端降钙素原肽的生物活性A.大鼠N-proCT用来产生RIAs(实例1)的NTP-Tyr(代表57残基大鼠N-proCT的最初十二肽片段)，被用来测定可能的骨消溶作用和/或骨细胞的增殖活性。颅盖取自16天的鸡胚和新生大鼠，并用胶原酶处理以制备骨细胞。将该细胞悬浮于无血清的BGJb培养基(得自Gibco，Grand Island，N.Y.的Fitton-Jackson Modification)中，并于平板上培养24小时以上。培养板经漂洗以除去成纤维细胞和其他的非成骨细胞。在22小时内，以0.001-100μM范围的浓度加入合成的NTP-Tyr，并用氚标记的胸苷标记细胞4小时。通过可用TCA沉淀的氚化胸苷测定DNA合成，并作为细胞增殖的指数。DNA的合成相对于未处理培养物的给出。用合成的N-proCT片段时，在10μM浓度下能看到很强的有丝分裂反应，在1μM浓度下即能观察到显著的效应。降钙素和CGRP都没有促有丝分裂的效应(图6)。解释这些实验的重要性在于这一事实，即采用这种特殊的平板培养法培养的骨细胞几乎都是骨生成细胞(成骨细胞)及其前体(前成骨细胞)。
通过沸酸提取法和反相C-18二氧化硅纯化法的联用，将起始的组织匀浆浓缩100倍左右，从而由1-2-4肿瘤组织中部分纯化出N-proCT。使N-proCT再悬浮于BGJb培养基中，中和后基本如上述加到大鼠或小鸡颅盖成骨细胞的培养物中。小鸡(图7A)和大鼠(图7B)两种骨细胞培养物的胸苷掺入量都有增加。在这两种情况中，部分纯化的N-proCT制剂诱发2-3倍的促有丝分裂应答，在10-7-10-8M下则观察到最大应答。完整的N-proCT的灵敏度似乎比合成肽片段(NTP-Tyr)大100-1000倍。大鼠成骨细胞和前成骨细胞对大鼠肽似乎比小鸡细胞(图7)的敏感性更大一些。用量低至10-10M时还对鼠成骨细胞培养物有刺激效应。在血钙过少症检测和骨消溶检测中都有活性的降钙素和CGRP，在10-4-10-6M浓度下，在平行的小鸡成骨细胞促有丝分裂检测中都没有效应。
作为骨细胞的对照培养物，由刚出生的大鼠制备皮肤细胞培养物，并在无血清的情况下平板培养24小时。当把N-proCT加入鼠片肤细胞时，即使在最高浓度下(图8)也只有轻微的促有丝分裂效应，尽管同样的制剂在成骨细胞和前成骨细胞上有很强的效应。在对成骨细胞和前成骨细胞有最大刺激作用的浓度下，N-proCT对成骨细胞和前成骨细胞的促有丝分裂效应总是在成纤维细胞中观察到的2-3倍。因此，N-proCT的促有丝分裂效应似乎是细胞特异的(成骨细胞和前成骨细胞而不是成纤维细胞)和肽特异的(天然肽和合成NTP，而不是降钙素或CGRP)。这种促有丝分裂效应的效力与胰岛素和促生长因子类似。
B.人N-proCT人N-proCT是通过AppliedBiosystems(FosterCity，Calif.)合成的，并以不纯的制剂形式提供。
人肽的纯化先通过Vydac C-4反相柱的高效液相层析纯化，然后，HPLC主峰在Lichroprep RP-18(C-18反相二氧化硅)柱中纯化。Lichroprep柱(0.5g)用10ml含0.1%三氟乙酸(TFA)的90%CH3CN活化。然后用20ml的0.1%TFA洗涤，再将N-proCT样品(0.5ml)装入柱中。该柱先后用10ml的0.1%TFA和10ml含0.1%TFA的20%CH3CN洗涤。N-proCT用40%CH3CN/0.1%TFA洗脱。用40%CH3CN洗脱的N-proCT高于90%。
分析合成肽的顺序发现与天然的人N-proCT一样(图1)。
如上所述，检测合成的人N-proCT对小鸡成骨细胞和前成骨细胞的促有丝分裂活性。检测结果以每一实验组的平均值±标准平均误差(n＝6)列于图9，所示结果相对于对照组的平均值给出。“对照”培养物只接受BGJb培养基;“胰岛素”培养物含10μg/ml胰岛素(大约1.5μM)作为阳性对照。
还检测合成的人N-proCT对人成骨细胞和骨肉瘤细胞的效应。富集人成骨细胞的培养物是由一名老年男子和两名老年女子的手术股骨破片制得的。骨碎片用胶原酶消化。由消化液收集细胞，然后用PBS洗涤，再于盛有15%胎牛血清的无钙MEM的组织培养瓶中进行培养。所得到的富集成骨细胞的培养物在培养皿中受胰蛋白酶作用，用PBS洗涤，再悬浮于含5%胎牛血清的BGJb培养基中，在每孔为50000细胞的密度下，于48孔微量滴定板(Costar，Inc)中培养。16小时后，移去培养基，用PBS洗涤培养物2次，再加入无血清的BGJb培养基。培养物生长6小时后除去培养基，再往每孔加200μl含检测剂的BGJb培养基。16-18小时后，往每孔加50μl含1或2μC3H-胸苷的BGJb培养基。4小时后移去培养基，用PBS洗涤每个孔2次后干燥。用湿润有12.5%TCA的棉签括每个孔。再用12.5%的TCA洗棉签2次，每次10分钟，最后用95%乙醇洗10分钟一次，干燥后放于4ml的Ecolume(ICN.Irvine.Calif.)内，之后用闪烁计数器计数。结果表明，10nM的人N-proCT对胸苷掺入DNA能产生最大的刺激(接近两倍)，1nM左右时能产生最大效应的一半(图10a)。在这些培养物中，胰岛素的最大有效用量(10μg/ml或2μM)也使胸苷掺入增至2倍。还用人U-2OS骨肉瘤细胞(ATCC HTB96)进行了类似实验。细胞被培养在BGJb培养基中，通过胰蛋白酶的作用由汇合后的瓶中收获细胞，用PBS洗涤2次，于盛有含1%胎牛血清的BGJb培养基的48孔微量滴定板中培养过夜。将细胞转移到无血清的BGJb培养基中，6小时后按上述方法测定3H-胸苷的掺入量。人N-proCT在浓度＞10μM时，刺激胸苷掺入DNA的效应最大(近两倍)，而在5nM时则减半(图10b)。用30ng/ml IGF-I(由人血清纯化)或10μg/ml胰岛素可观察到差不多大的最大效应。
人N-proCT对鼠成骨细胞也有刺激作用，但对鼠皮肤细胞没有。
结合胰岛素测定了人N-proCT对人U-20S细胞的效应。这些细胞如前所述在48孔微量滴定板中培养，然后在N-proCT、胰岛素或N-proCT加胰岛素的存在下保温48小时。结束时，胰蛋白酶和EDTA分别加到25mg/ml和1mM的最终浓度，然后使培养物在37℃下保温至细胞能够通过肉眼观察分离。加入15%最终浓度的胎牛血清使胰蛋白酶纯化。通过重复吸取使丛生的细胞分散，取等分试样用血球计直接计数。结果列于表3，它表明N-proCT和胰岛素之间具有协同效应。
表3处理每孔细胞数比对照增长的倍数BGJb(对照) 4，838(±796) 1(±0.12)1μMN-proCT13，201(±1，462)2.72(±0.30)10μg/ml胰岛素12，900(±796)2.62(±0.16)5μg/ml胰岛素8，235(±667)1.70(±0.14)5μg/ml胰岛素+1μMN-proCT15，400(±1，054)3.20(±0.22)C.人N-proCT肽合成的人N-proCT用赖氨酰肽链内切酶(WakoChemicalsUSA.Inc.，Dallas，Tex.)消化。使345μg冻干的N-proCT溶于110μ18M脲中。加入10μlpH9的500mMTris，于37℃下使混合物保温30分钟。再往混合物中加入150μlpH9的50mMTris。加入赖氨酰肽链内切酶(3mg/ml储备液)以使酶底物比为1∶100。混合物于37℃下保温过夜，然后冷冻储存。所得到的肽N-proCT(1-37)和N-proCT(38-57)用0%-70%乙腈的0.1%TFA梯度溶液由VydacC-4柱层析回收。
使用碘化的人N-proCT作为示踪物，用竞争结合法测定人N-proCT(1-37)和N-proCT(38-57)与U-20S细胞的结合。结合测定法基本上按实例1所述进行。发现5μM的N-proCT(1-37)在结合竞争中至少与相同浓度的完整人N-proCT的效果一样。片段(38-57)几乎没有显示出结合竞争的能力，即使有也很小。
如上所述测定合成的NCAP(表1)对小鸡和大鼠成骨细胞的促有丝分裂活性。肽在0.1μM-0.1mM浓度范围内不显示促有丝分裂活性。而且，NCAP不与完整的人N-proCT竞争结合骨肉瘤细胞。
实例4大鼠N-proCT在酵母中的表达A.N-proCT编码顺序的合成57氨基酸的大鼠N-proCT的编码顺序是由列于表4的6个合成寡核苷酸构建的。所设计的寡核苷酸应当提供为便于表达载体的构建分别在5′和3′末端上的EcoRⅠ和XbaⅠ限制位点;最适于酵母的转译起始位点;ATG起始密码子;为便于以后的顺序操作，根据酵母密码子的偏爱、多重限制位点的清除及限制位点的引入而挑选密码子;和TAA终止密码子。在AppliedBiosystems380A型DNA合成仪中合成寡核苷酸，并用变性凝胶的电泳纯化。寡核苷酸经激酶活化，以等摩尔比例混合并退火。然后使退火对连接起来，所得到的混合物用EcoRⅠ和XbaⅠ消化。使用天然聚丙烯酰胺平板凝胶电泳分离190bp编码顺序(图11)，再从凝胶中提取。编码顺序的装配举例说明于图12。
B.用ADH2-4c启动子表达为了在酵母中表达，将N-proCT片段与ADH2-4c启动子和TPI1终止密码子连接。所得到的表达单位再插入含有POT1选择标记的载体中。
Russell等人(Natare 304652-654，1983)描述的ADH2-4c启动子是由野生型ADH2(乙醇脱氢酶Ⅱ)启动子的下游部分与ADH2-4c启动子的上游部分结合而构建的。ADH2-4c启动子的上游顺序决定其增强功能。该启动子的构建说明于图12。含有野生型ADH2结构基因的2.2Kb BamHI片段和pBR322-ADR2-Bsa(Williamson等人，Cell23605-614，1981)的5′邻接顺序与M13mp19连接，然后用BamHI使其线性化。插段的取向取决于限制性分析。寡核苷酸ZC237(5′GCC AGT GAA TTC CAT TGT GTA TTA 3′)在Applied Biosytems 380A型DNA合成仪中合成，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。为了分离启动子，用ZC 237作为诱变引物和Zc 87(5′TCC CAG TCA CGA CGT 3′)作为第二引物，对在M13mp19中的ADH2插段进行离体的位点特异性诱变(Zoller等人，DNA3479-488，1984)。在阳性克隆中，寡核苷酸ZC 237使ADH2基因的结构部分成环，同时使含有转译起始信号的5′邻接顺序与M13mp19多人工接头的EcoRⅠ位点融合。制备复制形式的诱变噬菌体，再用Bam HI和EcoRⅠ切割以分离1.2Kb的启动子片段。该片段与用BamHI和EcoRⅠ线性化的pUC13相连接，以产生质粒p237-Wt。为了使p237-Wt启动子变成“向上启动子”突变体ADH2-4c启动子，将含有发现能影响启动子功能的变化的YRP7-ADR3-4C(Russell等人，同上)的1.1Kb BamHⅠ-SphⅠ片段，亚克隆至P237-Wt的载体片段中，该质粒已先用BamHⅠ和SphⅠ切开。所得到的质粒称为p237-4C(图13)。
克隆的ADH2-4C启动子通过加入末端限制性核酸内切酶切割位点而修饰。为了方便起见，这一步是通过使启动子与质粒pAT-1中的成熟型人α-1-抗胰蛋白酶(AAT)第一氨基酸的密码子相融合完成的。质粒pAT-1包括来自p237-Wt的ADH2启动子表达单位和α-1-抗胰蛋白酶cDNA-TPI1终止子顺序。这些顺序被插入载体PCPOT(图14)的一部分中。(质粒PCTPOT作为大肠杆菌HB101转化株在ATCC寄存，寄存号为39685。它包括整个2微米质粒DNA、leuZ-d基因、pBR322顺序和粟酒裂殖酵母POT1基因)。质粒PCPOT用BamHI和SalⅠ切开以分离约10Kb的线性载体片段。1.2kb ADH2启动子片段由P237-Wt中作为BamHI-EcoRⅠ片段而分离，并与1.5kbα-1-抗胰蛋白酶cDNA-TPI1终止子片段(EcoRI-XhoⅠ)和线性化的pCPOT作三段连接，产生称为PAT-1的质粒。
质粒PAT-1在ADH2转译起始密码子和成熟AAT的第一氨基酸密码子之间含有三个额外的氨基酸密码子。这三个密码子通过离体的位点特异性诱变而除去。质粒pAT-1用SphⅠ和BamHⅠ切开后，分离出190bp ADH2启动子片段。这种片段连到已为BamHI和SphⅠ线性化的M13mp18中。使用ZC411(5′TAATACACAATAGGAGGATCCC3′)作为诱变引物，以ZC87作第二引物，使所获得的构建体进行离体诱变，以使ADH2转译起始信号与成熟的α-1-抗胰蛋白酶的第一密码子相融合。阳性克隆已通过从170bp处的ATG至融合点的双脱氧顺序测定所证实。为便于操作，使175bp的诱变启动子片段SphⅠ-EcoRⅠ与已被SphⅠ和EcoRⅠ线性化的PUC19连接。所获得的质粒称为p411，它包括ADH2启动子3′顶端的170bp和ADH2转译起始密码子，该起始密码与载体PUC19中成熟AAT的第一氨基酸密码子相融合。
为了产生与成熟AAT的第一氨基酸密码子融合的完整的ADH2-4c启动子，将含有由Russell等人发现影响启动子功能变化的ADH2-4C启动子的5′顶端顺序，加到存在于质粒p411中的启动子片段中。为了分离175bp启动子片段，质粒p411用SphⅠ和EcoRⅠ消化。质粒p237-4C用EcoRⅠ和SphⅠ切开，以分离出含pUC载体顺序和赋予“向上启动子”表型的启动子5′顶端顺序的3.71kb片段。来自p411的175kb启动子片段连接于p237-4C载体片段中。所得到的质粒定名为p234-4CM，它含有与成熟AAT第一氨基酸密码子相融合的完整ADH2-4C启动子。
由质粒pAT-1产生的ADH2启动子，通过除去ADH2转译起始部位和在PAT-1中发现的PUC18多人工接头顺序，修饰成“通用型”启动子，质粒PAT-1用SphⅠ和BamHⅠ切开，以分离190bp的部分的ADH2启动子片段。该片段与已为BamHⅠ和SphⅠ线性化的M13mp18连接。采用ZC410(5′CGTAATACAGAATTCCCGGG3′)作诱变引物，ZC87作第二引物，使所得到的构建体经受离体诱变，从而用融合于M13mp18多人工接头的SmaⅠ位点处的单一EcoRⅠ位点代替ADH2转译起始信号和pUC18多人工接头顺序。阳性克隆借助于直至融合点的双脱氧顺序测定而得到证实。为了便于操作，诱变的部分ADH2启动子片段作为175bp SphⅠ-EcoRⅠ片段被亚克隆入由SphⅠ和EcoRⅠ线性化的pUC19中。所得到的质粒定名为p410ES，它含有ADH2启动子3′顶端的175bp。通过使P410ES启动子片段(SphⅠ-EcoRⅠ)与来自p237-4C的1.1kb BamHⅠ-SphⅠ ADH2-4C启动子片段相连接，从而将ADH2-4C启动子修饰成含有此3′顺序。使这两种启动子片段与BamHⅠ和EcoRⅠ切开的PUC13作三段连接。通过限制分析证实，所获得的质粒含有完整的ADH2-4C启动子，其3′端通过诱变由EcoRⅠ位点取代了转译起始密码。该质粒命名为P410-4C(图13)。
来自P410-4C的BamHⅠ-EcoRⅠ ADH2-4C启动子片段和EcoRⅠ-XbaⅠ N-proCT片段连到BamHⅠ和XbaⅠ消化的M13mp18中。测定含有插段的M13克隆的顺序，并由含有完整插段的克隆制备复制型(RF)DNA。噬菌体载体用BamHⅠ和XbaⅠ消化，并分离启动子-N-ProCT片段。该片段再与来自PKP10(一种含有来自PSB1〔Marray等人，US4766073〕的TPI1启动子-α因子-VSB-TPI1终止子表达单位的质粒，它被插入缺失EcoRⅠ位点的pBR322载体中)的XbaⅠ-BamHⅠ TPI1终止子片段和BamHI消化的PUC19相连接。含有合适插段的克隆再用BamHⅠ消化，并分离表达单位。
然后构建最终的表达载体。质粒PCPOT用SphⅠ和BamHⅠ切开以除去2微米的750bp和PBR322顺序。之后将线性载体与由PBR322四环素抗性基因产生的186bp SphⅠ-BamHⅠ片段连接。所获得的质粒命名为PDPOT(图12)，此质粒再用BamHⅠ消化并与BamHⅠ表达单位相连接，然后确定所得到的克隆的插入方向。选择出含有邻近POT1基因的ADH2-4c启动子的质粒，命名为PM271-9。
表达载体PM271-9被用于转化啤酒酵母ZM118株(leu2-3，112 ura 3 tpilURA3+barl pep4URA3+〔cir0〕的MATa/MATα二倍体纯合子)、ZM134株(MATa △tpiURA3 pep4URA3 leu2ura3 sir3-8〔cir+〕)和XB13-5B株(MATa ura3 leu2-3，112barl gal2 tpilURA3)。选出TPI+菌落后于30℃下在富含葡萄糖的培养基中生长2天。制备粗溶胞产物并于-80℃下贮存。溶胞产物经融化后澄清，再从澄清的溶胞产物中基本按实例2所述制备N-proCT。溶胞产物中的N-proCT浓度用NCAP放射免疫检测法检测。结果列于表5。
第二套表达载体是将N-proCT表达单位插入载体PMPOT2中而构建的，该载体含有REP1、REP2、REP3和由酵母2微米质粒产生的ori顺序、氨苄青霉素抗性标记和粟酒裂殖酵母磷酸丙糖异构酶(POT1)基因。PMPOT2作为大肠杆菌HB101转化株寄存于美国典型培养物收集中心，保藏号为67788。质粒p271-9用BamHⅠ消化后分离出N-proCT表达单位。使此片段与BamHⅠ消化的pMPOT2相连接以构建载体pM274-4和PM274-15(图20)。
用质粒pM274-4和pM274-15转化啤酒酵母ZM118株。转化株于30℃下用含28μg/ml亮氨酸的酵母培养基Ⅰ(2%酵母膏，6%葡萄糖，0.5%硫酸铵)20ml或200ml培养过夜。细胞通过离心与培养基分离，再悬浮于PBS中，再于玻璃珠存在下用涡流溶解。将得到的粗溶胞产物冷冻贮存以备检测用。
重组N-proCT的活性检测是用22小时龄的小鸡颅骨细胞增殖检测法进行，采用天然N-proCT(100nM，来自鼠髓甲状腺癌)和胰岛素(10μg/ml)作为阳性对照。融化的酵母溶胞产物以16，800×g离心15分钟。然后利用Vydac大孔珠通过C-18二氧化硅反向分批层析浓缩澄清的溶胞产物。用30%-50%乙腈/0.1%三氟乙酸由Vydac珠洗脱的组分在SpeedVac中干燥后，再悬浮于1ml的BGJb培养基中。每一批样品的N-proCT浓度通过NCAP RIA测定。将肽制剂用于细胞培养物。18小时后，向每一培养物中加入3H-胸苷，自此4小时后，测定每一试验条件下的相对未处理(对照)培养物的可由TCA沉淀的氚。结果列于图15。样品(克隆和N-proCT浓缩物)如下A.p274-4克隆1，16nM;B.p274-4克隆2，3nM;C.pMPOT2对照;D.p274-15克隆1，135nM;E.p274-15，克隆2，＞5nM。
C.用温度调节型杂交启动子进行的表达部分TPI1启动子片段是由质粒PTPIC10(Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Genet.1410-434，1982)获得的。质粒PTPIC10在单一KpnⅠ位点上切开，用Bal 31核酸外切酶除去TPI1编码区，并且往启动子的3′末端加入EcoRⅠ人工接头(顺序GGAATTCC)。用BglⅡ和EcoRⅠ消化后产生具有BglⅡ和EcoRⅠ粘性末端的TPI1启动子片段。该片段再与用BglⅡ和EcoRⅠ(部分)切开的质粒YRp7′(Stinchcomb等人，Nature 28239-43，1979)相连接。所得到的质粒TE32用EcoRⅠ(部分)和BamHⅠ切开以除去一部分四环素抗性基因。线性质粒通过加入EcoRⅠ-BamHⅠ人工接头环化，从而产生质粒TEA32。质粒TEA32用BglⅡ和EcoRⅠ消化，用凝胶纯化大约900bp的部分TPI1启动子片段。质粒PIC19H(Marsh等人，Gene 32481-486，1984)用BglⅡ和EcoRⅠ切开，载体片段用凝胶纯化。TPI1启动子片段与线性化的PIC19H连接，所获得的混合物用于转化大肠杆菌RR1。制备质粒DNA，选择大约900bp的BglⅡ·EcoRⅠ片段。筛选出的合适质粒命名为PICTPIP(图17)。
然后装配完整的TPI1启动子。用EcoRⅠ消化质粒pIC7(Marsh等人，同上)，片段末端用DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)平整，并用T4DNA连接酶再成环。获得的质粒被用于转化大肠杆菌RR1。由转化株制备质粒DNA，并筛选EcoRⅠ位点的丧失。具有正确限制模式的质粒定名为pIC7RI＊。质粒PIC7RⅠ＊用HindⅢ和NarⅠ消化，用凝胶纯化2500bp片段。用NarⅠ和SphⅠ使部分TPI1启动子片段(大约900bp)由PICTPIP切下，再用凝胶纯化。由质粒PFATPOT(Kawasaki和Bell，EP171，142)制得TPI1启动子的其余部分。用PFATPOT转化的啤酒酵母E18株(定名为ZYM-3)保藏于美国典型培养物收集中心，保藏号为20699。PFATPOT用SphⅠ和HindⅢ消化，包括一部分TPI1启动子的1750bp片段用凝胶纯化。pIC7RI＊片段，由PICTPIP产生的部分TPI1启动子片段和由PFATPOT产生的片段进行三段连接，以产生PMVR1(图18)。
然后将MATα2操纵基因顺序插入TPI1启动子中。质粒pSXR101的构建是通过使PUC9的2.7kb SalⅠ-BamHⅠ片段与TPI1启动子的0.9kb XhoⅠ-BamHⅠ片段连接而完成的，后一片段是由质粒PMVR1产生的。然后，将质粒PSXR101中TPI1启动子的SphⅠ位点改变成单一的XhoⅠ位点。根据标准方法(Maniatis等人，同上)，用SphⅠ切开PSXR101 DNA并脱磷酸。SphⅠ-XhoⅠ转接体(GCTCGAGCCATG)于37℃下在20μl反应混合物中激活30分钟，该混合物包括20pmole转接体、50mM Tris-HCl，pH7.6，10mM MgCl2，5mM DTT，0.1mM亚精胺、1mM ATP和5单位多核苷酸激酶。激活的SphⅠ-XhoⅠ转接体与SphⅠ切开的PSXR101相连接，连接混合物用于转化大肠杆菌RR1。用限制分析法鉴定具有插入转接体的质粒，并命名为PSXR102(图18)。合成MATα2操纵基因的寡核苷酸(5′TCGAG TCA TGT ACT TAC CCA ATT AGG AAA TTT ACA TGG 3′和3′C AGT ACA TGA ATG GGT TAA TCC TTT AAA TGT ACC AGCT 5′)，并按上述激活。质粒pSXR102用XhoⅠ切开并按标准方法脱磷酸。建立三个不同的连接反应，质粒DNA与寡核苷酸的摩尔比分别为1∶1、1∶3和1∶6。得到的连接混合物用于转化大肠杆菌RR1。具有插入寡核苷酸的质粒通过菌落杂交和限制分析鉴定。随后的DNA顺序测定表明，PSXR103含有一个拷贝的MATα2操纵基因、PSXR104含有两个拷贝、而PSXR108含有4个拷贝(图19)。
在下一步骤中，质粒PSXR102、PSXR103、PSXR104和PSXR108用BamHⅠ切开、脱磷酸并与3.2kb BamHⅠ-BamHⅠ片段连接，该片段来自含有大肠杆菌lac Z基因的质粒plac7。该连接混合物被用于转化大肠杆菌RR1。含有适当的TPI1-lacZ融合体的质粒用限制分析法鉴定，并命名如下PSXR109，无MATα2操纵基因;PSXR110，一个MATα2操纵基因;PSXR111，两个拷贝的MATα2操纵基因;以及PSXR112，四个拷贝的MATα2操纵基因顺序(图20)。
然后，构建由温度调节型的TPI1启动子、N-proCT顺序和TPI1终止了组成的表达单位。质粒PM271-9用EcoRⅠ和BamHⅠ消化以切下ADH2-4C启动子。质粒PSXR111用BglⅡ和EcoRⅠ消化，之后分离SXR111启动子片段，再与线性PM271-9连接。根据插入的方向将得到的质粒定名为PM275-4和PM275-5(图15)。
用质粒PM275-4和PM275-5转化啤酒酵母ZM134株。转化株在20ml的YEPD(1%酵母膏、2%蛋白胨，2%葡萄糖和40mg/l腺嘌呤)的培养液中，于30℃下培养过夜，以使细胞密度达到8×107细胞/ml左右。将温度降至23°-25℃，培养液再保温2小时。使细胞沉淀，再悬浮于20ml新鲜的YEPD中，于23°-25℃下培养24小时。如上所述制备粗溶胞产物，并于-80℃下冷冻。
D.用野生型ADH2启动子表达用来自P410ES的部分ADH2启动子片段再生野生型ADH2启动子。质粒P410ES用SphⅠ和EcoRⅠ消化以分离175bp部分的ADH2启动子片段。该片段与来自PBR322-ADR2-Bsa的1kb BamHⅠ-SphⅠ片段分三段连接结合于PUC13中，PUC13预先用BamHⅠ和EcoRⅠ的消化而线性化。来自PBR322-ADR2-Bsa的1kb片段含有与野生型ADH2启动子顺序同源的顺序。由三段连接得到的质粒为限制分析所证实，并定名为P410-Wt。
质粒pM271-9用BamHⅠ和EcoRⅠ消化，然后将来自P410Wt的BamHⅠ-EcoRⅠ ADH2启动子片段插入ADH2-4C启动子的位置中。根据插入的方向，所得到的质粒定名为PM277-15和PM277-16(图14)。
质粒PM277-15和PM277-16用于转化啤酒酵母ZM118株。20ml YEPD培养液于30℃下培养大约48小时。制备粗溶胞产物并于-80℃下冷冻。
使用合成的NCAP作为标准，通过放射免疫检测法检测溶胞产物中的N-proCT浓度。重复测定的结果列于表5。
表5质粒株%胞质蛋白12平均PM271-9 ZM134 2.07 2.52 2.29ZM1180.540.690.62XB13-5B0.190.640.41PM227-15 ZM118 0.48 0.41 0.44PM277-16 ZM118 0 0.18 0.09PDPOT ZM134 0 0 0ZM11800E.大鼠N-proCT的分泌表达基本如上述装配大鼠N-proCT的编码顺序，只是用寡核苷酸ZC2041(5′AGCTTGGACAAGAGAGTTCCCTTAAGATCTACCTTGGAATCTTCTCCAGGTATGGCTACCTTGT3′)和ZC2042(5′CTTCAGACAAGGTAGCCATACCTGGAGAAGATTCCAAGGTAGATCTTAAGGGAACTCTCTTGTCCA3′)分别代替ZC1791和ZC1792。这样装配的编码顺序包括在其5′末端上的HindⅢ“粘性末端”。
为了表达载体构建物，将装配的编码顺序与来自pkp10的TPI1终止子片段(XbaⅠ-BamHⅠ)连接。得到的HindⅢ-BamHⅠ片段与ADH2-4C启动子(来自PM271-9的BamHⅠ-EcoRⅠ)、α因子前原顺序(EcoRⅠ-HindⅢ)和BamHⅠ切开的PDPOT连接。得到的表达载体定名为PM294-1(与POT1标记方向相反的N-proCT表达单位)和PM294-4(与POT1方向相同的N-proCT表达单位)。
用载体PM294-1和PM294-4转化啤酒酵母XB13-5B株。两份20ml培养液培养48小时，培养基样品稀释至1∶1000，并检验N-proCT免疫活性物质。结果(调节至完整强度的培养基)列于表6中。
表6质粒N-proCT(μg/ml)PM294-1 3844PM294-4 7046实例5人N-proCT的表达由寡核苷酸(表7)、5′末端的EcoRⅠ位点和3′末端的Xba.Ⅰ位点构建人的N-proCT顺序，这些寡核苷酸被设计为用酵母优选的密码子编码肽。编码顺序包括起始的甲硫氨酸残基，它在体外被甲硫氨酸氨肽酶切除以产生合适的肽。
为了进行胞质表达，合成由A至F的寡核苷酸，并纯化、激活、以相同比例混合并退火。连接所得到的寡核苷酸对(A+F、B+F、C+D)，混合物用EcoRⅠ和XbaⅠ消化。通过天然聚丙烯酰胺平板凝胶电泳分离编码顺序并且从凝胶中提取。
然后基本按实例4所述构建表达载体。ADH2-4C启动子(BamHⅠ-EcoRⅠ片段)、野生型ADH2启动子(BamHⅠ-EcoRⅠ片段)或SXR111启动子(BglⅢ-EcoRⅠ片段)与PKP10的TPI1终止子一起和N-proCT顺序连接。将所获得的表达单位插入PMPOT2或PDPOT中，并测定插入的方向。
为了进行表达，用人N-proCT表达载体转化适当的酵母宿主株。用含ADH2-4C或野生型ADH2启动子的载体转化ZM118、XB13-5B和ZM134株。用含SXR111启动子的载体转化ZM134。通过在含葡萄糖的培养基中培养以选择转化株。为了肽的调节表达或组成表达，使细胞在适当的条件下培养。然后溶解细胞，制备无细胞的溶胞产物用于检测。
质粒PM286-7是以PDPOT为基础的质粒，它的N-proCT表达单位中含有ADH2-4C启动子，其方向与POT1基因相同，用此质粒转化ZM134。转化的细胞基本如上述进行培养。收集细胞后，在1M乙酸中溶解，并离心。所获得的澄清的溶胞产物使用抗-NCAP抗血清通过放射免疫检测法检测N-proCT的产生。用检测缓冲液(0.02M NaPO4pH7.4，0.05%NaN3，0.05%NP-40，1mM EDTA)稀释澄清的溶胞产物样品。两份样品(100μl)加到盛有200μl检测缓冲液的管中。往每根管中添加100μl用检测缓冲液稀释1∶7(1∶3500总稀释度)的抗体。将100μl含20，000cpm125Ⅰ-标记的人N-proCT的检测缓冲液加到每个管中，各管于室温下保温4小时。金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞(Pansorbin;Sigma Chemical Co.)用检测缓冲液稀释1∶200，在每管中加入1ml所获得的悬浮液，各管经混合后于室温下保温20分钟。各管以3000rpm离心15分钟，倒出上清液，测量沉淀中的放射活性。N-proCT水平的测定采用与标准曲线的对比进行，该曲线是用合成的人N-proCT稀释至500、250、125、62.5、31.25、15.6和7.8ng/ml绘制的。发现大约0.025%总的可溶蛋白质是N-proCT。
为了通过酵母分泌人的N-proCT，寡核苷酸B、C、D、E、G和H如上述进行退火，以获得对G+H、B+H和C+D对。连接各对，用HindⅢ和XbaⅠ消化混合物，再用凝胶纯化片段。
装配用于分泌表达的载体。连接N-proCT片段(HindⅢ-XbaⅠ)和来自PKP10的α因子前原片段(EcoRⅠ-HindⅢ)，并插入含有上述的TPI1启动子和终止子的表达载体中，以构建质粒PM285-13(与POT1相同取向的表达单位)和PM285-15(相反取向的表达单位)。第二套分泌型表达载体的构建采用来自P410-4C的ADH2-4C启动子和来自PKP10的TPI1终止子进行。这些载体被命名为PM284-3(与POT1取向相同的表达单位)和PM284-4(取向相反的表达单位)。
用质粒PM284-3转化啤酒酵母XB13-5B株。用质粒PM285-13和PM285-15转化XB13-5B和ZM134株。按前述培养细胞。培养物经0.45微米滤器无菌过滤，并如上述采用抗NCAP抗血清的放射免疫检测法检测N-proCT。两套实验结果列于表8表8质粒宿主株输出的N-proCT(μg/ml)12平均PM284-3 XB13-5B 6.71 5.97 6.34PM285-13 XB13-5B 5.19 3.63 4.41PM285-15 XB13-5B 2.96 4.80 3.88PM285-15 ZM134 3.51 3.33 3.42重组N-proCT通过往培养基中添加1%(按体积)乙酸和30%(按体积)乙腈从酵母培养基中纯化。混合物流过VydacC-4反向柱后，用在水中的30%-50%乙腈梯度洗脱。在215nm下监测洗脱液的吸光度，收集含有N-proCT的峰值组分。
实例6N-proCT的体外活性SwissWebster幼鼠(21天龄，平均体重16克，n＝8)皮下注射10μg合成的人N-proCT(溶解于0.01M乙酸中)14天，每日两次。对照小鼠(n＝7)注射载体。在处理和对照小鼠之间存在的体重差别不明显。因此，N-proCT对小鼠无毒。动物在实验第2天和第13天注射四环素，以标记用于组织形态测量的骨骼。使动物在14天时处死，将解剖除去软组织的骨骼固定于中性缓冲甲醛水溶液中。用每只动物制备胫腓骨的胫节断面(50μm)，然后通过成象分析法测定四环素标记。骨内四环素标记的平均面积在N-proCT处理动物中比对照组大得多(+46%，P＜0.02)(图21)。用N-proCT处理的小鼠的第二海绵区中，每平方毫米表面上的成骨细胞数比对照组有显著下降(-34.4%，p＜0.001)。这些数据因此证实，N-proCT在体外影响骨的形成，并认为这种C细胞产物是骨生长的重要调节剂。
实例7成骨细胞上N-proCT受体的证据为了阐明N-proCT对类成骨细胞的作用机理，用放射性碘标记的人N-proCT检测与培养的U-20S细胞结合的高亲和力，这些细胞是由人的骨肉瘤制成的。合成的人proCT(用反相HPLC纯化)用氯胺T法进行放射碘标记，之后通过Quso G-32二氧化硅/Dowex AG1-X8(Bio-Rad Laboratories，Richmond，Calif.)的洗脱纯化。用这种标记的人N-proCT(60000cpm/ng)在这些研究中作为示踪化合物。人U-2OS细胞以每孔20，000个细胞的密度在48孔微量滴定板中培养。在实验开始前的6小时，以及在整个结合研究的过程中，细胞均置于无血清的BGJb组织培养基内。加入大约0.5%的示踪物与这些细胞特异性结合(特异结合被定义为，在没有合成的N-proCT的情况下，少于存在有高浓度〔5-8μM〕的未标记N-proCT情况下保温后残留的放射活性的结合量)。5μM人降钙素和胰岛素不与125I-N-proCT竞争与细胞的结合。与未标记人N-proCT的竞争结合的表观密度kd(最大结合的一半)为10nM，而与合成的人NTP-Tyr的竞争则有200nM的Kd。这些确定的解离常数，与每种肽诱发U-20S细胞增殖的最大刺激一半所必需的浓度非常吻合。假设在结合实验结束时达到平衡和每孔有大约20，000个细胞，那么每个细胞至少有3000个结合部位。这些结果进一步证实，N-proCT是通过直接作用于成骨细胞而促进骨形成的一种C细胞肽激素。
虽然为清楚理解本发明而详细并举例进行了说明，然而在本发明权利要求的范围内，显然可对本发明进行某些变化和修饰。
权利要求
1.一种分离的肽，它具有如下特征其长度至少为12个氨基酸；至少与一部分大鼠N-proCT基本同源；在最大刺激成骨细胞和前成骨细胞的浓度下，与成纤维细胞相比，使成骨细胞和前成骨细胞中的DNA合成至少增加二倍。
2.权利要求1的分离肽，其特征为该肽由大约52-57个氨基酸组成。
3.权利要求1的分离肽，其特征为该肽含有的氨基酸顺序选自下列构成的一组(a)VPLRSTLESSPG;(b)APFRSALESSPA;(C)APVRPGLESITD，和(d)APARTGLESMTD。
4.权利要求1的分离肽，其特征为该肽具有的氨基酸顺序选自大鼠、人、鸡和鲑鱼N-proCT以及大鼠、人和鸡的N-proCGRP顺序，如图1所示。
5.权利要求1的分离肽，其特征为该肽的长度少于32个氨基酸。
6.一种分离的肽，它含有选自下列一组的顺序(a)VPLRSTLESSPG;(b)APFRSALESSPA;(c)APVRPGLESITD;和(d)APARTGLESMTD。
7.一种刺激成骨细胞和前成骨细胞的细胞分裂的肽的分离方法，包括制备能表达降钙素或降钙素相关基因的细胞的一种含水提取物;分离该含水提取物以富集分子量约小于15000的多肽;和用疏水层析和/或阴离子交换层析分离富集组分，以从该富集组分中分离该肽。
8.权利要求7的方法，其特征为含水提取物的分离步骤包括该含水提取物的反相高效液相层析和凝胶过滤。
9.一种分离的DNA顺序，它具有如下特征为36-180个碱基对;和编码权利要求1-6中的任一种肽。
10.一种用表达载体转染或转化的宿主细胞，该表达载体含有以可操作方式连接于编码权利要求1-6中的任一种肽的DNA顺序的转录启动子。
11.权利要求10的宿主细胞，其特征为该宿主细胞是一种酵母细胞。
12.一种刺激成骨细胞和前成骨细胞的细胞分裂的肽的制造方法，包括在合适的条件下，培养权利要求10或11的宿主细胞，和从该宿主细胞中分离肽。
13.一种治疗组合物，它含有权利要求1-6的任一种肽和与肽混合的一种生理上可接受的载体或稀释剂。
14.权利要求13的治疗组合物，它进一步包含一种生长因子，其量足以使成骨细胞和前成骨细胞中的DNA合成进一步增加，其特征为该生长因子选自由下列构成的一组胰岛素、类胰岛素生长因子、血小板衍生的生长因子、转化生长因子α、转化生长因子β和表皮生长因子。
15.权利要求13的治疗组合物，它进一步包含类胰岛素生长因子I，其量足以使成骨细胞和前成骨细胞中的DNA合成进一步增加。
全文摘要
本发明公开了刺激成骨细胞和前成骨细胞增生的多肽。本发明还公开了该多肽的分离方法或通过采用重组DNA技术制造该多肽的方法。该多肽可用于治疗组合物中，尤其可用于促进病人骨的生长。
文档编号C12N15/09GK1040221SQ8910441
公开日1990年3月7日 申请日期1989年5月3日 优先权日1988年5月3日
发明者伯纲德·A·罗斯, 多哥拉斯·M·布恩, 盖·A·赫华德, 加利·L·麦克耐特 申请人:华盛顿大学董事会, 津莫吉尼蒂克斯公司