专利名称：血红蛋白病的冶疗的制作方法
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背景技术：
本发明领域属于血红蛋白病。
许多血红蛋白病与血红蛋白(Hb)的氧亲和力降低有关。这类血红蛋白病的实例包括镰状细胞病(SCD)和镰状细胞性状；地中海贫血；Hb-C,Hb-D,Hb-E,Hb-H,Hb-I,Hb-O-Arab，和Hb-Kansas失调症；以及任何这些疾病的混合杂合子的组合。研究得最为广泛的可能是镰状细胞病(SCD)，这种疾病是由于血红蛋白(Hb-S)β-多肽链氮末端的第六位氨基酸突变的结果。该突变将负电荷的氨基酸谷氨酸(由GAG编码)替换为中性的疏水残基，缬氨酸(由GUG编码)。在生理学相关浓度(例如，约0.2克/立方厘米)和在某些条件下如缺氧症，Hb-S聚集成多链聚合物，形成粘性的或固样的凝胶。红细胞中Hb-S(血红蛋白)的聚合将血红蛋白扭曲成各种变异形状，其中一些类似镰刀。Hb-S还使血红蛋白变得更僵硬，降低了细胞穿过微血管的狭窄官腔的能力。
携带一个编码正常成年人血红蛋白(Hb-A)基因和一个编码所述Hb-S基因的个体有镰状细胞性状。这种杂合子很少有临床症状，但是肯定可以传递这种突变的基因给他们的后代。Hb-S纯合个体或Hb-S与Hb-C的组合个体被认为有镰状细胞病(SCD)；这些个体由此被归类为“SS”。而RBCs含正常血红蛋白的成年人则被归于“AA”。
临床上，SCD与慢性溶血有关，它可导致贫血和黄疸。SCD还与急性间歇性血管闭塞危象，即所谓的镰状危象有关。在此类危象期间，微血管可能暂时性或永久性闭塞，几乎身体的每个器官可由于供氧减少而被损坏。这种器官的损坏是与SCD相关的死亡率和发病率的主要原因。骨骼，脾脏，肾脏和肺的微血管梗塞(即由供血不足而引起的组织坏死)是十分常见的，并且导致可持续数天的剧烈疼痛。
治疗血红蛋白病如SCD的常规方法包括给贫血病人输血以产生10克/分升的血红蛋白水平和/或达到30％的总红细胞积压浓度。其他方法涉及使用羟基脲法，以通过增加红细胞中的胎儿血红蛋白(Hb-F)来减少镰化红细胞(Charache等，1995年，新英格兰医学杂志332卷1317-1322页；Goldberg等，1990年，新英格兰医学杂志323卷366-372页)。用这种方法，需要治疗数周以增加Hb-F的水平；因此这种方法对于缓解镰状危象不是特别有用。其他治疗方法包括支持性治疗，如氧疗法，止痛药和水合疗法。给病人提供这类支持性治疗直到解除危象，通常需要数天。
对任何给定的血红蛋白病，通过描绘出病人总血红蛋白的氧合血红蛋白解离曲线(ODC)特征，可测定病人血红蛋白的氧亲和力。通过以Y轴为总血红蛋白的氧饱和(SaO2)百分数对X轴的宽范围氧压(例如，0到100毫米汞柱)内以毫米汞柱为单位的氧分压(PaO2)作图可描绘出上述数学曲线(参见Bunn和Forget,Hemoglobin:MolecularGenetics and Clinical Aspects,1986,W.B.Saunder,Publisher)。在总血红蛋白半数最大氧饱和浓度处的PaO2被称为P50值。为氧结合能力降低的血红蛋白以ODC相对于正常成年人血红蛋白(Hb-A)所得到的ODC向右偏移为特征；这可表示为相对于Hb-A的P50的增加。在37℃,PaCO240毫米汞柱，pH7.40和等渗条件下，正常血红蛋白的P50约为26毫米汞柱，而Hb-S的P50约为37毫米汞柱。通过市售设备可容易测量给定病人的血红蛋白的P50值，如HEMOX-ANALYZERTM自动血氧解离分析仪(TCS Medical Products Company,Huntingdon Valley,PA)测定。
发明概述目前，业已发现氧化氮(NO)和/或一氧化碳，或释放氧化氮的化合物可以无毒性水平被用于治疗被鉴定患有任何具体类别的血红蛋白病病人。与正常成年人血红蛋白(Hb-A)表现的氧亲和力相比，这些血红蛋白病(不仅包括SCD和镰状细胞性状，而且包括Hb-C,Hb-D,Hb-E,Hb-I，和Hb-Kansas病)以及这些疾病的组合情况或其他带有Hb-S的β球蛋白突变子是以病人血红蛋白对氧的亲和力减少为特征。本方法涉及提供供病人吸入的治疗气体，其中治疗气体包括治疗有效剂量的气态氧化氮。在本方法的一个衍生方法中，用包括治疗有效剂量的一氧化碳，或氧化氮和一氧化碳的结合物的治疗气体治疗病人。本发明的治疗方法增加了病人血红蛋白的氧亲和力，使其功能上更类似于Hb-A。若需要的话，可在治疗前和治疗后通过测量病人血红蛋白(无细胞血红蛋白或完整的红细胞)的P50或ODC定量。如果病人的血红蛋白病是SCD，本发明的方法还对降低病人Hb-S聚合的倾向性因而降低病人红细胞发生镰化的倾向性有进一步的明显益处。即使不与任何具体的学说相联系，值得注意的是，氧化氮治疗可产生疗效的一种可能的机制或许是通过影响RBC的膜或膜通道起作用。
治疗气体优选在无吸烟条件下被提供，并且该治疗气体包括在惰性气体中如氮气(N2)或氦气(He)，在空气中，在额外补充氧气(O2)的空气中，或在另一种含氧气体(例如，含20％到约90％的氧气的O2/N2混合物)中，至少含百万分之一浓度(ppm)的氧化氮。治疗气体中的氧化氮或一氧化碳浓度一般将被认为是至少10ppm，并优选至少20或40ppm。根据一定疗程中吸入气体时间的长度，有用的氧化氨或一氧化碳的浓度范围将是从1到10,000ppm(例如，20到4000ppm或40到2000ppm)。预计，一个病人可通过长期连续或间断的吸入20,40,80,100,160，或200ppm氧化氮或一氧化碳而得到益处。在使用CO的时候，应控制剂量以便使病人的羧基Hb不超过总Hb的20％。或者，在病人转向吸入空气或氧气之前，专门吸入仅一小段时间的治疗气体时可为其提供较高浓度的NO或CO，如300,400,500,1000,1500,或甚至2000ppm。在治疗气体包括CO时，有用的基准浓度是使病人血液中羧基血红蛋白减少2到10％的CO浓度，如常规方法检测的那样。供吸入使用的治疗气体还将优先包括氧气(例如，约20％的氧(如在空气中)和直到几乎100％的氧)。
为使可能达到危害水平的二氧化氮和其他氧化氮的较高氧化物的形成减到最小，特别在使用相对高浓度的氧化氮时，应使治疗气体中的氧化氮与氧气的接触时间减到最小氧化氮应在无氧条件下存放，并在给病人吸入前不久与含氧气体混合。一般说，这意味着在给病人吸入治疗气体前，混合时间不超过10分钟(优选不超过5分钟，并甚至更优选不超过2分钟)。建议在临吸入前混合含氧化氮气体和含氧气气体，如在下述连续流动装置中进行。该方法包括监测治疗气体中NO和/或NO2的浓度。一般情况下，治疗气体将包括不高于5ppm的二氧化氮，优选不超过1ppm的二氧化氮，在这样的浓度下给病人吸入。若需要的话，通过在病人吸入治疗气体前将该气体与二氧化氮清除剂接触，可除去至少一部分在该气体中形成的任何二氧化氮。
一般的治疗方法包括至少持续10天每天为病人提供至少5分钟的治疗气体，其中氧化氮浓度在40到240ppm之间。每天可重复治疗数次。另一种治疗方案包括给病人提供相对低剂量的空气中的氧化氮(例如，2到160ppm)或氧气/氮气(例如，50％氧气)，持续8小时或更长的时间(例如，24小时或甚至一周)。而另一方案包括需要防止病人红细胞镰化或需要提高病人血红蛋白载氧能力时，给病人提供高剂量(例如，1000ppm)的氧化氮，持续一小段时间。这个方案可用一种便携式多剂量吸入装置来完成，该装置配有一罐在惰性气体如氮气中被压缩的氧化氮，有或无重呼吸管(rebreathing tube)。由于疗效似乎持续较长时间，预期这种高剂量疗法将不需要每小时重复一次以上，并且可能每天进行不多于一，两次。一般说，给病人提供至少10秒钟(例如一或两次深呼吸便足够)，和直到1或5分钟的治疗气体。由于成年人的血液体积约为5升并且心输出量约为5升/分钟，用含氧化氮的气体给肺充气一份钟，理论上将产生对整个循环着的血体积(假设是充分混合的)的治疗作用。5分钟的治疗将可能是更现实的目标。对任何具体病人的最适治疗方案可很容易由病人的医生来完成。
在上述方法的一个衍生方法中，病人可通过施用治疗有效剂量的释放氧化氮(或氧化氮供体)化合物得到治疗。适合的释放氧化氮化合物的实例包括S-亚硝基硫醇(S-nitrosothiol)如S-亚硝基-N-乙酰青霉胺，S-硝基胱氨酸，和其他在WO 92/17445和U.S.专利号5,427,797(在此引入作为参考)中描述的化合物；硝普盐；亚硝基胍；三硝酸甘油；叠氮化物；羟胺；和其他NONOate化合物，包括那些在美国专利号4,954,526和5,155,137中公开的化合物。NONOate化合物的实例包括二乙基胺/NONO，二亚乙基三胺/NONO，和甲氨基己基甲胺/NONO(在Hanson等，Nitric Oxide,Biochemistry,MoleGularBiology,and Therapeutic Implications,Ignarro and Murad,Ed.,Academic Press,New York(1995)中有介绍)。NO-释放化合物可以粉末形式或作为液体(例如，将化合物与生物学上相密的赋形剂混合)提供。
释放氧化氮化合物可以单独给病人施用或与NO气体，CO气体，或另一释放NO化合物一起施用。当给病人施用一种以上的化合物时，这些化合物可以混合在一起，或顺次给病人施用。下列任何一种或一种组合施用方式可用于给病人施用释放NO化合物静脉注射，动脉注射，透皮输送，口服，和吸入(例如，以气体，粉末或液体的形式)。吸入是优选施用方式。
在上述方法的另一种衍生方法中，病人可通过将病人的一部分红细胞在体外或原位与治疗有效剂量的气体NO和/或CO接触来接受治疗。例如，体外膜型充氧器(ECMO)设备，心肺旁路(CPB)设备，或静脉内充氧器(IVOX)设备。可适合用于将病人红细胞与气体NO和/或CO(例如，在含氧气体中1到1,000ppm)接触。
在被鉴定为患有SCD或产生镰化的Hb-S组合之一的病人情况中，本发明可被用于治疗被鉴定为(ⅰ)有镰状细胞危象，或(ⅱ)处于有镰状细胞危象的风险中的病人。例如，病人可患有SCD并将要进行全身性麻醉手术。在这种情况下，手术期间，和/或手术前和/或后的一小时内，病人按本发明方法接受治疗，持续被认为是防止通常这类手术所产生的镰状细胞危象所必须的时间。除血红蛋白病之外，可用本发明治疗的病人包括那些有或无常见的肺病(例如，哮喘或肺高血压)病人。
病人血红蛋白氧亲和力的降低可被测定为相对于Hb-A的ODC，病人血红蛋白的ODC向右偏移。或者，血红蛋白的氧亲和力可被测定为相对于Hb-A的P50，病人血红蛋白有一个增加的P50值。若需要的话，可在治疗病人前和后测定ODC和/或P50以提供治疗气体，释放NO化合物，或处理体外红细胞的治疗效果的指证。相对于治疗前的ODC或P50，治疗后的病人ODC向左偏移，或P50的降低是所述方法的治疗效果的指证。当NO是治疗气体时，治疗效果的另一个指证是Hb的亚硝化(nitrosation)作用的程度，它可用例如Kon等人，1977,J.Toxicol.And Environmental Health 2:1109-1113的方法(此处引用为参考)测定。例如，在0.01％到25％的亚硝化作用水平可被认为与治疗效果相关。作为另外的，或附加的方法，治疗效果可根据疼痛的减少来测量，这可以通过模拟等级记分(即，0-10)来评估。若需要的话，异常形状的(例如，镰化的和变形的)细胞在病人(有或无缺氧或可被预期产生镰化作用的其他紧张状态)血液中的百分数可在治疗前或治疗后被确定；治疗后异常形状的细胞百分数降低给本方法的治疗效果提供指征。
如本文所使用的“血红蛋白病”是一种由血液中的异常血红蛋白的出现所引起的，或与其相关。这包括一些血红蛋白病，在这些血红蛋白病中异常血红蛋白的组合出现在血液中(例如，镰状细胞/Hb-C病)。用本发明的方法能治疗的血红蛋白病与病人的红细胞氧的亲和力减少有关，或与缺氧或其他紧张状态下病人红细胞的镰化倾向有关。
Hb-S纯合的病人被认为患“镰状细胞病”，这种病人体内的Hb-S是一种镰状血红蛋白，其中以缬氨酸代替Hb-Aβ链上第6位的谷氨酸。“镰状细胞性状”是对应的杂合体，其中病人的Hb-A基因中只有一个被变异Hb-S基因替换。有镰状细胞性状的病人一般有20％到45％的Hb-S而其余的是Hb-A。在纯合状态中，75％-100％的血红蛋白是Hb-S，而其余的血红蛋白是胎儿血红蛋白(Hb-F)或Hb-A2，两者表达的基因座位与Hb-A或Hb-S不同。当遇到某些引发条件时如低氧或脱水状态，SCD使全部或部分病人外周血中的红细胞变成异常形状(例如，镰状或新月形)。偶尔，SCD病人将经历以血管闭塞为特征的镰状细胞“危象”，它可影响人体的各个器官。骨，脾，肾肺的梗死(即，由于突然的供血不足引起的组织坏死)是常见的并且导致剧烈疼痛和组织死亡。
血红蛋白病“Hb-C”是以Hb-Aβ链上第6位的谷氨酸被赖氨酸替换为特征的情况。血红蛋白病“Hb-D”是谷氨酰胺代替Hb-A的β链上第121位谷氨酸的结果。“Hb-E”是以赖氨酸代替Hb-A的β链上第121位谷氨酸为特征。“Hb-H”是以同型四聚体为特征。“Hb-I”是谷氨酸代替α链上第16位的赖氨酸的结果。“Hb-Kansas”是以苏氨酸代替Hb-A的β链上102位的天冬酰胺为特征。这些血红蛋白病可影响含变异血红蛋白的红细胞的弹性和形状以及它们对氧的亲和力。地中海贫血致使从受累基因座位表达的β球蛋白的量低于正常，或致使变异型β球蛋白表达，这种球蛋白合成效率低或迅速降解使得没有多少可用于形成有功能的Hb。有Hb-A合并β地中海贫血的病人可有少量或无正常Hb-A出现以抵消单个Hb-S基因的作用，因此可能会有SCD的功能等效物。
NO气，CO气，或释放NO化合物的“治疗有效”量是足以产生下述之任何一种或一种以上情况的量或浓度(ⅰ)病人血红蛋白的P50至少减少2mmHg；(ⅱ)在病人ODC中统计学上明显向左偏移；(ⅲ)在SCD的情况，缺氧情况下(定义为PaO2低于50mmHg)变形的细胞数量减少10％或以上；或(ⅳ)在表现镰状细胞危象的病人的情况中，在期望危象自然缓解前病人感觉的疼痛有临床上明显减少。
本发明提供治疗被鉴定为患血红蛋白病病人的简单，快速而有效的方法。携带正常血红蛋白的红细胞至少在100ppmNO和35ppmCO以下的水平不受治疗方法的明显影响，因此本方法即使在杂合子中使用也是安全的。该治疗的疗效(例如，P50的降低)甚至持续到不再接触NO或CO源之后。与治疗镰状细胞危象的常规方法(这种方法仅提供支持性治疗)相比，通过减少Hb-S的聚合并因此减少新镰状细胞的形成，本发明可被用于预防和逆转镰状细胞危象。因为这种镰化可与由镰状细胞危象产生的疼痛，发病率以及死亡率相关，本发明以非侵入性方式减轻与SCD有关的身体并发症。
图解概述
图1是可用于临床配置中为病人提供含NO治疗气体的呼吸系统(breathing circuit)的概况描述。
图2是完整的，新鲜的人Hb-A和Hb-S在体外(in vitro)接触无NO空气后，或接触空气中的80ppmNO之后，其P50的图形描述。
图3是在空气中和在体内空气所含80ppmNO中，人Hb-S红细胞的ODC和P50的图形描述。治疗不引起Hb-S红细胞ODC向左偏移和P50的降低。
图4是人Hb-S红细胞在体外接触空气中的80ppmNO各时间长度后，其P50的图形描述(给出两个病人的数据)。5分钟的NO治疗明显降低Hb-S的P50，而进一步NO治疗即使有额外的作用的话也很少。
图5是在空气或80ppmNO中作为血红蛋白氧饱和百分数函数的镰化人Hb-S红细胞百分数的图形描述。体外NO治疗(80ppm)降低镰化红细胞占全部氧合血红蛋白浓度的百分数。
图6是在空气或空气中80ppmNO存在时，作为血红蛋白氧饱和百分数函数的正常细胞(相对于变形细胞或镰化细胞)百分数的图形描述。更多的NO处理的细胞比仅接触气体的细胞有正常的外观。
图7是取自两位SCD病人的红细胞在接受空气中NO浓度逐步升级的体外处理时，P50进行性降低的条形图。1=0ppmNO；2=10ppmNO；3=40ppm NO；4=80ppm NO.
图8是显示吸入的NO增加SS病人(即SCD病人)中的RBC氧亲和力的图解。在有九位稳定SS病人(□)的十个病历研究中，病人吸入80ppmNO 45分钟后RBC的P50的平均降低约为5mmHg(范围在3-7mmHg；p＜0.001)。在一位SS病人中，RBC P50无变化。吸入NO后正常成年人(●)RBC P50未显示变化(≤1mm Hg)，表明NO的作用对患血红蛋白病病人是有选择性的。
在停止NO吸入后开始吸入空气1小时时，从三位AA和五位SS病人取血样。在5位SS病人中的3位的RBC P50保持下降。在全部病人中，吸入氧化氮45分钟后，红细胞内2,3-DPG和ATP水平，pH和血气压力无变化。在所有的受试者中没有见到临床副作用。SS RBCs的平均高铁血红蛋白水平在吸入NO45分钟后较低(1.4±O.5％)而在60分钟后高铁血红蛋白水平回到基线，即使评价的在五位SS病人中的三位中，NO治疗对氧亲和力的作用一直存在。
详述本发明的方法可用于治疗鉴定为患任何种类的血红蛋白病病人，所述血红蛋白病在与正常成年人血红蛋白的氧亲和力比较时以病人的血红蛋白氧亲和力降低为特征。这种降低的氧亲和力一般测定为受累血红蛋白的ODC与Hb-A的ODC比较向右偏移，或与Hb-A的P50比较受累血红蛋白的P50增加。这种减少的氧亲和力是诸如Hb-S(见于纯合子形式如SCD，和杂合子形式如镰状细胞征),Hb-C,Hb-D,Hb-E,Hb-H,Hb-I，或Hb-Kansas病的异常血红蛋白之特征。病人可以是变异基因的纯合子或杂合子。偶然情况，病人会是一种“混合杂合子”，其携带两个不同的变异β球蛋白基因。实例包括下面组合S/C,S/D,S/O-Arab,S/Quebec-Chori,S/β地中海贫血，S/E,S/Lepore，和Kinney与Ware,Compound在镰状细胞病基本原理与临床实践(Stephen H.Embury等人编辑，Ravan出版公司，纽约(1994))一书中29章复合杂合子状态中描述的其他组合(本文引做参考)。包括临床观察，遗传分析，蛋白质分析，ODC分析，和P50分析在内的常规方法和标准可被用于鉴定患此类血红蛋白病，包括尚处于发现中类型的血红蛋白病的病人。下面描述的是简单的体外测验，可用于确定是否一给定的血红蛋白病有可能用本发明的方法治疗会好转。或者，直接在病人中测验本方法。用吸入气态NO或CO治疗血红蛋白病在本发明的一个方面，提供气态NO或CO，或NO和CO的组合给病人吸入。NO的使用描述如下；类似的原理应用于CO或CO和NO的组合的使用方面。压缩的NO气或CO气可从商家买到，如Airco(MurrayHill,NJ)或Air Products and Chemicals,Inc.(Allentown,PA)。一般说，NO是以200-2000ppm NO在氯气或其他惰性气体如氦中混合物的形式被提供。最好将NO作为一种无氧气混合物储存，因为氧气能与NO反应形成有毒的氮的高级氧化物如二氧化氮。若需要的话，含NO气体可在临提供这种混合物吸入前与空气或氧气混合。事先用肺活量计校准的校准式转子流量计可被用于将精确数量的含NO气体与空气或氧气混合，特别是在医院配置中。一般说，包括至少21％氧气以及治疗水平的NO和/或CO的治疗气体适合于本发明使用。若需要的话，使用标准的红外检测技术可测量CO浓度。为限制氮的高级氧化物的形成，在病人吸入治疗气体前，NO应该与氧气接触不超过约10分钟(并且优选不超过5分钟)。如需要的话，在给病人施用该气体前，可使用标准的化学发光方法测量治疗气体中的NO和/或二氧化氮的量(参见，例如Fontijin等人，1970年分析化学第42期575-579页)。二氧化氮可在给病人提供治疗气体前被清除。适当的清除方法包括使该气体接触NaOH溶液，baralyme，或硷石灰。若需要的话，这些清除方法还可用于从病人呼出的气体中抽提出二氧化氮，以使二氧化氮不进入大气中。
供给病人治疗气体的优选方法是采用连续流动的方式，例如面罩呼吸系统，而不用在收容器中静态混合的方法，如Douglas袋。一个典型的呼吸系统在图1中概括给出。该系统包括一个在氮气中的气体NO压缩混合物源，一个与搅拌器连接的空气或氧气源以引进空气或氧气到该系统中，一个NO分析器以监测治疗气体中的NO浓度，和一个通向病人的非重呼吸(non-rebreathing)T形阀。若需要的话，呼出的气体可以通过医院的真空系统被清除。在呼吸系统内NO和二氧化氮的浓度可用市售的传感器(例如，Exidyne InstrumentationTechnonolgies的NO传感器(4586型)和二氧化氮传感器(4584型)；Exton,PA)进行电化学分析。若需要的话，可用在线的氧气分析仪监测氧气浓度。
作为使用面罩呼吸系统的一种替代方法，一种便携式吸入装置(带有或无重呼吸管)可被用于给病人提供NO。适合于本发明方法的适当吸入装置的实例在WO 92/10228中，和在美国专利号5,485,827；5,396,882；4,667,668；4,592,348；4,534,343；和4,852,561中被描述，其中的每一个在此作为参考引用。其他吸入装置在Physicians’Desk Reference,Edward R.Barnhar,Publisher中被描述。一般说，适合的吸入装置是便携式的，即不超过5公斤，并优选不超过1公斤，并可有一个类似于目前流行的治疗哮喘发作的那些吸入装置的设计。这种装置含(a)压缩的NO或CO气体，或含(b)释放NO化合物或者两者都有。这种装置一般将包括一种压缩气体，该气体含至少1ppm(优选至少5ppm，更优选至少40和最优选至少80ppm)NO或CO。在压缩气体中NO或CO的浓度可相对高些，例如160,300,500，或1000ppm。期望压缩使用浓度高达1500ppm或2000ppm或甚至更高。若需要的话，该装置可包含压缩NO气与一种惰性气体如氮气或一种液体推进剂如碳氟化合物例如弗利昂的混合物。
在给病人施用治疗气体前，若需要的话，可分析病人的血液，以便建立一个经NO治疗后的血液可与之比较的基线。一般说，抽10毫升的血样到肝素化的注射器中，并测量血红蛋白，红细胞积压，氧饱和度，和/或高铁血红蛋白饱和度。在吸入治疗气体前可测量ODC,P50，和/或病人血红蛋白的亚硝化作用水平；和/或可测量红细胞2,3-二磷酸甘油浓度。而且，可分析一份血样的红细胞镰化程度。在治疗气体吸入后，上述任何或全部参数可被再次测量，以提供吸入气体的治疗有效性的数据。若需要，在病人吸入治疗气体时，病人的血氧饱和度可通过脉冲血氧计监测。若需要的话，在病人继续吸入治疗气体时，可抽取所超过时间的额外血样。
一般说，病人将吸入治疗气体至少1分钟，并通常在使用低于500ppm的NO水平(例如80ppm)时为5分钟到30分钟。NO浓度越低，吸入的时间可越长；例如在相对低的40或80ppm水平，吸入可持续超过24小时。高水平的NO可在短时间内使用。若无毒性被检测到(例如，以明显(高于10％)高铁血红蛋白血症)，在一天的疗程中这种高水平的使用可根据需要延长或重复进行。预计有些血红蛋白病可得益于用NO或CO进行有规律的预防性治疗，例如在病人一生中每日三次以上，在危象风险高的时期额外进行治疗。
认为CO可以50-100ppm浓度在不定期内使用，而较高浓度(例如200-500)在中间时期使用(如1小时)。当结合使用CO和NO时，CO应以1-100ppm浓度使用，而NO以1-80ppm浓度使用，尽管为保证疗效时，可施用较高或较低的剂量。
如果对任何具体病人所适合的治疗方案取决于诸如所患血红蛋白病的类型和病人所描述的疾病严重程度等因素时，典型适宜治疗方案涉及每天至少一次5分钟吸入治疗气体(含2到160ppmNO或CO)至少共连续1O天。或者，根据需要，病人可每天吸入一次到数次较短时间的(例如短到一次呼吸)很高浓度的NO或CO(例如300-2000pm)。处于镰状细胞危象中的病人，认为一直需要急救基础上高水平的NO直到即时的危象消失。处于发生镰状细胞危象(例如，在预期的缺氧状态出现期间)的明显危险中的病人，只要危险依然存在就应被保持在足以防止或至少减低危象的严重性的NO或CO水平。由于不得不经受手术的(例如移除损坏的脾脏)镰状细胞病的病人处在手术期间或刚结束手术时具有高的发生危象的风险，建议在手术期间或手术后给这种病人提供治疗气体，并最好在临手术前也给病人提供治疗气体(使病人血红蛋白负载NO)。使用释放NO化合物治疗血红蛋白病作为施用NO或CO的替代方法或附加方法，释放NO化合物可被用于将有效治疗剂量的NO传递给病人的血红蛋白。适当的释放NO化合物包括S-亚硝基硫醇，例如S-亚硝基-N-乙酰青霉素胺(SNAP)，和S-硝基半胱氨酸，S-亚硝基胍，三硝酸甘油；叠氮化物；羟胺；和NONOate化合物。筛选附加释放NO化合物的标准包括它们在吸入前储存的稳定性，和它们在注射，口服，或在呼吸道适当部位着位时以有助于治疗的速率分解以释放NO的能力。例如，SNAP已显示出在其固体形式时是稳定的，但在生理条件下(如在支气管和肺泡腔表面的生理液体的膜中)，该化合物容易分解释放出NO(Ignarro,Circ.Res.65；1-21,1989).
通过各种途径包括静脉注射，动脉注射，皮下递送，口服，或吸入可给病人施用释放NO化合物。为了吸入，释放NO化合物可被包装进吸入装置，如上述装置之一，或可通过上述呼吸系统传递。为便利传递，释放NO化合物可被溶解在生物相容性赋形剂中(例如，水或生理盐水)。或者，释放NO化合物可以粉末的形式被提供。当释放NO化合物以固体或液体形式被吸入时，粒子或液滴着位于整个呼吸系统中，大的粒子或液滴易于沉淀在近入口部位(即，口或鼻)而较小的粒子或液滴被进一步携带进入呼吸系统，然后沉淀在气管，支气管，并最终在肺泡中。(参见例如Hounman ＆ Morgan，呼吸系统防御机制，第一部，第5章“粒子沉淀”第125页，Marcel Dekker，公司，Brain等编辑，1977年)。建议10微米或更小的粒子/液滴适合用于本发明。
任何具体病人的释放NO化合物的适用剂量可容易确定，并且将取决于诸如化合物的性质，血红蛋白病的类型，以及疾病情况的严重性。在使用为吸入所提供的释放NO化合物时，该化合物可以是固体或液体形式。为成年人用的一种典型剂量将是大约1-5毫克，而不管传递的途径如何。体外或原位使用NO治疗血红蛋白病为在体外或原位传递NO或CO到病人血液中，可使标准的ECMO,IVOX，或CPB装置不仅适合于使用含氧气体，而且适合于使用治疗有效浓度的NO和/或CO。一般说，从病人那里连续抽出病人血液并泵入体外气体交换器，然后再回输给该病人。当血液流经将其与治疗气体隔开的渗透膜时，已经吸附到该渗透膜的NO或CO分子进入血液，然后与红细胞中的血红蛋白相互作用。原位气体交换器如IVOX被直接置入病人的血管腔中，而不需要将血液泵出身体。非专门设计用于传递到血液，但适合传递NO到有同样需要之病人血液中的其他类型的装置在共同拥有专利申请USSN 08/036,522中被描述，此处引用作为参考。体内测验下面讨论的实验证明将Hb-S红细胞与无毒水平的NO接触，引起ODC向左偏移并引起血红蛋白的P50的降低，从而表明NO治疗改变了异常血红蛋白结合和释放氧的能力，结果使其更像Hb-A。在NO治疗期间，使异常血红蛋白脱饱和的PO2(即，放出其氧分子)减少。因此，在NO治疗期间，给定的氧分压下，不饱和与饱和Hb-S之比率被降低。由于若Hb-S携带氧就不太可能聚合，在NO治疗期间，Hb-S将聚合的可能性在一定的氧气分压下被减小，并伴随镰化红细胞的同时减少。此外，下面讨论的数据暗示NO治疗可直接影响血红素-血红素的相互作用或引起Hb-S的构像变化(可能形成NO加合物)，降低Hb-S聚合的倾向而不依赖于其对Hb-S的ODC的作用。因此，用NO治疗被认为在防止Hb-S聚合和红细胞镰化中具有额外的有益作用而不依赖于其对氧亲和力的作用，结果甚至当NO治疗的Hb-S释放其氧气时，红细胞仍不易镰化。实验Ⅰ氧化氮引起异常血红蛋白P50的降低本实验证明当细胞含Hb-S时，将血红蛋白与非毒性水平的NO接触会降低P50(即引起在ODC中向左偏移)，但是当细胞仅含正常的Hb-A时则不降低P50。从SCD病人或正常对照组新抽取人红细胞，在Colin’s液中被清洗并接触空气中80ppm气体NO 15分钟，用血/气压力计测量。在使红细胞接触NO前和接触后，用自动血氧分离分析仪测定血红蛋白的ODC。如图2所示，在上述条件下，正常红细胞(Hb-A)与80ppmNO接触不使26mm Hg的Hb-A P50值发生明显变化。相反，Hb-S与空气中80ppmNO接触，与单纯空气中Hb-S P50相比，引起Hb-S P50值的明显降低。如图2和图3所示ODC中的说明，含Hb-S(以及可能的其他血红蛋白，例如，Hb-C)的病人红细胞，即镰状细胞的P50值在空气中是32.5mmHg，而与NO接触后该P50降低到26mm Hg。这些数据还表明正如所预料的，含Hb-S(30.5mm Hg)的红细胞未与NO接触时的P50相对于未与NO接触的含Hb-A(27mm Hg)红细胞的P50，其值被提高。如表1所示，NO的接触诱导了Hb-S红细胞的P50的降低，这种现象在停止NO处理后持续至少1小时。其他实验显示这种降低持续至少两小时。
表1顺序接触Hb-S RBC P50空气(基线) 35mm Hg含80ppmNO的空气×15分钟30mm Hg在停止NO后，空气×15分钟 30mm Hg在停止NO后，空气×30分钟 30mmHg在停止NO后，空气×60分钟 30mm Hg实验Ⅱ接触NO时间长度对Hb-S RBC的P50的影响本实验说明与血压计中的80ppmNO接触不到5分钟，足以引起含Hb-S细胞的P50的明显降低。来自两位患SCD的病人的红细胞样品与80ppm NO或空气接触达各种时间长度(1,5,30和60分钟)，并检测P50值。
虽然Hb-S红细胞与80ppmNO接触1分钟基本上不改变这些细胞的P50(图4),Hb-S红细胞与80ppmNO接触低达5分钟就导致两位病人的血样P50明显降低(如图4分开的直线)。这些红细胞与80ppmNO接触达30分钟或60分钟仍然保持着所观察到的降低，但不引起P50比5分钟接触所观察到的结果更多的明显进一步降低。含Hb-S的红细胞与无NO空气接触达60分钟不产生超过时间内的P50的明显变化(数据未给出)。实验Ⅲ氧合血红蛋白浓度对NO改变P50的能力的影响本实验说明氧合血红蛋白如何影响NO对降低Hb-S的P50的能力的影响。在这些实验中，两个含人Hb-S红细胞的烧瓶在37℃水浴。每个烧瓶中空气的氧浓度在一小时的间隔步骤中从20％降低到16％,12％,8％,4％，然后到0％的氧气。在整个实验中，一组烧瓶还含有80ppm NO，在整个实验中两组都含有5％的二氧化碳。在每一小时后(即随着每个氧浓度的降低)从每个烧瓶中移出红细胞样品。通过多波段血氧计(使用Ciba-Corning Co-Oximeter 270型装置并使用常规方法)测定氧合血红蛋白与高铁血红蛋白浓度。用光学显微镜评估细胞形态以确定正常，变形，与镰化红细胞在每个样品中的百分比。变形细胞被定义为不具正常细胞或镰化细胞的典型形状的细胞。
如图5说明的，NO治疗降低镰化细胞在全部氧合血红蛋白浓度的百分比。在同样血红蛋白氧饱和度时，接触NO的红细胞比对照红细胞发生的镰化少10％-15％。这表明80ppm NO可改变“血红素-血红素”相互作用或以不依赖于对氧亲和力影响的方式产生异常血红蛋白分子的构像变化，从而在给定的氧饱和度时，降低Hb-S聚合的倾向。而且，在每个测量的血红蛋白氧饱和度百分数，比对照细胞高的NO处理细胞的百分比被判断为“正常”(对应于变形或镰化细胞)。实验Ⅳ剂量效应本实验说明增加NO浓度会增加对含Hb-S的红细胞P50的影响。来自患SCD的两位病人的红细胞样品与空气接触(OppmNO；如图7条形图中的第一列所表示的)或与10ppmNO(第二列),40ppm NO(第三列)，或80ppm NO(第四列)接触5分钟。然后测定P50值。如图7所示，来自每位病人的红细胞的P50值随NO浓度增高而降低。人体内测验下面所讨论的实验证明吸入NO可增加被诊断患SCD的病人体内RBCs对氧的亲和力。由此，NO改变异常血红蛋白结合和释放氧的能力，使得其更类似于Hb-A。在这些研究中，病人是三位正常男性，年龄为25-50岁的成年人(本文称为“AA”)和九位(七男，两女)临床稳定的成年人(年龄为20-33岁)，他们是Hb-S纯合子(本文称为“SS”)。
简言之，在SCD受试者中，这些实验显示呼吸空气中的80ppmNO会降低氧分压，在此情况下血红蛋白50％被氧饱和。甚至在停止呼吸NO后60分钟时，P50仍在降低。这些实验详述如下。ODC确定静脉穿刺从AA或SS成年人取全血50微升并用4毫升磷酸缓冲液，10微升抗泡沫溶液和20微升20％白蛋白稀释。该血样通过与100％氮气(N2)接触被去饱和，在空气中再氧化，然后用Hemox分析仪(TCSMedical Company,Huntingdon Valley,PA)以使用常规方法测定0DC(Guarnone等，1995,Haematologica,80:426-430)。P50被确定为50％氧合血红蛋白饱合度的氧分压。为保证超时使用SS RBCs情况下，重复测量的精确性，在无NO气体接触的情况下，在0,15,30,和60分钟时测定来自三位SS病人的血样；没检测到P50的改变。SS和AA成年人吸入NO对三位正常和九位SCD成年人进行了研究。对一位SS病人研究两次，两次研究间隔一个月的时间。连续监测血压，心电图，呼吸和心跳速率，和脉冲血氧数据。受试者呼吸空气，然后通过非重呼吸系统呼吸空气中的80ppmNO共45分钟。在NO呼吸前和刚结束时取静脉血样。正常受试者和五位SCD病人在NO呼吸后一小时另抽取血样。如上述方法体外测ODCs。
此外，用标准方法确定RBCs中腺苷三磷酸(ATP)和2,3二磷酸甘油酸(DPG)浓度(poillon等，1985,J.Biol.Chem260:13987-13900)。用CO-血氧定量计(Ciba-Corning 270型，Mayfield,MA)和标准技术在RBCs接触NO前和接触后测量高铁血红蛋白。用pH/血气分析仪(Ciba-Corning 170型，Mayfield,MA)和标准技术测量静脉pH和血气。统计分析下述数据以均值±平均标准误表示，除非另有指定。成对和不成对的Student’s t-测验均被使用，P值小于0.05表明有统计学意义。全部测验均为双尾(two-tailed)。通过计算Pearson相关系数估计相关性。SS和AA成年人氧化氮吸入实验为显示低浓度NO改变体内Hb-S，在AA和SS病人为时45分钟的呼吸空气中80ppmNO之前和之后测量他们的RBCs中的P50。呼吸80ppmNO的SS病人RBC P50降低(P＜0.001)，平均降低为4.6±2mmHg(图8)。相反，呼吸NO的AA病人的RBC P50没有改变(≤1mm Hg；P=NS)，表明NO对血红蛋白病病人的RBCs的影响有选择性。接受两次研究的SS病人(两次研究间隔一个月)在两次研究中都有P50降低。总之，这些数据显示在患镰状细胞病病人RBCs中，呼吸NO增加血红蛋白对氧的亲和力。
为证明甚至在氧化氮治疗终止后，呼吸NO仍影响P50在终止氧化氮吸入后一小时，测量五位SS病人的ODC。五位中的三位病人的RBC P50仍在降低，表明在停止NO后，NO对SS RBCs的氧亲和力的影响依然存在(图8)。
对所有的呼吸45分钟空气中80ppm NO的病人来说，病人的RBCs中的ATP和2,3-DPG的浓度没有与NO相关的改变。此外，在NO呼吸期间，病人的血压，呼吸和心跳速率，透皮氧饱和水平(SpO2)，静脉血pH，以及心电图数据均无变化。携带SS RBCs的病人的基线高铁血红蛋白水平(0.5±0.2％)高于携带AA RBCs的病人(0.1±0.1％)的水平。与NO接触均导致SS RBCs(1.4±0.7)和AA RBCs(0.7±0.1％)中高铁血红蛋白水平的少量增加；与NO接触后60分钟时，这些高铁血红蛋白水平返回到接近基线水平(SS和AA病人分别为0.6±0.3％和0.2±0.1％)。高铁血红蛋白水平增加与P50值降低没有关系(r=0.02,n=10)。事实上，受测试的五位SS病人中的三位在接触NO后60分钟时P50仍在偏移，而高铁血红蛋白水平已经回到基线值。总而言之，这些数据显示NO可在治疗有效水平被施用，而不会导致明显的高铁血红蛋白水平，对病人的至关重要的统计数据亦不导致明显的不良结果。总结上述体外和体内实验证明当SS RBCs接触低浓度氧化氮时，血红蛋白的氧亲和力增加。在停止施用氧化氮后，这种增加的氧亲和力在体外持续至少两小时，而在体内至少持续一小时。获得NO治疗的这些治疗作用不会产生临床明显水平的高铁血红蛋白。因此，这些数据表明吸入氧化氮气体可成为一种治疗血红蛋白病的有效疗法，所述血红蛋白病是以(a)与正常成年人血红蛋白比较，病人血红蛋白的氧亲和力降低为特征，或者以(b)病人红细胞镰化的倾向为特征的。
其他实施方案包含在下述权利要求中。
权利要求
1．一种治疗被鉴定为患血红蛋白病病人的方法，该方法包括鉴定病人患血红蛋白病，该血红蛋白病以(a)与正常成年人血红蛋白(Hb-A)的氧亲和力比较，病人的血红蛋白对氧的亲和力降低为特征，或以(b)病人的红细胞镰化的倾向为特征；并且提供病人吸入的治疗气体，其中治疗气体包括治疗有效量的气体氧化氨(NO)。
2．权利要求1的方法，其中治疗气体包括浓度至少1ppm的NO。
3．权利要求2的方法，其中治疗气体包括浓度至少10ppm的NO。
4．权利要求3的方法，其中治疗气体包括浓度在40-2000ppm的NO。
5．权利要求1的方法，其中治疗气体被提供给病人至少10秒钟。
6．权利要求5的方法，其中治疗气体被提供给病人至少5分钟。
7．权利要求1的方法，其中所述血红蛋白病是镰状细胞病。
8．权利要求7的方法，其中在提供治疗气体步骤前，病人被诊断为患镰状细胞危象。
9．权利要求7的方法，其中在提供治疗气体步骤前，病人被鉴定为处于发生镰状细胞危象之风险中。
10．权利要求1的方法，其中血红蛋白病选自镰状细胞性状；Hb-C,Hb-D,Hb-E,Hb-H,Hb-I，和Hb-Kansas失调症；或选自Hb-S与第二种变异β球蛋白等位基因的组合。
11．权利要求1的方法，其中治疗气体在无吸烟的条件下被提供。
12．权利要求1的方法，其中提供用于吸入的治疗气体包括氧气，该氧气在病人吸入治疗气体前约10分钟以内与治疗气体中的NO接触。
13．权利要求12的方法，其中治疗气体包括至少21％的氧气。
14．权利要求1的方法，其中治疗气体进一步包括浓度为1到10,000ppm的气体一氧化碳(CO)。
15．权利要求1的方法，进一步包括监测治疗气体中NO的浓度。
16．权利要求1的方法，进一步包括监测治疗气体中二氧化氮的浓度。
17．权利要求1的方法，其中在提供病人吸入治疗气体前，使该治疗气体与二氧化氮清除剂接触。
18．权利要求1的方法，其中治疗气体包括不高于5ppm的二氧化氮。
19．权利要求1的方法，进一步包括测量病人在被提供治疗气体之前和之后的血红蛋白P50，其中相对于提供治疗气体前的P50，提供治疗气体后P50的降低是治疗气体的疗效的一个指征。
20．权利要求7的方法，进一步包括确定病人在被提供治疗气体之前和之后的血液中镰化细胞百分数，其中相对于提供该气体前镰化细胞百分数，提供该气体后镰化细胞百分数的降低是治疗气体疗效的一个指征。
21．权利要求1的方法，进一步包括确定提供治疗气体后Hb亚硝化作用的水平。
22．权利要求1的方法，其中治疗气体中NO的浓度是1到2,000ppm，并且给病人提供每天内至少一次五分钟的治疗气体，至少连续10天。
23．治疗被鉴定为患血红蛋白病病人的一种方法，该方法包括鉴定患血红蛋白病的病人，该血红蛋白病以与正常Hb-A的氧亲和力比较时，病人血红蛋白对氧的亲和力降低为特征；并且包括给病人施用治疗有效剂量的释放NO化合物。
24．权利要求23的方法，其中释放NO化合物选自S-亚硝基硫醇，NONOates，硝普盐，亚硝基胍，三硝酸甘油酸，叠氮化物，和羟胺。
25．权利要求23的方法，其中通过选自静脉注射，动脉内注射，经皮递送，口服，和吸入的途径给病人施用释放NO的化合物。
26．权利要求23的方法，其中通过吸入施用释放NO的化合物。
27．权利要求23的方法，其中所述血红蛋白病是镰状细胞病。
28．权利要求27的方法，其中在施用步骤前，病人被诊断为患镰状细胞危象。
29．一种治疗被鉴定为患血红蛋白病病人的方法，该方法包括鉴定患血红蛋白病的病人，该血红蛋白病以在与正常Hb-A的氧亲和力比较时病人的氧亲和力降低为特征；并且用治疗有效剂量的NO与一部分病人红细胞ex vivo或原位接触。
30．权利要求29的方法，其中血红蛋白病是镰状细胞病。
31．权利要求30的方法，其中，在接触步骤前，病人被诊断为患镰状细胞危象。
32．权利要求29的方法，其中所述NO是气体形式，并在与所述部分病人红细胞接触前流经一种可透过气体的膜。
33．一种治疗被鉴定为患血红蛋白病病人的方法，该方法包括鉴定患血红蛋白病的病人，该血红蛋白病以在与正常Hb-A的氧亲和力比较时病人的氧亲和力降低为特征；并且给病人提供一种供吸入的治疗气体，其中治疗气体包括治疗有效量的气态CO。
34．权利要求33的方法，其中通过病人吸入治疗气体在病人血液中产生2-10％的羧基-Hb。
35．权利要求33的方法，其中在治疗气体中含1到10,000ppm浓度的CO。
36．一种减少病人镰状细胞血红蛋白的聚合的方法，包括鉴定病人，其红细胞含Hb-S；并且提供由病人吸入的治疗气体，其中治疗气体包括足以减少病人红细胞中Hb-S聚合的量的气体NO。
37．权利要求36的方法，其中治疗气体含至少1ppm浓度的NO。
38．权利要求36的方法，其中治疗气体含至少10ppm浓度的NO。
39．权利要求36的方法，其中治疗气体含40-2000ppm浓度的NO。
40．权利要求36的方法，其中给病人提供至少10秒钟的治疗气体。
41．权利要求36的方法，其中给病人提供至少5分钟的治疗气体。
42．权利要求36的方法，其中用于吸入的治疗气体进一步包括氧气，该氧气在由病人吸入治疗气体前约10分钟以内与该治疗气体中的NO接触。
43．权利要求36的方法，其中在提供治疗气体步骤前病人被鉴定为处于发生镰状细胞危象的风险中。
44．权利要求36的方法，进一步包括监测治疗气体中NO的浓度。
45．权利要求36的方法，进一步包括监测治疗气体中二氧化氯的浓度。
46．权利要求36的方法，其中治疗气体在提供给病人吸入前与二氧化氮清除剂接触。
47．权利要求36的方法，其中治疗气体包括不高于5ppm的二氧化氮。
48．权利要求36的方法，其中治疗气体内的NO浓度是1到2000ppm，并且至少每天一次给病人提供治疗气体，持续至少连续10天。
49．权利要求36的方法，其中在病人接受手术时或在手术前或手术后1小时内，给病人提供治疗气体。
50．权利要求1的方法，其中治疗气体中NO的浓度是在约10和约100ppm之间。
51．权利要求1的方法，其中治疗气体中NO的浓度是在约40和约100ppm之间。
52．权利要求1的方法，其中治疗气体中NO的浓度是约80ppm，并且给病人提供至少一次45分钟的治疗气体。
全文摘要
本公开是治疗被鉴定患血红蛋白病病人的方法，该血红蛋白病以血红蛋白对氧的亲和力降低为特征。所述方法涉及(i)为病人呼吸或(ii)为体外(exvivo)处理这类病人的血红蛋白提供气态氧化氮和/或一氧化碳。或者，给病人施用释放氧化氮的化合物。
文档编号A61K31/21GK1227485SQ97195306
公开日1999年9月1日 申请日期1997年4月3日 优先权日1996年4月5日
发明者C·A·赫德, W·M·扎波尔 申请人:综合医院公司