专利名称：：抗人纤维蛋白单克隆抗体重链和轻链可变区基因及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗人纤维蛋白单克隆抗体重链和轻链可变区基因，由所述基因编码的多肽，含有所述基因的载体及所述的基因在制备血栓定位诊断试剂和溶血栓药物中的应用。免疫球蛋白是由多基因重排产生的糖蛋白大分子，其由两条重链和两条轻链结合而成，其中根据其不同种属来源的免疫球蛋白的氨基酸序列的保守性，重链和轻链又可分为恒定区和可变区。重链和轻链可变区构成的抗原结合单位是免疫球蛋白特异性识别和结合抗原的关键，因此，重组可变区基因产生的肽链有小抗体之称。这种由免疫球蛋白重链和轻链可变区组成的单链抗体分子(scFV)只有30KDa左右，能进入机体的各种组织，又能很快地从机体中清除，而且没有FC受体导致的非抗原特异性结合，是病变定位诊断的理想探针。由免疫球蛋白重链和轻链可变区基因重组产生的功能性小抗体scFv能特异性识别和结合抗原。但因缺少恒定区效应分子，scFv本身不会引起全抗体的生物学效应。利用scFv的抗原结合特异性把其它效应分子带到靶位，是人工制备功能性小抗体的目的。用放射性核素标记的scFV定位诊断肿瘤已有报导(ColcherD.etal，J.Natl.CancerInst.1990，821191-1197)。不同scFV分子还能共价结合构成双功能抗体(GruberM.etal，J.Immun.1994，1525368-5374；JongeJDetal，Mole.Immun.1995，321405-1412)，或与其它效应分子如免疫毒素、细胞毒药物、细胞因子或放射性核素等结合构成“魔弹”，已在肿瘤治疗中显示了好的应用前景(WinterG.etal，Nature，1991，349293-299；ChaudharyVKetal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，871066-1070；YangJ.etal，Mole.Immun.1995，32873-881；WelsW.etal，CancerRes.1992，526310-6317)，促进了各种各样基因工程抗体的研究。针对严重危害人类生命的癌瘤，Chaudhqry等(文献同上)用anti-Tac可变区把免疫毒素带到恶性淋巴细胞，Xiang等(CancerBiother，1993，8327-337)用抗肿瘤细胞单抗可变区与Gamma干扰素或肿瘤坏死因子在基因水平拼接，产生融合子，提高了这些细胞因子在肿瘤局部的浓度，减少了它们的毒副作用。这是肿瘤治疗研究中一些成功的例子。除癌瘤外，由纤维蛋白凝块构成的血栓是这类研究的又一个重要目标，研究结果表明抗纤维蛋白scFV可用于深部静脉血栓的定位诊断，也可与溶栓药物如尿激酶结合延长后者的半清除时间和增加导向性能(HolvoetP.etal，Blood，1993，81696-703)。由此提示采用上述融合分子治疗血栓病时可用较低的剂量，从而减少尿激酶等溶栓药物的严重副作用，是目前溶栓治疗中最具希望的途径。蛋白水平拼接产生的抗纤维蛋白可变区和尿激酶的融合分子在动物实验中显示的良好溶栓性能，促进了基因水平拼接抗纤维蛋白可变区和各种溶栓药物的研究。本发明人以能分泌抗人纤维蛋白单克隆抗体的杂交瘤为出发点，利用聚合酶链反应从杂交瘤的总RNA中扩增出免疫球蛋白重链和轻链可变区基因，经过重组表达出能识别人纤维蛋白的scFV，由此完成了本发明。因此，本发明的一个目的在于提供一种抗人纤维蛋白单克隆抗体重链可变区基因和轻链可变区基因，两者重组后可表达出特异性识别和结合人纤维蛋白的抗体活性片段。本发明的另一个目的在于提供由所述的抗人纤维蛋白单克隆抗体重链可变区基因和轻链可变区基因编码的多肽产物。本发明的再一目的在于提供含重链可变区基因和轻链可变区基因的表达载体。本发明的又一目的在于所述的抗人纤维蛋白单克隆抗体重链可变区基因和轻链可变区基因在制备溶血栓药物中的应用。根据本发明，提供了一种抗人纤维蛋白单克隆抗体重链可变区基因，称为VH-8E5，全长为375bp，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO1所示。所述的基因包括IgG2b框架区和三个互补决定区(CDR)，其中CDR1为15bp，位于SEQIDNO.1的第85-99位核苷酸；CDR2为51bp，位于SEQIDNO.1的第142-192位核苷酸；CDR3为33bp，位于SEQIDNO.1的第289-321位核苷酸。此三个CDR区是特异性结合人纤维蛋白的重要结构。根据本发明，提供了一种抗人纤维蛋白单克隆抗体轻链链可变区基因，称为VH-8E5，全长为366bp，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO2所示。所述的基因的特征是具有三个互补决定区(CDR)，其中CDR1为51bp，位于SEQIDNO.2的第70-120位核苷酸，CDR2为21bp，位于SEQIDNO.2的第166-186位核苷酸，CDR3为27bp，位于SEQIDNO.2的第283-309位核苷酸。同样，此三个CDR区是特异性结合人纤维蛋白的重要结构。本发明的VH-8E5基因与轻链可变区基因VK-8E5匹配而表达的单链抗体分子scFv-8E5可用于血栓定位诊断和制备溶血栓融合蛋白。本发明的VH-8E5基因的DNA序列分析结果与数据库中的DNA序列比较，证明我们分离的免疫球蛋白重链可变区基因是独特的，数据库中没有与之完全相同的DNA序列。VH-8E5和同一来源的VK-8E5基因重组后的表达产物分子量约30KDa(见下述实施例3的结果)，其特异性识别和结合人纤维蛋白的能力说明这个scFv分子在宿主菌中进行了正确的折叠。本发明还涉及本发明的重链可变区基因VH-8E5与轻链可变区基因VK-8E5的重组表达产物scFv-gE5，其抗原决定簇为人纤维蛋白B链N端7肽，这种7肽只产生于纤维蛋白原水解之后，并暴露在纤维蛋白表面，因此这种单链抗体分子能特异性识别纤维蛋白。研究结果证明这个scFv分子确有抗原识别特异性，是与各种溶栓药物作分子拼接的必要材料。其C末端的游离半胱氨酸，便利于放射性核素标记，用于深部静脉血栓定位诊断。因此本发明的再一方面即为所述的抗人纤维蛋白单克隆抗体重链可变区基因和轻链可变区基因在制备血栓病的诊断和溶栓治疗的药物中的应用。本发明的又一方面是含所述重链可变区基因VH-8E5及轻链可变区基因VK-8E5的表达载体，所述的表达载体可以是原核表达载体，也可以是真核表达载体，优选为原核重组表达载体如pOPE51-8E5，pOPE51-8E5来源于pOPE51-215(后者得自Dubel博士，德国肿瘤研究中心)。pOPE51-215载体带有lac启动子和果胶酶先导序列，调控其下游的抗果蝇melanogasterRNA聚合酶II小鼠单克隆抗体scFv的表达，其3′末端的c-myc短肽密码子可作为表达产物的标记，5个组氨酸密码子用于表达产物的纯化(KipriyanovSM等人，分子免疫学，1994，311047-1058)。pOPE51-8E5是用本发明的VH-8E5基因和VK-8E5基因代替pOPE51-215中相应的抗果蝇melanogasterRNA聚合酶II小鼠单克隆抗体scFv的基因。利用所述的表达载体可以很容易地表达单链抗体可变区重组蛋白。单克隆抗体原本产生于杂交瘤细胞，早期的基因工程抗体也是在真核细胞中表达。大肠杆菌能在低耗培养基中快速而大量的繁殖，已成为现代许多基因工程产品的宿主。用大肠杆菌表达工程抗体也是多数人的选择。本发明中优选采用的表达系统pOPE51-8E5充分利用了细菌高产的优点。用果胶酶先导序列弥补了细菌不能处理加工蛋白的缺陷，只要通过过夜培养细菌和3小时的IPTG诱导表达就能获得占总蛋白含量7.3％的功能性scFv，这非常有利于研究新的产品。为获得高产，可增加诱导剂IPTG的浓度到100μM，此时表达产物可达宿主菌总蛋白的28.9％。但由于浓度太高，超过了细菌的加工处理能力，形成许多不溶解的包涵体。我们通过离心回收的包涵体中含有54％的表达产物。附图的简述图1为经逆向聚合酶链反应(RT-PCR)扩增8E5杂交瘤细胞的mRNA后的产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M道示出分子量标记(由上至下依次为1631，517/506，396，221/220)，1-2道为本发明的轻链可变区VK-8E5基因，3-4道为本发明的重链可变区VH-8E5基因。图2示出本发明的轻链可变区VK-8E5基因和重链可变区VH-8E5基因的克隆策略示意图。图3为包含本发明的轻链可变区VK-8E5基因和重链可变区VH-8E5基因的表达载体pOPE51-8E5的示意图。图4为本发明的表达载体pOPE51-8E5转化大肠杆菌JM109后经或不经IPTG诱导后的表达产物的SDS-PAGE电泳图(A)和相应的蛋白质印迹分析图(B)。图中，1道为未诱导的转化子总蛋白，2道为100μMIPTG诱导的转化子总蛋白，3道为未诱导的转化子的壁膜间蛋白，4道为20μMIPTG诱导的转化子的壁膜间蛋白，5道为未诱导的转化子包涵体蛋白，6道为100μMIPTG诱导的转化子包涵体蛋白。以下将参照实施例和附图对本发明作进一步的描述，但并非限制本发明。实施例1抗人纤维蛋白单克隆抗体重链可变区基因VH-8E5及轻链可变区基因VK-8E5的分离1、细胞系和载体杂交瘤细胞系8E5由林汉教授提供(中国医学科学院放射医学研究所)。8E5细胞来源于人纤维蛋白β链N端7肽免疫小鼠，能分泌抗人纤维蛋白单克隆抗体，可用于免疫球蛋白可变区基因分离。基因克隆中间载体pUC18及基因分离过程中所需的Taq聚合酶、DNA聚合酶、限制性内切酶及化学试剂均购自Gibco公司。表达载体pOPE51-215由Dubel博士提供(德国肿瘤研究中心)。这个载体带有lac启动子和果胶酶先导序列，调控其下游的抗果蝇melanogasterRNA聚合酶II小鼠单克隆抗体scFv的表达，其3′末端的c-myc短肽密码子可作为表达产物的标记，5个组氨酸密码子用于表达产物的纯化(KipriyanovSM等人，分子免疫学，1994，311047-1058)。2、重链可变区和轻链可变区cDNA克隆和序列分析克隆策略如图2所示，采用常规的硫氰酸胍提取和氯化铯离心方法(分子克隆实验手册，第2版)从107个8E5杂交瘤细胞制备总RNA，再用oligo-dT柱分离mRNA作为模板，用oligo-dT引物和逆转录酶制备第一链cDNA后，通过聚合酶链式反应(PCR)获得免疫球蛋白重链可变区cDNA。为了扩增gamma重链可变区cDNA，设计使用VH-5′引物(5′AGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTG)和VH-3′引物(5′TGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTTGGC)。PCR扩增进行于100μl反应系统，其中有第一链cDNA20-25ng，上述引物各25pmol，dNTPs各200μM，和1单位TaqDNA聚合酶。用Hybaid控温仪(英国Hook公司)改变温度，95℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，经过25个循环获得扩增产物。PCR产物经琼脂糖电泳鉴定，检出380bp左右的扩增带，如图1所示。扩增产物经琼脂糖电泳纯化后用DNA聚合酶Klenow大片段补平，插入经SmaI酶消化和脱磷酸的中间载体pUC18中，得到的载体命名为pUC18VH，用其转化大肠杆菌JM109，在LB培养基中用XGal和异丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)筛选白色阳性菌落。取单菌落扩增后提取重组质粒pUC18VH，酶切后琼脂糖电泳鉴定。为了DNA序列分析，选取鉴定无误的阳性克隆，扩增后提取质粒DNA，用SmaI切下VH基因片段并用DNA聚合酶Klenow大片段补平，再插入测序载体M13mp19的SmaI切点，转化大肠杆菌JM109，再用XGal和IPTG筛选。取阳性单个菌落扩增，离心沉淀细菌，收集上清提取单链DNA，用荧光素标记的双脱氧核苷酸和Taq酶测序试剂盒(美国ABI公司)在ABI370A型序列仪(美国ABI公司)上作DNA序列分析。根据DNA序列分析结果，选出框架正确的VHcDNA克隆，该克隆被命名为VH-8E5，其序列如序列表的SEQIDNO.1所示。将VH-8E5的DNA序列与Kabatdatabase资料库中的DNA序列比较，检索了47670个DNA序列，从中选出4189个重链可变区DNA作逐个碱基比较，结果证明VH-8E5属Gamma重链，包括可变区，D区，J区和恒定区起始段共375bp，与资料库中的许多VHDNA序列高度同源，但没有一个完全相同。本发明的轻链可变区基因的分离是使用相同的杂交瘤细胞系8E5并采用相同的RT-PCR方法，该基因被命名为VK-8E5，不同的是为扩增轻链可变区基因所设计的引物对为VK-5’引物5’GAAGCACGCGTAGATATCG(T)TGA(C)TC(G)ACCCAG(A)TCTCCAVK-3’引物5’GAAGATGGATCCAGCGGCCGCAGCATCAGC本发明的VK-8E5经序列分析表明，其具有SEQIDNO.2所述的核苷酸序列，全长为366bp，其中在SEQIDNO.2的序列的第70-120位核苷酸、第166-186位核苷酸和第283-309位核苷酸为三个互补决定区。将此基因序列与Kabatdatabase资料库中的DNA序列比较，发现与资料库中的许多VKDNA序列高度同源，但没有一个完全相同。实施例2VH和VKcDNA的重组根据实施例1的DNA序列分析结果，选出框架结构正确的VH和VKcDNA克隆提取质粒DNA，用pVUII和HindIII切下VH片段，用EcoRV和BamH1切下VK片段，琼脂糖电泳纯化后分两步插入经同样内切酶消化和脱磷酸的表达载体pOPE51-215，构建成重组表达载体pOPE51-8E5，用于表达抗人纤维蛋白单链小抗体scFv。重组表达载体pOPE51-8E5的结构示意图如图3所示。实施例3单链抗体scFv-8E5的表达和纯化用实施例2得到的pOPE51-gE5质粒DNA转化大肠杆菌JM109，转化子在LB培养液中扩增，分别用浓度为20μM和100μM的IPTG诱导表达3小时后收集菌体。20μMIPTG诱导组的菌体在破壁缓冲液(50μMTris-HCl，1mMEDTA和20％蔗糖，pH8.0)中冰浴1小时，30000g离心40分钟，收集上清液中的可溶性蛋白，经透析后用IMAC柱纯化(Dubel等人，CellBiophy.1992，2169-79)。IMAC柱上的镍离子能与表达产物末端的组氨酸结合，通过亲和层析一步纯化。100μMIPTG诱导组的菌体需超声破碎，30000g离心30分钟，收集沉淀，用6M盐酸胍溶解包涵体，30000g离心1小时，收集表达产物即单链抗体scFv-8E5用于分析。将收集的纯化产物样品与对照样品(未诱导的转化子的总蛋白、壁膜间蛋白以及包涵体蛋白)经透析和浓缩后用12％聚丙烯酰胺还原胶作电泳，考马斯亮兰染色后用激光扫描仪分析电泳区带的蛋白含量。同样的SDS-PAGE胶经电转移把蛋白带转移到醋酸纤维薄膜上，用于Western杂交。基于表达产物末端的c-myc短肽，用抗c-myc单克隆抗体9E10为一抗，辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠血清为二抗，与底物二氨基联苯反应后显色。SDS-PAGE电泳和Western印迹分析的结果如图4所示，由图4可以看出，转化子经用20μMIPTG诱导表达，细菌壁膜间的可溶性蛋白在SDS-PAGE胶上显示出约30KDa表达带，其蛋白含量占壁膜间蛋白的7.3％，纯化后成为SDS-PAGE胶上的主带。Western印迹结果证明这个30KDa条带为表达产物，即所表达的单链抗体scFv-8E5的分子量约为30KDa。100μMIPTG诱导表达后产量明显增高，激光扫描结果证明30KDa带占细菌总蛋白的28.9％，但多数形成不溶解的包涵体。经过离心回收的包涵体中含有表达产物54％。实施例4单链抗体的的抗原识别特异性分析用改进的酶联免疫反应(ELISA)观察实施例3制备的纯化scFv-gE5的抗原识别特异性。为了制备抗原，用纤维蛋白原包被96孔板(美国Nune公司)，37℃烤干后用15％小牛血清DMEM培养液(Gibco)活化，形成均匀的纤维蛋白薄层，经0.2％明胶封闭和洗净后加入不同稀释度的scFv待测样品。用抗c-myc单克隆抗体9E10为一级抗体，辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠血清为二级抗体，二氨基联苯胺为底物，进行ELISA测试。用酶标仪(Bio-Rad)检测492nm的颜色反应强度。能与抗原结合的scFv将被固定在孔中，通过ELISA进行显色反应。ELISA检测以8E5全抗体为阳性对照，4次检测结果的平均OD数为1.435。阴性对照组用无关抗体，4次检测的平均OD数为0.011。2批表达产物不同浓度的重复检测结果证明所分离的VH和VK基因重组后的表达产物scFv-8E5有特异性抗原结合能力，结果见下表1。表1重组单链抗体scFv的抗原结合特异性</tables>序列表SEQIDNO.1序列长度375bp链型单链分子型cDNA特征第85-99位核苷酸、第142-192位核苷酸和第289-321位核苷酸为三个互补决定区来源人CAGCTGCAGCAG12QLQQ____VH-5′引物________TCTGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGC60SGAELVKPGASVKMSCCDR1AAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTATTGGATGCACTGGGTGAAG108KASGYTFTNYWMHWVKCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAACGATTGATCCTGCA156QRPGQGLEWIGTIDPACDR2GATAGTTATACTAGTTACAATCAAAACTTCAAGGACAAGGCCACATTG204DSYTSYNQNFKDKATLACTGTAGACAAACCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTG252TVDKPSSTAYMQLSSLACATTTGGGGACTCTGCGGTCTATTTTTGTGCAAGAGAGGGGGTCTAC300TFGDSAVYFCAREGVYCDR3TATAGATACTACTTTGACTACTGGGGCCACGGCACCACTCTCACAGTC348YRYYFDYWGHGTTLTV_________VH-3′引物________TCCTCAGCCAAAACGACACCCAAGCTT375SSAKTTPKLSEQIDNO.2序列长度366bp链型单链分子型cDNA特征第70-120位核苷酸、第166-186位核苷酸和第283-309位核苷酸为三个互补决定区来源人_______VK-5′引物_______________GATATCGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGGCTATG39DIVLTQSPSSLAMCDR1TCAGTAGGACAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTT87SVGQKVTMSCKSSQSLTTAAATAGTAGCAATCAAAAGAACTATTTGGCCTGGTACCAGCAGAAA135LNSSNQKNYLAWYQQKCDR2CCAGGACAGTCTCCTAAACTTCTGGTATACTTTGCATCCACTAGGGAA183PGQSPKLLVYFASTRETCTGGGGTCCCTGATCGCTTCATAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC231SGVPDRFIGSGSGTDFACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGATTACTTC279TLTISSVQAEDLADYFCDR3TGTCAGCAACATTATAGCACTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACAAAG327CQQHYSTPLTFGAGTK________VK-3′引物_____________CTGGAGCTGAAACGGGCTGATGCTGCGGCCGCTGGATCC366LELKRADAAAAGS权利要求1.一种抗人纤维蛋白单克隆抗体重链可变区基因，其与轻链可变区基因重组后可表达特异性识别和结合人纤维蛋白的抗体，所述的基因具有SEQIDNO.1的序列，其特征在于在SEQIDNO.1的DNA序列的第85-99位核苷酸、第142-192位核苷酸和第289-321位核苷酸为三个特异性结合人纤维蛋白所需的互补决定区。2.一种由权利要求1所述的抗人纤维蛋白单克隆抗体重链可变区基因编码的多肽产物。3.一种抗人纤维蛋白单克隆抗体轻链可变区基因，其与重链可变区基因重组后可表达特异性识别和结合人纤维蛋白的抗体，所述的基因具有SEQIDNO.2的序列，其特征在于在SEQIDNO.2的DNA序列的第70-120位核苷酸、第166-186位核苷酸和第283-309位核苷酸为三个特异性结合人纤维蛋白所需的互补决定区。4.一种由权利要求3所述的抗人纤维蛋白单克隆抗体轻链可变区基因编码的多肽产物。5.一种表达载体，其含有权利要求1所述的抗人纤维蛋白单克隆抗体重链可变区基因以及权利要求3所述的抗人纤维蛋白单克隆抗体轻链可变区基因。6.如权利要求5所述的表达载体，其为pOPE51-8E5。7.如权利要求5或6所述的表达载体的表达产物。8.如权利要求1所述的抗人纤维蛋白单克隆抗体重链可变区基因和权利要求3所述的抗人纤维蛋白单克隆抗体轻链可变区基因在制备血栓定位诊断试剂和溶血栓药物中的应用。全文摘要本发明公开了抗人纤维蛋白单克隆抗体重链可变区基因和轻链可变区基因,由所述基因编码的多肽,含有所述基因的载体及所述的基因在制备血栓定位诊断试剂和溶血栓药物中的应用。文档编号A61P7/02GK1195701SQ9710375公开日1998年10月14日申请日期1997年4月8日优先权日1997年4月8日发明者宋增璇申请人:中国医学科学院血液学研究所