专利名称：：体外诱导多巴胺能的细胞的制作方法本申请是1995年6月7日申请的U.S.Ser.No.08/482,079的部分继续申请，而该申请是1994年11月14日申请的U.S.Ser.No.08/339,090的部分继续申请。人们已经证实正进行分化的神经细胞的表型表达和存活以及长成的神经细胞的存活和代谢受各种胞外信号的引导。神经细胞的周围细胞和反应主要通过其释放的生长因子和其他调节因子而在细胞分化的调节、代谢功能和存活中起重要作用。很多神经障碍，包括帕金森疾病，是由于特定的神经细胞群的变性造成的。对于帕金森疾病，连接腹盖和黑质(位于中脑的腹部)与纹状体的含有多巴胺的细胞群的变性同该疾病的病因学有关。为了解导致或能防止这些多巴胺能的途径的变性，对从中脑部位所得的组织进行了广泛的研究。取自中脑组织的胚胎期的含有多巴胺的神经元难以培养，因为多巴胺能的神经元在培养中不能很好存活。然而，当用一种条件培养基或用生长因子处理时，这些培养物显示出存活率提高和/或生化活性的改变。取自中脑的胚胎组织已可生长在衍生于大鼠B49神经胶质细胞系、R33视网膜神经胶质细胞系和JSSchwannoma细胞系[Engele，J.等，“神经科学研究杂志”(J.Neurosci.Res.)，30359-371(1991)]的条件培养基(CM)上。在所有这三种情况下，CM显著增加了培养的多巴胺能的神经元的存活。多巴胺能的神经元存活的提高不是由于多巴胺能的细胞的增殖，而是由于CM对源自中脑培养物的存在的胶质细胞的作用和由此产生的胶质细胞和多巴胺能的神经元之间的相互作用，而不是对多巴胺能的神经元的直接作用。在由中脑星形细胞制成的CM中培养胚胎的中脑组织，或者在一层中脑衍生的星形细胞上共培养组织可以挽救多巴胺能的神经元免于因血清去除而导致的死亡。星形细胞或从纹状体和大脑皮层的星形细胞所制成的CM具明显较弱的保护作用[Takeshima等，“神经科学杂志”(J.Neurosci.)，14(8)4769-4779(1994)]。在一份报导中，源自皮层星形细胞的CM对多巴胺能的细胞存活没有影响，但确实改变这一细胞群的生化特点，导致其对多巴胺吸收的少量增加[Gaul和Lubbert，“伦敦皇家学会会报”(Proc.R.Soc.Lond)B，24957-63(1993)]。生长因子(其中许多存在于衍生于神经组织的CM中)被认为担负着调节多巴胺能的神经元的存活和代谢作用，它们直接或通过对相邻细胞进行作用。所报导的对多巴胺能的神经元存活有直接作用的生长因子包括白介素-6(IL-6)[Hama等，“神经科学”(Neurosci)，40(2)445-452(1991)]，脑衍生神经营养因子(BDNF)[Hyman等，“自然”(Nature)，350230-232(1991)]，碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2，以前称为bFGF)DalToso等，“神经科学杂志”(J.Neurosci)，8(3)733-745(1988)；]Ferrari等，“发育生物学”(DevBiol)，133140-147(1989)；]和由大鼠B49细胞系分泌的胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)[Lin，LG.等，“科学”(Science)，2601130-1132(1993)]，所有这些因子特异地增强了解离的大鼠或小鼠胚胎的中脑培养物中多巴胺能的神经元的存活，但并不增加神经元或胶质细胞的数目。GDNF显著地增加多巴胺能的神经元的形态分化，导致更广的轴突分枝和细胞体的增大。据报道一些生长因子，如神经生长因子(NGF)(Hatanaka和Tsuki(1986)，“脑研究发展”(Dev.BrainRes.)，3047-56)，血小板衍生生长因子(PDGF)和白介素1(IL-1)(Engele&Bohn(1991)，“神经科学”(Neurosci.)，11(10)3070-3078)；Mayer，E.(1993)“脑研究发展”(Dev.BrainRes.)72253-258)和神经生长因子(NGF)(Engele&Bohn，同上)能在胚胎中脑组织中通过一种胶质细胞介导的机制支持多巴胺能的细胞的存活。体内研究表明在中脑和纹状体之间的多巴胺途径中，由机械损伤或化学损伤引起的伤害可以通过用表皮生长因子(EGF)[Pezzoli等，“运动障碍”(MovementDisorders)，6(4)281-287(1991)]和BDNF(Hyman等，同上)处理的方法得到明显减轻。在体外用环AMP治疗，而不用FGF-2或NGF时，可增加培养的中脑多巴胺能的神经元的存活，这些神经元效应于由1-甲基-4-苯基吡锭(MPP+)产生的化学诱导变性(Hyman等，同上；Hartikka等，“神经科学研究杂志”(J.Neurosci.Res.)，32190-201(1992))。尽管使用FGF-2激活的星形细胞CM增强多巴胺的摄入，但当神经元用MPP+进行化学损伤后，用这种CM并无保护作用(Gaul和Lubbert，同上)。从正常情况下产生多巴胺能的神经元(即正常的多巴胺能的组织)的胚胎组织中获得的许多细胞，如中脑和嗅球，在原初培养条件下最终会分化成多巴胺能的神经元。然而在取自正常脑的多巴胺能的部位的组织中，通过与来自神经组织的饲养细胞层共培养可以将更多数目的细胞诱导而分化成多巴胺能的细胞。当胚胎的嗅球神经元与嗅上皮神经元共培养时，嗅球的多巴胺能的神经元数目增加5倍。人们认为存在于上皮细胞中的一种可溶性因子-降钙素基因相关肽(CGRP)决定着嗅球中另外的多巴胺能的神经元的诱导[Denis-Donini，“自然”(Nature)，339701-703(1989)]。在从黑质区获得的胶质细胞饲养层上共培养大鼠胚胎新纹状体和黑质组织一至三周，可以根据从两个部位培养的组织中酪氨酸羟化酶免疫反应性(TH+)指示多巴胺能的细胞表达。然而当同样的组织与从新纹状体获得的胶质细胞共培养时，只在黑质组织中观察到多巴胺能的细胞，而在新纹状体组织中没有[Beyer等，“神经科学通报”(Neurosci.Lett.)，1281-3(1991)]。在新纹状体组织(成体中不含多巴胺能的细胞的部位)中出现TH-IR的机理尚未确定。但这可能是由于效应于纹状体组织存在下黑质细胞饲养层中TH+细胞的诱导；由于纹状体细胞中多巴胺能的特性的诱导；或者是由于纹状体组织中多巴胺能的细胞存活的促进作用，已报道这些细胞在纹状体发育(Tashiro等(1989)，“神经科学通报”(Neurosci.Lett.)，976-10)和皮层发育(Satoh和Suzuki(1990)，“脑研究发展”(Dev.BrainRes.)，531-5)中短暂出现。在含有10％胎牛血清的培养基中，用BDNF和多巴胺联合作用已在大鼠胚胎皮层组织中诱导出少量TH+细胞(140TH+细胞/cm2)。当BDNF或多巴胺单独使用时TH+细胞则较少(Zhou等，(1994)，“脑研究发展”(Dev.BrainRes.)，81318-324)。当与FGF-1一起培养时，可以诱导胚胎小鼠纹状体组织的少量细胞以表达TH+，而采用FGF-1和一种肌肉组织中未鉴定的分子量＞10KD片段一起作用时可获得增强的效果(Du等，(1994)“神经科学杂志”(J.Neruosci.)，14(12)7688-7694)。帕金森疾病特征性的黑质多巴胺能的神经元的变性通常是采用药物治疗以增加自然减少的多巴胺的供给。然而药物治疗涉及一些问题，如出现药物的耐受性和可能的副作用。采用胚胎黑质组织的神经元移植，已显示出对实验诱导的患帕金森疾病的啮齿动物和灵长类，以及一些帕金森疾病的人患者的病情减轻有潜在作用。然而移植存活率不高并且只有有限量的胚胎多巴胺能的组织可以得到。对于一个人的移植来说，要得到足够量的多巴胺能的神经元平均需要4-10个新鲜的人胚胎(Widner等，“新英格兰医学杂志”(N.Engl.J.Med.)，3271556-1563(1992))。优选的治疗是预防或减少出现的变性数量。一旦已发生了损害，优选为用源自培养物中增殖的神经细胞的细胞，植入新的多巴胺能的神经元的方法替代失去的细胞。这一培养物优选为来自非肿瘤细胞系，或取自非特意永生化的细胞以诱导增殖，最优选为来自患者自身的神经组织。或者，采用较少侵入性的治疗，即在体内操作患者自身神经细胞群，以替代受损的多巴胺能的神经元的功能。现有技术表明培养多巴胺能的细胞可采用胶质饲养层获得，或者通过对中脑组织和其他多巴胺能的组织应用某些生长因子或条件培养基。这些处理可以使体外培养的正常的多巴胺能的组织细胞诱导分化、增加存活率或改变代谢。但是诱导其他的、非多巴胺能的脑部位细胞而使之分化成多巴胺能的细胞的培养方法有限。虽然已证明一些部位，如黑质和嗅球(正常情况下含相对多的多巴胺能的细胞的部位)中所得的细胞饲养层，在某些胚胎的中枢神经系统(CNS)组织中可用于诱导多巴胺能的细胞的出现，但没有证据表明非多巴胺能的神组织细胞可用作组织培养物中的饲养层，这一组织培养物是设计用于诱导一些组织，如纹状体(它通常不含有多巴胺)中多巴胺的出现。有时，特别是为了移植和某些药物试验步骤的目的，用完全确定的培养条件以诱导多巴胺能的细胞的分化是有利的。如果细胞既有取自多巴胺能的，也有取自正常情况下非多巴胺能的神经组织时，这将会特别有利，这样可最大限度地增加从单个胚胎产生的多巴胺能的细胞数。本
技术领域：
需要一种可靠的方法，它能在饲养层底物存在或缺少的情况下，诱导来自所有脑部位、取自所有年龄的动物组织的神经细胞，以分化成多巴胺能的细胞。特别地，这有利于那些在正常情况下不含多巴胺能的细胞的部位的细胞中多巴胺表达的诱导，这些部位如纹状体，它们的正常功能需要多巴胺。最近，已经证明了从胚胎和成体组织中所得到的多潜能神经干细胞可在体外增殖而产生大量的神经干细胞子代，这些干细胞子代在适当的条件下，能分化成神经元和神经胶质(PCT申请No.WO93/01275，WO94/16718，WO94/10292和WO94/09119)。这有助于从来源于CNS任何部位的多潜能神经干细胞所增殖的子代中产生多巴胺能的细胞。因此，本发明的一个目的是提供一种方法，将从正常的非多巴胺能的组织中所获得大量神经细胞体外诱导成多巴胺能的细胞，以便为各种应用，如给多巴胺能缺乏的患者进行移植，和在药物筛选过程提供多巴胺细胞可靠的来源。本发明的目的还在于提供一种方法，以诱导未分化的、增殖的多潜能神经干细胞子代，使之分化成多巴胺能的细胞，以便为移植、药物筛选和其他目的提供无限量的多巴胺能的细胞。其中的多潜能神经干细胞子代来自已知含有这些细胞的CNS的任何部位。此外，本发明的目的是用完全确定的培养条件提供组织培养方法，因而在无需饲养细胞层、条件培养基或血清条件下可增加从单个胚胎脑中所得的多巴胺能的细胞数。这些细胞可用于特殊应用，如细胞移植入多巴胺缺乏的患者和某些药物筛选过程。本发明的上述和其他的目的及特征，对于本领域熟练技术人员来说可从下列详细描述和所附的权利要求中明确了解。不能认为前述的参考文献象权利要求那样是对本发明的公开，它是现有技术。提供的参考文献作为背景资料。本发明公开了一种在神经细胞中体外诱导酪氨酸羟化酶表达的方法。该方法包括将神经细胞与一种培养基接触，该培养基至少含有成纤维细胞因子族中的一个因子，和选自由条件培养基和转化生长因子β族的分子所组成的一组因子中至少一种添加剂。这一方法诱导从正常非多巴胺能的神经组织，如纹状体和皮层中所得的神经细胞表达酪氨酸羟化酶。本发明还公开了一种需要多巴胺能的细胞的治疗患者神经障碍的方法。该方法包括将神经细胞接触一种培养基，使之产生进行分化的或分化了的多巴胺能的细胞，并将多巴胺能的细胞移植入患者。上述培养基包含有成纤维细胞生长因子族的至少一个因子和转化生长因子β族的至少一个因子。图1成体小鼠室下区中分裂的室管膜下细胞用超过24小时重复注射BrdU进行标记。在最后一次注射后30分钟之内，处死小鼠并取其脑。取室下区，将解离的细胞培养在含聚L-鸟氨基涂层的盖玻片上，采用完全培养基加有或不加源自大鼠B49胶质细胞系和FGF-2(20ng/ml)的条件培养基。植板后三天，固定细胞并进行TH(EngeneTech，多克隆1∶1000)和BrdU(Amersham，单克隆1∶100)双重标记间接免疫细胞化学试验。同时也具有TH免疫反应性的BrdU标记细胞(进行分裂的室管膜下细胞)只出现在用条件培养基和生长因子的实验中。(A)单个BrdU免疫反应性细胞(箭头)具TH-免疫反应性(B，箭头)表明在条件培养基和生长因子存在下，成体的进行增殖的室管膜下细胞可以通过诱导表达TH。图2单个未解离的6日龄原代神经球，植板于DMEM/F12激素混合液培养基和源自大鼠B49胶质细胞系和FGF-2(20ng/ml)的条件培养基中聚L-鸟氨酸包被的玻璃盖片上。24小时后的免疫细胞化学分析表明出现了TH+细胞。(A)，神经球植板后24小时的相差显微照片。(B)，与(A)中相同的球，经TH免疫细胞化学试验，出现具有神经元形态的至少一个TH+细胞。图3单个未解离的生长6天的第二次传代的神经球用BrdU标记并植板于由纹状体衍生的铺满的星形细胞层上。植板后24小时，细胞进行TH(EngeneTech，多克隆1∶1000)和BrdU(Amersham，单克隆1∶100)双重标记间接免疫细胞化学试验。(A)一个BrdU免疫反应性细胞(箭头)为(B)TH-免疫反应性(箭头)。(C)TH-免疫反应性细胞(细胞)也是MAP-2免疫反应性的(D)，表明其除形态特征外的其他神经元特征。从取自正常的非多巴胺能的神经组织的原代细胞体外诱导多巴胺能的细胞。“多巴胺能的神经组织”指CNS部位中的组织，这些部位已知在成熟时含大量的多巴胺能的细胞体。多巴胺能的细胞是一些神经细胞，它在神经组织中的存在是通过聚合酶链反应技术或针对多巴胺的抗体测定细胞中酪氨酸羟化酶(TH)的存在或多巴胺脱羧酶的存在和/或多巴胺β-羟化酶的缺乏进行的。酪氨酸羟化酶是生化途径中的限速酶，它导致多巴胺的产生并且通常在本领域用作多巴胺能的神经元的标记。多巴胺能的神经组织存在于视网膜、嗅球、下丘脑、背部运动核、孤束核、水管周围灰质、腹盖和黑质。在此所用的“正常的非多巴胺能的神经组织”指来自已发育的CNS部位中非多巴胺能的神经组织的那些组织。采用本发明所公开的方法，诱导从解离的神经组织中所得的原代细胞使之表达酪氨酸羟化酶。“原代神经细胞”指从神经组织中所得的未经体外传代(到第二级培养物)的细胞。原代神经细胞培养物的制备是通过以无菌操作从动物上取组织，解离组织而生成原代细胞的悬浮液和将细胞置于任何已知能支持细胞存活的培养基中。将原代细胞置于含有生长因子的培养基中，这些生长因子能够在从正常的非多巴胺能的神经组织所得的细胞中诱导多巴胺的产生。“生长因子”指一种生物因子(即在CNS细胞中具有功能的生物活性物质)，如蛋白质、肽、氨基酸、脂、糖类、核酸、核苷酸，或者是其他的对神经细胞具有生长、增殖、分化或营养作用的物质，它们可以单独起作用或与其他因子相结合起作用。诱导多巴胺产生的生长因子会同细胞上的受体结合以诱导细胞开始表达，或增加涉及多巴胺产生的多巴胺前体分子和酶的信使RNA(mRNA)的表达。优选的一种生长因子是成纤维细胞生长因子族中的一个(如FGF-1或FGF-2)，或者是能结合到细胞FGF受体上的相当的生长因子。FGF和相当的生长因子可以单独使用或与其他生长因子相结合应用。生长因子通常以大约1-100ng/ml的浓度加入，常用约5-60ng/ml。理想的浓度范围为10-30ng/ml，而以20ng/ml为最优选。当应用FGF族中的一个-硫酸乙酰肝素时，有利于FGF和其受体结合的糖胺聚糖分子可以按0.2μg/ml-20μg/ml的浓度加入培养基中，优选的浓度为0.4μg/ml-4μg/ml，最优选浓度为2μg/ml。在一个优选的实施例中，培养基中含有FGF和转化生长因子β(TGFβ)族中的一个。TGFβ族包括碱性髓鞘蛋白(BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7)、活化素A和B、decapentaplegic(dpp)、60A、op-2、dorsalin、GDFs(1，3和9)、nodal、MIS、抑制素α、转化生长因子β(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β5)和胶质衍生的神经营养因子(GDNF)(见Atrisano等(1994)“生物化学和生物物理学报”(J.BiochemicaetBiophysicaActa)Vol.122271-80)。如果要用TH+细胞进行移植目的或某些药物试验过程，优选是使用含有支持细胞存活所必需的营养物和激素的完全确定的培养基。“完全确定的”意指培养基的所有组分是已知的。有很多确定的培养基可从市场上获得，这里所指的“完全培养基”优选为含有1∶1的Dulbecco改进的Eagle培养基和F12营养物(GIBCO)，加上0.6％葡萄糖、2mM谷氨酰胺、3mM碳酸氢钠、5mMHEPES缓冲液和含有25μg/ml胰岛素、100μg/ml运铁蛋白、20μM孕酮、50μM腐胺和30nM氯化硒的一种确定的激素混合液和盐的混合物(Sigma；体积比为10％)。培养基可以含有条件培养基(CM)，它是将培养基在活细胞作用下，因而含有细胞释放的一些物质，如生长因子。然而加入CM会使培养基变得不确定，因而当细胞用于移植目的和某些药物试验过程中时不能成为优选。CM可以从任何能被培养的、并且在源自正常非多胺能的神经组织细胞中能诱导多巴胺表达的组织中获得，和/或这些组织能削弱多巴胺诱导的生长因子的作用。CM可以按任何量(0-100％)使用。通常培养基中含25-100％的CM。优选的CM为来自胶质细胞的CM。特别优选的是衍生自大鼠B49胶质细胞系的CM[Schubert等，“自然”(Nature)，249224(1974)]和源自星形细胞的CM。将原代细胞培养物进行植板，优选密度范围约为102-107细胞/ml，更优选的密度为106细胞/ml。然后可将细胞培养于任何合适的容器中，如组织培养瓶、孔或培养皿中。容器可以含有或不含有细胞可以附着的表面。当需要细胞附着时，通常需要用一种能产生带离子电荷表面的物质，如聚-D-赖氨酸、聚-L-鸟氨酸、Matrigel、层粘连蛋白、纤连蛋白和其他已知能诱导细胞粘连的物质进行处理。这些细胞能够附着于某些塑料上。然而当用玻璃基质时，最好对其表面进行处理。当不需要附着时，可用玻璃基质或一些未经处理的塑料的组织培养基质。经过聚-L-鸟氨酸处理的培养容器为细胞的粘附提供了特别合适的表面。或者，可以将细胞共培养在任何类型的饲养层上或几种类型细胞相结合的饲养层上，这与培养在一种经处理的基质上不同。优选的用于共培养的是其他神经细胞，如来自CNS任何部位的神经元、星形细胞或少突神经胶质细胞的饲养层。培养物尽可能维持在接近于生理条件。pH应在6-8之间，优选为pH7.2-7.6之间，最优选约为pH7.4。细胞应保持在接近生理水平的温度，即30-40℃，更优选的为32-38℃，最优选为35-37.5℃。细胞应维持在约5％CO2、95％O2和100％湿度。然而培养条件也可以不同。例如在加入1％胎牛血清(FBS)，将培养物在胶质细胞饲养层上共培养24小时后检测出TH+神经元数目的增加，当细胞培养于含有饲养层的未确定培养基上时，也出现检测到的TH+细胞数的增加。一个优选的实施例是将原代细胞培养在含有来自大鼠B49胶质细胞系和FGF-2或EGF和FGF-2结合的CM的培养基上。对于培养在确定培养基中、以用作移植和其他目的的细胞来说，一个优选的实施例是将原始组织直接培养于涂有底物的表面，如涂有聚-L-鸟氨酸的盖玻璃片上，使之处于确定培养基(如完全培养基)和FGF-2同活化素或BMP-2共同作用下。用任何能够测定多巴胺存在的方法，如用针对多巴胺的抗体的免疫细胞化学法或用测定多巴胺吸收以测定多巴胺的细胞的生化活性的方法，以测定多巴胺能的细胞的诱导。可以测定涉及多巴胺合成的前体细胞的出现。例如，检测酪氨酸羟化酶存在的免疫细胞化学测定法或者如聚合酶链反应和原位杂交技术那样的测定法，通过检测mRNA分析多巴胺合成有关的酶的测定法是测定多巴胺能的细胞存在的有用手段。多巴胺能的神经元的鉴定是通过神经元形态分析，或通过双重或三重标记以显示多巴胺或多巴胺前体的存在，以及加上神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白tau-1和MAP-2的免疫反应性，或neu-N(神经元核抗体)或β-微管蛋白和/或溴脱氧尿苷(BrdU)的免疫反应性，其中溴脱氧尿苷标记旺盛分裂的细胞。体外诱导从胚胎和成体哺乳动物神经组织体外增殖所得的多潜能神经干细胞子代所衍生的多巴胺能的细胞对于多潜能神经干细胞已有报道，并且其潜在的用途已有描述[Reynolds和Weiss“科学”(Science)，2551707(1992)；Reynolds等，“神经科学杂志”(J.Neurosci.)，124565(1992)；Reynolds和Weiss，“恢复神经学和神经科学”(RestorativeNeurologyandNeuroscience)，4208(1992)；Reynolds和Weiss，“神经元细胞死亡和修复”(NeuronalCellDeathandRepair)，Cuello编(1993)]。此外，这些细胞的利用描述于公开的PCT申请WO93/01275，WO94/16718，WO94/10292和WO94/09119。这里所用的“神经干细胞”指在一种增殖诱导生长因子的存在下，能在体外被诱导而增殖的未分化的多潜能神经干细胞。其中增殖诱导生长因子有双调蛋白、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF或FGF-1)、碱性成纤维生长因子(b-FGF或FGF-2)、转化生长因子α(TGFα)等等。神经干细胞能够自身维持，意味着随着每一次细胞分裂，一个子细胞也成为一个干细胞。单个多潜能神经干细胞的非干细胞子代(即祖细胞)能够分化成神经元、星形细胞(I型和II型)和少突神经胶质细胞。因而这一神经干细胞为“多潜能”的，因为其子代有多个分化途径。“神经祖细胞”这里指来自神经干细胞的未分化细胞，它本身不是干细胞。祖细胞的一个显著特征是它不同于干细胞，它具有有限的增殖能力，因而不表现出自我维持特点。它通过特殊的分化途径，在适当的条件下，最终分化成神经胶质或神经元。“前体细胞”在此指神经干细胞的子代，因而同时包括了祖细胞和子代的神经干细胞。来自干细胞的CNS前体细胞可用以下实施例3和上述作为参考的公开的PCT申请所描述的方法进行培养。在胚胎中，含有神经干细胞的组织可从任何CNS部位获得，其中包括纹状体、皮层、隔膜、丘脑、腹中脑和脊髓。但在成体中，神经组织优选取自CNS中衬入各室和通道的组织。例如，组织可取自紧靠前脑的侧室(第一和第二)和第三室、脑导管、第四室和中央管的部位。神经组织中效应于生长因子的干细胞培养在含有至少一种生长因子的培养基上。培养基优选为一种确定的无血清培养基。可用于单独或与其他生长因子结合诱导增殖的生长因子，包括可使前体细胞增殖的任何生长因子，其中包括与细胞表面受体结合而对细胞产生营养或生长诱导作用的任何分子。这些因子包括酸性和碱性成纤维细胞生长因子(FGF-1和FGF-2)、表皮生长因子(EGF)、类EGF配位体、双调蛋白、转化生长因子α(TGFα)等等。细胞被诱导而分裂产生对下列物质无免疫反应性的一簇未分化细胞，这些物质包括星形细胞标记—质纤维酸性蛋白(GFAP)；神经元的标记—神经丝(NF)、微管相关蛋白(MAP-2)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)；或少突神经胶质细胞的标记—髓鞘碱性蛋白(MBP)和半乳糖脑苷脂(GalC)。然而细胞簇内的前体细胞对nestin具免疫反应性，nestin是出现于未分化CNS细胞中的一种中间体丝状蛋白。Lehndahl等对nestin标记进行了描述[“细胞”(Cell)，60585-595(1990)]。与可能从前体细胞子代分化而成的神经细胞类型相关的成熟表型主要为nestin阴性。在促细胞分裂原，如EGF、FGF等继续存在下，神经球中的前体细胞继续分裂，导致神经球大小的增加和未分化细胞[nestin(+)，GFAP(-)，NF(-)，MAP-2(-)，NSE(-)，MBP(-)，GalC(-)]的数目增加。在这一阶段，细胞为非粘附性的，并且倾向于形成神经球特征性的自由漂浮簇。但培养条件可以不同，这样前体细胞虽仍表达nestin类型，但它们不形成典型的神经球。细胞的分化可通过本领域已知的、激活导致生长的生物反应级联的任何方法进行诱导，其中包括释放三磷酸肌醇和细胞内Ca4+、释放二酰甘油和激活蛋白激酶C和其他的细胞激酶等等。用佛波酯，诱导分化的生长因子和其他的化学信号处理可诱导分化。也可以通过将细胞植板于固定的基质，如瓶、板或涂有离子带电表面(如聚-L-赖氨酸和聚-L-鸟氨酸等)盖玻片上，以诱导分化。其他基质也可用于诱导分化、如胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、matrigel等。也可以通过将细胞置于悬浮液中，在增殖诱导生长因子的存在下，不进行增殖的再起始(即不解离神经球)而诱导分化。一种诱导神经干细胞子代分化的优选方法，包括将细胞培养在不含增殖诱导生长因子培养基中的固定基质上。去除增殖诱导生长因子后，细胞附着于底物(如聚-鸟氨酸处理过的塑料或玻璃)上展平，并开始分化成神经元和胶质细胞。在这一阶段，培养基可含有血清，如0.5-1.0％胎牛血清(FBS)。但如果需要确定条件作为某些用途时，就不用血清。用本领域熟知的免疫细胞化学技术进行测定发现，在2-3天内，多数或所有的神经干细胞子代开始失去nestin免疫反应性，并且开始表达神经元、星形细胞或少突神经胶质细胞特异性抗原，即分别表现为具MAP-2、GFAP和GalC免疫反应性。总之，已从各种胚胎和成体CNS部位，包括纹状体、脊髓、脑干和下丘脑中分离了CNS干细胞。上述各种分离的CNS干细胞显示出自我维持，并且最终产生包括神经元、星形细胞和少突神经胶质细胞在内的大量分化的子代。因此，干细胞存在于成体哺乳动物CNS的多个部位，并且可以在体外培养以获得大量的未分化神经细胞，这些细胞的分化可能通过应用生长因子和/或其他生物因子进行调节。用这些技术增殖的未分化细胞(细胞悬浮液或完整的神经球)可采用上述诱导原始神经组织中多巴胺能的神经元的同样方法进行培养而产生多巴胺能的细胞。培养的多巴胺能的细胞的移植来源于原代培养物或神经干细胞增殖的前体子代的、含有纯的分化成的多巴胺能的细胞的治疗组合物可以进行制备，并用于受体脑中多巴胺缺乏部位。或者可制备含有进行分化细胞的治疗组合物，这些进行分化的细胞事先培养在诱导多巴胺能的细胞的培养基中。将组合物用于适当的脑部位，在这一部位中细胞的植入在分化过程完成之前进行。移植后多巴胺能的细胞分化可在体内完成。组合物可以含有纯化的细胞，通过任何适当的纯化方法制备而成。这一组合物也可以含有其他种类的神经细胞。可采用任何适当的方法在多巴胺耗尽的部位移植多巴胺能的细胞或前体细胞。授于Gage等的美国专利No.5082670所述的将细胞悬浮液，如成纤维细胞，注入CNS的方法，可用于注射按本文所公开的培养方法制备的经分化的多巴胺能的细胞。其他的途径和方法可见于Biorklund和Stenevi编(1987)的“哺乳动物CNS中的神经移植”(NeuralGraftingintheMammalianCNS)。异种移植和/或同种异体移植可能需要应用免疫抑制技术或诱导宿主耐受性以增加植入细胞的存活率。在某些情况下，可能从受体自身的神经系统(如在活组织检查时取组织)中制备进行分化的或经过分化的多巴胺能的细胞。在这种情况下，可从神经干细胞子代所得的培养物中产生多巴胺能的细胞。在增殖诱导生长因子，如EGF或FGF的存在下培养从解离的神经组织中所得的细胞。在细胞数目适当增加后，将前体细胞与一种生长因子或几种生长因子联合作用，和/或与一种条件培养基或几种条件培养基联合作用，以诱导多巴胺能的细胞的分化。优选地，将细胞进行增殖，并用一种确定的培养基诱导多巴胺表达。将含有进行分化的或已分化的多巴胺能的细胞的一种组合物用于受体脑的适当部位。组合物还可含有生长因子或其他能增强细胞移植后存活的组分。采用培养的多巴胺能的细胞进行药物筛选用本发明公开的方法产生的多巴胺能的细胞也可用于筛选药物或其他化合物对多巴胺能的细胞的作用。可采用公开于同时待审的申请U.S.Ser.No.08/311,099和U.S.Ser.No.08/339,090中的筛选方法。通常要测定药物或其他化合物对进行分化或已分化的细胞产生和/或代谢多巴胺能力的影响。实施例1原代培养物的增殖将E14胚胎期白化小鼠的脑置于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，并解剖以获得纹状体、大脑皮层和中脑。用一支火焰光滑的巴斯德吸管，将神经组织在无血清的培养基(Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM))和F12营养物(GIBCO)中机械解离。将细胞以106细胞/ml的密度植板于24孔Nunclon培养皿中含聚-L-鸟氨酸涂层(15μg/ml；Sigma)的玻璃盖玻片上，每孔加完全培养基0.5ml，或者将细胞共培养于胶质饲养层上。如实施例6所述将生长因子和/或条件培养基和/或1％血清加入孔中。细胞培养在37℃、95％空气/5％CO2的湿润环境中。实施例2从成体室外区所得的细胞中酪氨酸羟化酶表达的诱导成体CD1小鼠以2小时为间隔注射5次BrdU(Sigma，120mg/kg)无菌盐水溶液，以标记脑室下部位室管膜下进行增殖的细胞(Morshead和vanderKooy，“神经科学杂志”(J.Neurosci)，149(1992)]。最后一次BrdU注射后三十分钟，将动物处死。取纹状体，切成1mm的冠状切片并置于人工脑脊髓液(aCSF；124mMNaCl，5mMKCl，1.3mMMgCl2，2mMCaCl2，26mMNaHCO3和10mMD-葡萄糖(pH7.35，～280mOsmol))室温下充以95％CO2。在aCSF中经15分钟，将室下区进行显微解剖，切成小块并转至带有磁力搅拌器的旋转瓶(BelloGlass)，内含低Ca2-aCSF溶液(124mMNaCl，5mMKCl，3.2mMMgCl2，0.1mMCaCl2，26mMNaHCO3和10MMD-葡萄糖(pH7.35，～280mOsmol)，1.33mg/ml的胰蛋白酶(9000BAEF(苯甲酰-L-精氨酸乙酯)单位/mg)，0.67mg/ml的透明质酸酶(2000单位/mg)和0.2mg/ml的犬尿喹啉酸。这一溶液在32℃～35℃下用95％CO2/5％O2充气。经过90分钟，将组织切片转至正常aCSF5分钟，然后置于含0.7mg/ml卵类粘蛋白(Sigma)的DMEM/F12培养基中。用一支经火焰收窄的巴斯德吸管机械捣碎组织。细胞在400r.p.m离心5分钟，并重新悬浮于含有或不含条件培养基的完全培养基。该条件培养基来源于大鼠B49胶质细胞系(见实施例5)和FGF-2(20ng/ml)。将细胞植板于24孔Nunclon组织培养皿上含聚-L-鸟氨酸涂层的玻璃盖片上，在37℃、100％湿度、充以95％CO2/5％O2下培养3天。细胞然后按实施例11所述固定和进行TH和BrdU双重标记间接免疫细胞化学试验。BrdU标记的细胞(同时也是TH-IR的细胞)只出现在那些用CM和GF-2处理的细胞中(图1)，表明了在CM和生长因子的存在下，成体正进行增殖的室下区细胞可被诱导而表达TH。实施例3胚胎干细胞的分离和增殖A.小鼠干细胞将胚胎期14天(E14)的CD1白化小鼠(CharlesRiver)断头，并用无菌操作取脑和纹状体。用火焰光滑的巴斯德吸管将组织机械解离入完全培养基中。将细胞在800r.p.m下离心5分钟，吸取上清液，并将细胞重新悬浮于DMEM/F-12培养基中以便计数。将细胞重悬于含16-20ng/mlEGF(从小鼠颌下纯化而来，CollaborativeResearch)或TGFα(人的重组体，Gibco)的完全培养基中，以0.2×106细胞/ml浓度植板于经不含底物预处理的75cm2的组织培养瓶(Corning)中，置于37℃、100％湿度、95％空气/5％CO2的培养箱中。细胞在开始48小时内进行增殖，并且至体外培养天数(DIV)3-4天，这些细胞在4-6DIV之间形成升离基质的神经球。经7DIV，取神经球在400r.p.m下离心2-5分钟，将沉淀用火焰光滑的玻璃巴斯德吸管机械解离至2ml完全培养基中，使沉淀成为单个细胞。将1×106细胞重新植板于装有20ml含EGF的完全培养基的75cm2组织培养瓶中。干细胞的增殖和新的神经球的形成重新开始。这一过程可每隔6-8天重复一次。B.人体干细胞按照常规吸取流产法所得的人胎儿前脑组织(受孕10.5周后)用火焰光滑的巴斯德吸管机械解离，并置于完全培养基中。将细胞在800r.p.m下离心5分钟，吸取上清液，并将细胞重新悬浮于DMEM/F-12培养基中以计数。细胞重悬于含20ng/mlEGF(ChironCorp)和10ng/mlFGF-2(R&DSystems)的完全培养基中，以约1.5×106细胞/ml浓度植板于用不含底物预处理的培养瓶(NunclonT175)中，并置于37℃、100％湿度、95％空气/5％CO2的培养箱中。细胞经5天后增殖，至第10天开始形成神经球，神经球从第21天起升离基质。经过15DIV，取神经球在1500r.p.m下离心7分钟。沉淀通过在2ml完全培养基中捣150次使之机械解离成单个细胞。细胞进行计数并以1.5×106细胞/ml浓度再植板于装有含EGF和FGF-2的25ml完全培养基的各培养瓶(NunclonT175)中。干细胞的增殖和新神经球的形成重新开始，这一过程可每隔2-3周重复(即这些细胞可以传代)一次。实施例4胶质饲养层的制备取出生后小鼠(0-24小时)中所得的纹状体组织制备星形细胞胶质细胞饲养层。将神经组织解剖、切碎并转入装有DMEM/F12(1∶1)/10％FBS的15ml离心管。组织用火焰光滑的玻璃吸管捣碎并以150,000细胞/ml的密度植板于含有20mlDMEM/F12/10％FBS的Corning培养瓶。当原代星形细胞胶质细胞达到铺满时，解离细胞(用胰蛋白酶-EDTA)并以200,000细胞/cm2密度植板于24孔培养皿中含聚-L-鸟氨酸涂层的玻璃盖片。经过3-4天细胞重新铺满。在将细胞或神经球共培养于星形细胞饲养层上(实施例6和7)之前，将取自原始组织培养物的细胞或培养6天的BrdU标记的第二次传代的神经球(实施例3)洗二遍，并重新悬浮于新鲜培养基(不含血清、EGF或BrdU)。实施例5条件培养基的制备用星形细胞或大鼠B49胶质细胞系制备条件培养基(CM)[Schubert等，“自然”(Nature)，249224(1974)]。制备一种星形细胞胶质细胞饲养层(实施例4)。在收集CM之前星形细胞层经一次传代。在同星形细胞相同的条件下培养大鼠B49胶质细胞系细胞。铺满的星形细胞或大鼠B49胶质细胞系培养物用PBS冲洗一次，用无血清的完全培养基洗二次，并培养在20ml同样的培养基中。在培养开始后24、48、72小时收集CM，并在1000-2000r.p.m.下离心以除去细胞或碎片。CM贮存于-80℃下。实施例6在来自原始培养物细胞中体外诱导TH-IR示例1如实施例1所述制备从纹状体和大脑皮层组织所得的原代培养物。在植板时(时间t＝0)，将完全培养基(对照)、EGF(20ng/ml；Chiron)，重组的FGF-2(20ng/ml；R&DSystems)、EGF+FGF组合、星形细胞(ACM)或大鼠B49胶质细胞系条件培养基(BCM；见实施例5)以单个或相结合方式加入各孔中。将1％FBS(UpstateBiotechnologyIncorporated)加入50％不含条件培养基的孔中。植板后24小时进行检测TH+细胞(实施例5)的免疫细胞化学分析。结果概述于表1。向无CM孔中加入1％FBS使含有生长因子的TH+细胞数增加三倍。FGF-2+BCM的组合产生了变化最明显的结果，平均产生约5000TH+细胞/cm2。表1纹状体和皮层原代培养物中每cm2生成的TH+细胞的平均数纹状体皮层无FBS1％FBS无FBS1％FBS对照421229EGF10*1814*25*FGF326112872295EGF+FGF350166875229ACM10*---ACM+EGF10*---ACM+FGF1468---ACM+E+F1645---BCM16---BCM+EGF26---BCM+FGF5397---BCM+E+F4470---*超过对照值的增加不明显。n＝4示例2在共培养于星形细胞饲养层(实施例4)之前，先将从原代培养物(实施例1)所得的细胞冲洗二次，重新悬浮于新鲜培养基中，其中含有完全培养基(对照)或完全培养基加上EGF、FGF-2或EGF和FGF-2组合(各生长因子20ng/ml)，1μMBrdU和1％FBS。对培养24小时后的细胞进行间接免疫细胞化学测定(实施例11)。与只培养于完全培养基中的细胞相比，在共培养于FGF-2或EGF+FGF-2的纹状体细胞中检测到TH-IR显著增加。在只有EGF存在下观察到小的但却有明显的增加。来自皮层的原代细胞显示对单独EGF和FGF(比对照值有显著增加)有相似的效应，但TH-IR的最大增加值见于EGF和FGF-2共同作用。如BrdU吸收所显示的，即使在生长因子存在下从中脑所得的细胞中很少有处于有丝分裂活跃的。结果概述于表2。表2实施例7用确定培养基体外诱导TH表达如实施例1所述制备从纹状体和大脑皮层组织所得的原代培养物。在植板时将完全培养基(对照)、FGF-2(20ng/ml；R&DSystems)、BMP-2(50ng/ml；ChironCorp)和活化素(50ng/ml；ChironCorp)以单个或相结合(完全培养基+FGF-2和BMP-2，或完全培养基+FGF-2+活化素)形式加入各个孔中。植板后24小时进行免疫细胞化学分析以检测TH+细胞(实施例11)。结果概述于表3。FGF-2加上活化素或FGF-2加上BMP-2产生最明显结果，使每cm2平均约生成5000TH+神经元。与之相比，只含有完全培养基的对照每cm2只产生平均2TH+细胞。表3；每cm2中具TH+免疫反应性的细胞数目培养基补充剂#TH+细胞不含补充剂(对照)2±1FGF-2210±29BMP22±1活化素0FGF-2+BMP24622±1207FGF-2+活化素4930±289</table></tables>实施例8用确定的培养基在神经干细胞衍生的前体细胞子代中体外诱导TH-IR示例1将单个未解离的培养6天的原代神经球(见实施例3)，在含有或不含大鼠B49胶质细胞系衍生的CM(实施例5)+20ng/mlFGF-2的完全培养基中含聚-L-鸟氨酸涂层的玻璃盖片上植板，并且在37℃、5％CO2，95％空气、100％湿度下培养。植板后经24小时，测定TH+间接免疫细胞化学(见实施例11)结果显示在含CM和FGF-2孔中有TH+细胞，及其反应和神经元形态的出现(图2)，而只含完全培养的孔中没有。示例2在将神经球共培养于含有完全培养基或完全培养基加FGF-2(20ng/ml)的星形细胞饲养层前，先将单个的未解离的培养6天的第二次传代的神经球(实施例3)用BrdU标记，洗二次并且重新悬浮于新鲜培养基中。对培养24小时的细胞进行间接免疫细胞化学(实施例11)。在用FGF-2培养的神经球中观察到MAP-2染色阳性的具有神经元形态的TH-IR细胞。有几个TH+细胞显示BrdU免疫反应性(图3)。实施例9用确定的培养基在神经干细胞衍生的子代中体外诱导TH-IR将单个未解离的培养6天的原代神经球(见实施例3)，在含有20ng/mlFGF-2和20ng/mlBMP-2相结合或20ng/mlFGF-2和2ng/ml活化素相结合(实施例7)的完全培养基中含聚-L-鸟氨酸涂层的玻璃盖片上植板，并且培养于37℃、5％CO2/95％空气、100％湿度下。用TH-免疫反应性测定多巴胺能的神经元数目(实施例11)，实施例10人胚胎神经干细胞衍生子代中TH-IR的体外诱导按实施例3B所述将人神经干细胞进行增殖并传代35次，以增加细胞量。从最后一次传代中取培养12天的神经球。将所得神经球在完全培养基中清洗、悬浮和机械解离。将神经球在对照(完全培养基)或TH诱导条件(0.8ml/孔；75％大鼠B49胶质细胞系衍生的CM(实施例5)+20ng/mlFGF-2)下植板于24孔Nunclon培养皿中含聚L-鸟氨酸涂层(15μg/ml)玻璃盖片(密度0.3×106细胞)上。此外，培养单独含有CM(75％)或FGF-2(20ng/ml)的细胞制备物，以测定当它们单独使用时的效果。将细胞培养于37℃、5％CO2/95％空气、100％湿度中。经1DIV和3DIV，按实施例11所述测定TH-IR细胞数。结果示于表4。表4每cm2中TH+的细胞数实施例11免疫细胞化学细胞用4％低聚甲醛固定30分钟，然后PBS洗三次，每次10分钟。细胞与初级抗TH的抗体(兔多克隆1∶1000，EngeneTechInternationalInc.或1∶100，Pel-freeze)在37℃下保温2小时。该抗体在PBS/10％普通羊血清/0.3TritonX-100中配制。在PBS中洗三次后，将羊抗兔罗丹明(Jackson)加入PBS中室温下30分钟。有时用MAP-2(Boehringer-Mannheim)以鉴定神经元。细胞然后在PBS中清洗三次，每次10分钟，然后用水冲洗并置于玻璃载片上，盖上盖玻片，用Fluorosave(Calbiochem)作为计数培养基。在200倍的放大倍率下通过计算每cm2TH免疫反应性(TH+)测定多巴胺能神经元数目。实施例12多巴胺能细胞的移植A将源自培养的人神经干细胞的细胞移植入帕金森疾病的小鼠模型如实施例3B所述在培养物中增殖人胚胎前脑干细胞，并传代35次。在移植前三天，取漂浮的神经球并用两种方法之一进行处理，以促进神经元分化成TH表型。采用第一种促进TH方法时，将细胞按上述实施例10所述处理(将1μMBrdU加至培养基中)。移植当天，冲洗细胞、用胰蛋白酶/EDTA进行解离，然后用胰蛋白酶抑制剂处理。细胞以20×106细胞/ml密度悬浮于HBSS中用于移植。对于第二种促进TH的方法，将细胞置于未经处理的瓶中，以使神经球仍处于漂浮状态。培养基的组分同第一种方法相同。移植当天，冲洗细胞，轻轻捣碎，然后以21×106细胞/ml密度悬浮于HBSS中以用于移植。在移植过程中所有细胞贮于4℃。为建立帕金森疾病模型，让宿主Wistar大鼠单侧接受4μl浓度为2μg/ml的6-OHDA(6-羟基多巴胺；Sigrma)溶液，以损伤同侧的黑质致密层的多巴胺能的神经元。16天以后将人干细胞子代移植入同侧的纹状体。5个动物接受按第一种TH增强法处理的细胞，5个动物接受按第二种方法处理的细胞。经1周、6周和3个月后处死动物。动物用乙醛透心灌注，取脑组织并切成10μm厚度的切片，然后将组织直接置于显微镜载玻片上。采用抗BrdU和TH的抗体，用双重免疫染色技术光镜鉴定含有酪氨酸羟化酶(TH+)的移植细胞。着色不同的底物使双重标记的细胞得到鉴定，这表明有一群移植的细胞分化成多巴胺能的表型的神经元。B帕金森疾病的特征是通向纹状体的多巴胺能的途径发生变性，导致这一部位多巴胺量的减少。这一疾病的特征是肌肉强直、震颤和其他运动异常。从人胎儿组织制备成的前体细胞进行增殖(实施例3B)并诱导其分化成多巴胺能的细胞(实施例11)。将多巴胺能的细胞定向注射入帕金森疾病患者的纹状体。需要时还可进行加强剂量注射。或者从帕金森疾病患者脑活检中所得的神经组织制备前体细胞，并诱导而分化成多巴胺能的细胞(实施例7或8)，定向注射入患者的纹状体。或者，可以将前体细胞培养在含有能诱导多巴胺能的细胞形成的培养基中，并且将前体细胞植入帕金森疾病患者的纹状体中，在那里前体细胞在体外分化成多巴胺能的细胞。用运动控制的改善作为移植成功的指标。实施例12用培养的多巴胺能细胞进行药物筛选将一种广泛用治疗精神病的药物-Prozac加入实施例6、7、8、9、10所培养的多巴胺能细胞中，浓度范围为1ng/ml至1000ng/ml。测定该药物在不同浓度下对细胞代谢和存活的影响。所有参考文献、专利和专利申请引入此文作为参考。权利要求1.一种体外诱导神经细胞中酪氨酸羟化酶表达的方法，包括将所述神经细胞接触一种培养基，其中含有成纤维细胞生长因子族中至少一个成员，和选自由条件培养基和转化生长因子β族成员所组成的一组物质中的至少一种添加剂。2.权利要求1的方法，其中所述的培养基是确定的，所述的成纤维细胞生长因子族中的成员是FGF-2，所述的添加剂是选自由活化素和成骨蛋白-2所组成的一组因子中的一个成员。3.权利要求1的方法，其中所述的神经细胞培养在选自由聚-D-赖氨酸、聚-L-鸟氨酸、Matrigel、层粘连蛋白、纤连蛋白所组成的一组中的一种离子带电表面上。4.权利要求3的方法，其中所述的的带电表面为聚-L-鸟氨酸。5.权利要求1的方法，其中所述的神经细胞取自正常的非多巴胺能的神经组织。6.权利要求5的方法，其中所述的正常的非多巴胺能的神经组织选自由纹状体和皮层组成的一组神经组织。7.权利要求1的方法，其中所述的添加剂为条件培养基，它选自由星形细胞条件培养基和胶质细胞条件培养基组成的一组条件培养基。8.权利要求7的方法，其中所述的条件培养基来源于大鼠B49胶质细胞系。9.权利要求1的方法，其中所述的培养基还含有血清。10.权利要求1的方法，其中所述的神经细胞培养于不含饲养层条件下。11.权利要求1的方法，其中所述的神经细胞为取自胚胎组织的原始细胞。12.权利要求1的方法，其中所述的神经细胞为至少一个多潜能神经干细胞的子代，它是在一种增殖诱导生长因子的存在下体外增殖而成的。13.权利要求12的方法，其中所述的多潜能神经干细胞来自成体神经组织。14.一种体外诱导原代神经细胞中酪氨酸羟化酶表达的方法，包括将所述的神经细胞与一种离子带电的表面在一种确定培养基中接触，其中离子带电表面选自由聚-D-赖氨酸、聚-L-鸟氨酸、Matrigel、层粘连蛋白、纤连蛋白所组成的一组表面，其中确定的培养基含有成纤维细胞生长因子族的一个成员和转化生长因子β族的至少一个成员。15.权利要求14的方法，其中所述的成纤维细胞生长因子族的成员为FGF-2，所述的转化生长因子β族的成员选自由活化素和成骨蛋白-2组成的一组成员。16.权利要求14的方法，其中所述的原代神经细胞取自正常的非多巴胺能神经组织。17.一种从正常的非多巴胺能的神经组织获得的神经细胞中诱导酪氨酸羟化酶表达的方法，包括将所述神经细胞与一种饲养层和含有成纤维生长因子的培养基接触。18.权利要求17的方法，其中所述的饲养层来源于正常的非多巴胺能的神经组织。19.权利要求17的方法，其中所述的培养基还含有血清。20.权利要求17的方法，其中所述的神经细胞是至少一个多潜能神经干细胞的子代，它是在生长因子存在下体外增殖而来。21.权利要求17的方法，其中所述的正常的非多巴胺能的组织选自由纹状体和皮层所组成的一组组织。22.权利要求17的方法，其中所述的培养基还含有条件培养基。23.权利要求22的方法，其中所述的条件培养基来源于胶质细胞。24.权利要求22的方法，其中所述的条件培养基来源于星形细胞。25.权利要求22的方法，其中所述的条件培养基来源于大鼠B49胶质细胞系。26.权利要求18的方法，其中所述的培养基还含有血清。27.一种治疗需要多巴胺能细胞的患者神经疾病的方法，包括将进行分化或经分化的多巴胺能的细胞移植入需要多巴胺能的细胞的患者的CNS部位，所述的进行分化的或经分化的多巴胺能细胞通过将神经细胞与一种培养基接触，该培养基中含有成纤维细胞生长因子族中的一员和转化生长因子β族中的至少一员。28.权利要求27的方法，其中所述的病人患帕金森疾病，所述的进行分化或经分化的多巴胺能细胞用于所述病人的纹状体。29.权利要求27的方法，其中所述的成纤维细胞生长因子族的成员为FGF-2，所述的转化生长因子β族的成员选自由活化素和成骨蛋白所组成的一组因子。30.权利要求27的方法，其中所述的培养基是确定的。31.权利要求27的方法，其中所述的神经细胞取自所述患者的CNS。32.一种筛选存物对多巴胺能的细胞作用的方法，包括a)在一种培养基中培养取自神经组织的神经细胞，以产生多巴胺能的细胞，这种培养基含有成纤维细胞生长因子族中的至少一员和选自由条件培养基和转化生成因子β族成员组成的至少一种添加剂，b)对所述的多巴胺能的细胞使用一种药物，和c)观察所述药物对所述多巴胺能的细胞的效果。33.权利要求32的方法，其中所述的效果根据测定所述多巴胺能的细胞产生或代谢多巴胺能的能力来决定。34.一种治疗神经疾病或障碍的治疗组合物，所述组合物含有源自神经细胞的进行分化的或经分化的多巴胺能的细胞，其中的神经细胞体外培养在含有成纤维细胞生长因子族的一员和转化生成因子β族的至少一员的培养基中。35.权利要求34的治疗组合物，其中所述的成纤维细胞生长因子族的一员为FGF-2，所述的转化生长因子β族的一员选自由活化素和成骨蛋白组成的一组因子。36.权利要求34或35的治疗组合物，其中所述的培养基是确定的。37.权利要求34-36任意一项中的治疗组合物，其中所述的神经细胞取自所述患者的CNS。全文摘要神经细胞中酪氨酸羟化酶的体外表达可通过将神经细胞与一种培养基接触进行诱导,该培养基至少含有成纤维细胞生长因子族中一员,并配合条件培养基或转化生长因子β族的分子。本方法诱导从正常情况下非多巴胺能的神经组织,如纹状体和皮层中所得的神经细胞,使之表达酪氨酸羟化酶。这些细胞可用于治疗需要多巴胺能的细胞的患者的神经障碍。文档编号A61K38/44GK1170434SQ95196843公开日1998年1月14日申请日期1995年11月14日优先权日1994年11月14日发明者塞缪尔·韦斯,布伦特·A·雷诺兹申请人:纽罗斯菲里斯控股有限公司