专利名称：神经肽y激动剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及在调节神经元释放生理活性物质的特异性神经肽酪氨酸(NPY)受体处模拟NPY某些生物活性的肽。这些受体通常位于神经效应器接点处的神经元上，并在一些组织和物种中分类为NPY Y2受体亚型。另外，本发明还涉及包括这些肽作为活性组分的药物组合物以及包括给药这些组合物的治疗方法。
神经元接点前NPY受体的活化通常抑制神经活性，降低神经递质在对神经冲动之反应以及对起释放神经递质作用的局部因子之反应中神经递质的释放(Wahlestedt等人，1986)。
含NPY之神经元存在于各物种包括人的鼻粘膜中，通常与腺泡(glandular acini)和血管有关(Baraniuk等人，1990；Grunditz等人，1994)。对狗鼻粘膜副交感神经(翼管神经)的刺激可增加该区域的血流，该作用的主要部分是阿托品耐受性的。静脉内给药NPY由于副交感神经的刺激降低血管舒张，NPY Y1-选择性激动剂[Leu31，Pro34]不能模拟该作用，但是给药NPY Y2-受体激动剂N-乙酰[Leu28，Leu31]NPY(24-36)则可模拟该作用(Lacroix等人，1994)。这与接点前NPY Y2样受体介导的抑制神经递质由副交感神经释放是一致的。
接点前或神经肽YY2受体分类是基于肽YY(13-36)的作用，但是在许多系统中，该分子以及神经肽Y(13-36)确实具有加压活性(Rioux等人，1986；Lundberg等人，1988；Potter等人，1989)。有人对该现象进行了解释，指出在一些血管床中在接点后膜上有两种神经肽Y受体类型(神经肽YY1和神经肽YY2)(Schwartz等人，1989)。但是，这些分子缺乏选择性可能是由于对Y1受体之部分激动剂活性的保留，这使得它们引起功能降低的反应。我们已事先描述了神经肽Yj的13-36类似物——(Leu17，Glu19，Ala21，Ala22，Glu23，Leu28，Leu31)神经肽Y-(13-36)(ANA神经肽Y-(13-36))，其在体内研究中表现出与整个神经肽Y分子等同的接点前活性(Potter等人，1989)。但是，该类似物仍保留明显的加压活性，或者神经肽YY1受体介导的相互作用。
我们已事先描述了在抑制心迷走神经作用方面模拟神经肽Y之作用但没有加压作用的神经肽Y类似物。用一个类似物——N-乙酰[Leu26，Leu31]神经肽Y-(24-36)进行了结合研究，其结果是一致的，该研究表明与在人成神经细胞瘤细胞系SMS-KAN上表达的神经肽YY2受体亚型具有明显的亲和性，但是对在人细胞系SK-N-MC上表达的神经肽YY1受体类型没有亲和性(Potter等人，1994)。另外，该类似物不刺激在成纤维细胞中表达之人神经肽YY1受体诱发胞液钙的增加，但是该受体应答完整的神经肽Y。
因此，在本发明的第一方面中，其包括具有以下式的神经肽Y受体的配体
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15其中X1是H、R1-CO或者一个或两个天然氨基酸，X2是Leu、Ile、Val、Nle、Sar、Gly、Ala、Aib、D-Leu、D-Ile、D-Val、D-Ala或D-Nle；X3是Arg、Lys、Orn、Ala、Dbu、或His；X4是His、Lys、Arg、Ala、Gly、Ser、Thr、Asn、Gln或Aib；X5是Tyr、Phe、Ala、Gly、Ser、Thr、Asn、Gln或Aib；X6是Leu、Ile、Val、Ala、Arg或Nle；X7是Asn、Ala或Gln；X8是Leu、Ile、Val、Ala、Aib或Nle；X9是Leu、Ile、Val、Ala、Aib或Nle；X10是Thr、Ala或Ser；X11是Arg、Lys或Orn；X12是Gln、Pro或Asn；X13是Arg、Lys或OrnX14是Tyr、Phe、His、Trp、D-Tyr、D-Phe、D-His或D-Trp；X15是OH、NH2、NHR2、NR3R4或者一个或两个其端氨基酸是正常或酰胺形式的天然氨基酸，其中R1、R2、R3和R4独立地是直链、分枝或脂环结构的烷基；而且X2-X10中至少一个是Ala。
以上缩写为Sar肌氨酸或N-甲基甘氨酸；Aib氨基异丁酸；Orn鸟氨酸；Dbu二氨基丁酸。
在一个优选实施方案中，X2、X4、X5、X8和X9中至少两个是Ala。在一个特别优选的实施方案中，X2和X5是Ala。
在一个特别优选的实施方案中，R1是选自甲基、乙基、正丁基、叔丁基、环己基或具有10个或更少碳原子的其他烷基的烷基。
在进一步优选的实施方案中，R2、R3和R4是独立地选自甲基、乙基、异丙基、正丁基、环己基或具有10个或更少碳原子的其他烷基的烷基。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述配体是Ac-Ala-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Ala-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Ala-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-Ala-Tyr-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-His-Ala-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-His-Tyr-Ala-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Ala-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Ala-Leu-Tyr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Ala-Arg-His-Ala-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Ala-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-DLeu-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-DLeu-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Phe-NH2；或Ac-DLeu-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Phe-NH2；或Ac-DLeu-Arg-Ala-Aib-Leu-Asn-Ala-Aib-Thr-Arg-Gln-Arg-Phe-NH2；或Ac-DLeu-Lys-Ala-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Lys-Gln-Lys-Phe-NH2；或丁酰基-DLeu-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Phe-NH2；或Ac-Ala-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-DTyr-NH2；或Ac-Ala-Arg-Ala-Ala-Leu-Gln-Ile-Leu-Ser-Arg-Asn-Arg-Tyr-NH2。
在本发明的优选实施方案中，神经肽Y受体是神经肽YY2样受体。术语“神经肽YY2样受体”是指具有与人神经肽YY2受体共同药理学特性的受体。此等受体可调节神经递质如乙酰胆碱和去甲肾上腺素的释放，并可调节效应子从传感神经的释放。一些NPY受体亚型如Y5可被在NPYY2受体处高效力但在NPYY1处低效力的配体活化(Gerald等人，1996)，并因而是Y2样的。在最优选的实施方案中，所述受体是神经肽YY2受体。
本发明的配体可为多聚体的形式，例如他们可以是二聚或三聚体的形式。
本发明领域中的普通技术人员可以理解的是，在不严重损坏肽的生物活性的情况下，还可对本发明的肽进行各种的修饰。这可通过各种改变来实现，如在肽序列中所述改变不实质上降低肽的生物活性的保守性或非保守性的插入或取代。
在此所认为的修饰可包括但不限于对侧链的修饰、在肽合成期间加入非天然氨基酸和/或他们的衍生物以及使用交联剂和其他可在肽上产生构象限制的方法。
本发明范围内的侧链修饰的例子包括通过与醛反应、然后用NaBH4还原由还原性烷基化来修饰氨基；用N-甲基乙酰胺的酰胺化；用乙酸酐的乙酰化；用氰酸盐对氨基进行氨甲基酰化；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)对氨基进行三硝基苄基化；用琥珀酸酐和邻苯二甲酸酐使氨基酰化；以及用吡多醛-5′-磷酸酯、然后用NaBH4还原使赖氨酸吡多醛化。
精氨酸基的胍基可如下进行修饰用如2，3-二丁酮、苯基乙二醛和乙二醛等试剂形成杂环缩合产物。
羧基可如下进行修饰通过形成O-酰基异脲进行碳二亚胺活化，然后进行衍生化，如形成相应的酰胺。
色氨酸基可如下进行修饰用N-溴代琥珀酰亚胺进行氧化或者用2-羟基-5-bitrobenzyl溴或硫苯基(sulphenyl)卤化物对吲哚进行烷基化。另一方面，酪氨酸可通过用四硝基甲烷进行硝基化形成3-硝基酪氨酸衍生物来改变。
组氨酸基的咪唑环的修饰可如下进行用碘代乙酸衍生物进行烷基化或者用二乙基焦碳酸酯(pyrocarbonate)进行N-乙酯基化。
在肽合成期间加入非天然氨基酸和衍生物的方法包括但不限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、t-丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。
作为进一步的例子，可在本发明中用其他具有疏水性侧链的非天然氨基酸替代X14上的残基，如Cha(β-环己基-L-丙氨酸)、Nal(β-(2-萘基)-丙氨酸)、Phg(L-苯基甘氨酸)、Tic(L-1，2，3，4-四氢异喹啉3-羧酸)、Thi(β-(2-噻吩基)-L-丙氨酸)、或他们的D-异构体，但不实质上改变生物活性。
也可在本发明的肽上添加各种基团，以增加有利的性质如增加效力或者延长体内半衰期，而不实质上降低肽的生物活性。对本发明肽进行的此等修饰不导致生物活性的降低，这些修饰也被认为是在本发明的范围之内。
本发明的配体可用于治疗以下病症——与炎症有关的病症(如鼻腔炎症、鼻炎包括过敏性和血管舒张性的、哮喘、关节炎)；——与神经原炎症有关的病症(如偏头痛、头痛、眼的炎症、鼻炎等)；——鼻炎-血管舒张性鼻炎；——呼吸疾病(如肺充血、哮喘、上呼吸道炎症)；——睡眠紊乱；——与交感神经活性增强有关的病症；——与性功能障碍和生殖疾病有关的病症；——与心脏、血管或者肾系统有关的疾病(如血管痉挛、心衰竭、休克、心肥大、血压升高、心绞痛、心肌梗塞、突然心死亡、心率失常、周围血管疾病、肾衰竭等)；——与交感神经活性增强有关的病症(如冠状动脉手术以及胃肠道的手术期间或之后)；——脑疾病以及与疼痛或伤害性知觉有关的疾病；——与中枢神经系统有关的疾病(如脑梗塞、神经变性、癫痫、中风、脑血管痉挛、抑郁、焦虑或痴呆)；——与非正常胃肠道运动和分泌有关的疾病(节段性回肠炎)；——影响泌尿生殖系统的疾病和病症(如尿失禁)；——非正常饮食摄入疾病(如肥胖、厌食、食欲过盛)。
在第二方面中，本发明包括用于缓解鼻腔充血或者治疗易于引发急性肾衰竭的血管收缩症、抗高血压、心血管疾病、与肺充血有关的病症、炎症、神经原性炎症、睡眠紊乱、与交感神经活性增强有关的病症、与中枢神经系统有关的疾病、与疼痛或伤害性知觉有关的病症、与胃肠道运动和分泌有关的疾病、肥胖、或阿尔茨海默氏病、或者作为抗精神病药的组合物，该组合物包括本发明第一方面的肽以及药物学载体。
本发明的第三方面包括用于在患者中缓解鼻腔充血、减轻心迷走神经作用、治疗易于引发急性肾衰竭的血管收缩症、高血压、心血管疾病、与肺充血有关的病症、炎症、神经原性炎症、睡眠紊乱、与交感神经活性增强有关的病症、与中枢神经系统有关的疾病、与疼痛或伤害性知觉有关的病症、与胃肠道运动和分泌有关的疾病、肥胖、或阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括向患者给药有效剂量的本发明第二方面的组合物。
在本发明的第三方面中，优选的是患者患有鼻腔充血、肺充血或者易于引发急性肾衰竭的血管收缩症。在进一步优选的实施方案中，将该组合物以喷雾剂给药。
活性化合物可以常规方式给药，例如口服、静脉内(水溶性的)、肌肉内、皮下、鼻腔内、皮内或者栓剂或植入(如使用缓释分子)。也可吸入(干粉或在溶液中)至肺中。取决于给药途径，活性成分需要包衣在合适材料中，以保护所述成分避免酶、酸以及其他可使该成分失活的自然条件的作用。例如，肽的低亲脂性可使他们在胃肠道中被能够断裂肽键的酶或者在胃中被酸解破坏。为以经胃肠道给药，他们可进行包衣，或者与防止他们失活的物质一起给药。例如，肽可在溶剂中、脂质体中、或者与酶抑制剂一起给药。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟代磷酸酯(DFP)以及抑肽酶。脂质体包括油包水型乳剂以及常规的脂质体。
活性化合物也可非经胃肠道给药。也可在甘油、聚乙二醇、以及他们的混合物和油中制备分散液。在常规条件下储藏和使用时，这些制剂包括防止微生物生长的防腐剂。
适用于注射给药的药物剂型包括无菌水溶液(是水溶性的)或者分散液和无菌粉末，该粉末可由于立即制备无菌注射溶液和分散液。在所有情况下，所述剂型必须是无菌的，而且是可流动的，其流动程度使得易于注射。其在制造和储藏的情况下必须是稳定的，而且能够防止微生物如细菌和真菌的污染。载体可以是溶剂或者分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(如甘油、聚丙二醇、液体聚乙二醇等)、他们的合适混合物以及植物油。例如使用包衣如卵磷脂、在分散液时保持所需的粒径、以及使用表面活性剂，由此可保持适当的流动性。可用各种抗菌剂和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、坏血酸、硫柳汞等，防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂如蔗糖和氯化钠。在组合物中使用延迟吸收剂如单硬脂酸铝和明胶，可延长注射组合物的吸收。
可在活性化合物中掺入所需量的合适溶剂以及其他需要组分，然后过滤灭菌，由此制备无菌注射液。通常情况下，将各种无菌组分掺入在无菌载体中，所述载体包括基本的分散介质和所需的其他组分，由此可制备分散液。在使用粉末或者用粉末制备无菌注射液时，优选的制备方法是真空干燥和冻干法，这些方法可从以前的无菌过滤溶液制得活性组分以及任何其他所需组分的粉末。
为使本发明更易于理解，以下将参考实施例和附图来描述其优选实施方案。在附图中
图1显示了Ac[Ala24，Ala27，Leu28，Leu31]NPY(24-36)对电刺激肾交感神经诱发的鼠肾血管耐受性增加的作用。材料和方法体内在成年鼠(Wistar)(250-350g)上进行试验，雄性和雌性都有，用戊巴比妥钠(Nembutal，Boehringer-Ingelheim；60mg/kg，i.p.)麻醉。对气管进行插管处理，并使动物进行人工通气。在股静脉插管，以给药肽和进一步剂量的麻醉剂。在左股动脉中插管，以记录动脉压。切断迷走神经，以消除迷走神经介导的对心脏的反射作用，该作用在用神经肽Y升高血压时会发生。使用独立的方形波刺激仪(GrassInstruments)，每30秒用6秒连续的超大刺激(2Hz，1ms；7V)刺激右迷走神经的心端。选择频率以将脉搏间隔增加100ms，在该变化上产生次最大作用。用针式电极测量心电图，并在示波器的一个通道上进行监测。启动ECG，一跳一跳地记录脉搏间隔(连续心跳之间的间隔)。在钢笔记录仪上记录脉搏间隔和动脉压。
由所有鼠的数据绘制剂量-反应曲线。因为测试肽的作用时间长，并没有将所有的肽都给至各鼠。但是，各鼠通常接受神经肽Y和两个其他肽。
作为接点前活性的指示，测量两个参数对注射肽后刺激迷走神经引发的脉搏间隔增加的最大百分抑制以及该作用半恢复的时间(T50)。对于加压作用，其是接点后活性的指示，也测量两个参数注射肽后峰值加压反应和血压增加的持续时间。这些指标给出了肽在接点前和接点后位置处作用的可靠量度，而且以前已被用于为此目的的试验中(Potter等人，1989；Potter等人，1991)。使用单路ANOVA分析结果。肾血流试验(体内)的方法在六条重量在18-26kg之间的成年mongrel狗上进行试验，雄性和雌性狗都有。通过药团注射戊巴比妥钠(36mg/kg，静脉内，Nembutal，Boehringer Ingelheim)使狗麻醉，然后保持输液(2-3mg/kg/hr)。使动物人工通气，保持恒定的温度和血压，并连续地监测心率。
腹膜后暴露左肾，并使用超声流动探测仪(Transonic System Inc.，N.Y.)连续地监测动脉血流(Pemow & Lundberg，1989a)。分离、切断通向肾的节后神经，并放置在用于刺激的双极铂电极上(1-10Hz，5-10V，1-5msec)。已表明去甲肾上腺素和神经肽Y共存于肾中，并且在刺激肾神经时一起释放(Pemow & Lundberg，1989b)。
在一定范围的频率(1-10Hz)中刺激肾神经30秒，然后绘制频率—反应曲线。在流动峰值变化时测量反应。在团块给药NPY Y2受体激动剂(40mol/kg)前和后检查这些频率—反应关系。以血管耐受性报告反应。结合试验(体外)的方法细胞培养从ATCC得到表达人Y1受体的SK-N-MC细胞和表达人Y2受体的SMS-MSN细胞。他们在1∶1 DMEM∶Ham F12培养基(ICN)中培养，所述培养基中包含10％胎牛血清、0.1％非必须氨基酸、0.2mM谷氨酰胺、和0.056％碳酸氢钠。刮取融合细胞，将沉淀物储藏在-80℃下。在使用当天将细胞融化，在结合缓冲盐水中洗涤一次，由22ga针中通过数次，然后使用bicinchoninic酸(BCA kit，Pierce)测定蛋白质含量。调节细胞体积，使蛋白质浓度为200-400μg/ml(SMS-MSN细胞)或者400-800μg/ml(SK-N-MC细胞)，然后添加BSA和蛋白酶抑制剂。受体结合测定在Multiscreen FC板(Millipore)中进行受体结合测定(Gregor等人，1996)，在4℃下用0.5％PVP/0.1％Tween-20过夜预包衣(Scott等人，1995)，以防止非特异性结合。仅在使用前过滤板，并用50mMTris-HCl pH7.4/0.1％BSA洗涤两次。将总体积为200μl的30pMNPY(Amersham)、竞争剂(10pM-1μM)和细胞(10μg SMS-MSN或者20-40μg SK-N-MC)在室温下培养于结合缓冲液中2.5小时，该缓冲液包括50mM Tris-HCl pH7.4、115mM NaCl、15mM KCl、5mM CaCl2、2mM MgSO4、1.25mM KH2PO4、25mM NaHCO3、10mM葡萄糖、0.1％BAS、4mg/ml杆菌肽、和0.5mM PMSF(Tschopl等人，1993)。过滤终止结合。过滤器用2℃下200μl体积的50mM Tris-HClpH7.4/0.1％BSA通过快速过滤洗涤过滤器两次，然后在LKBγ计数器中计数。使用单点拟合函数通过非线性回归分析特异性结合(GraphadPrism)。在1μM竞争剂存在下进行结合，由此定义非特异性结合。肽合成和纯化用标准的Boc或者Fmoc固相化学合成肽酰胺。
使用聚苯乙烯基MBHA树脂进行Boc合成。使用甲醇中的乙酸酐在合成结束时进行乙酰化。用包含氟化氢的苯酚(1.3g-10ml)作为清除剂断裂肽，然后抽提至含水相(30％乙腈水溶液v/v)。用醚洗涤清除剂，然后冻干粗抽提物水溶液，得到粗肽。在断裂过程中除去各氨基酸的侧链保护基。用离子交换和反相HPLC(高压液相色谱)纯制肽至95％。
使用tentagel SRAM树脂进行Fmoc合成。使用AcONSu(乙酸的N-琥珀酰亚胺基酯)在最后一轮进行乙酰化。用包含95％TFA的硫代肌醇和p-甲酚作为清除剂来断裂肽，并抽提至包含30％乙腈的含水相中。用醚洗涤清除剂，然后冻干粗抽提物水溶液，得到粗肽，用离子交换和反相HPLC纯制该粗肽至95％。用电喷射质谱分析肽的氨基酸组成以及正确的分子离子。用分析性HPLC和CE(毛细管电泳)估测纯度。所有带正电荷的肽以乙酸盐的形式存在，而所有样品中的肽含量使用Picotag氨基酸分析法在Pierce标准的基础上确定。结果和讨论根据氨基酸24-36所包括之区域中的神经肽Y的氨基酸序列，已合成了新型肽并测试了体内活性。
在鼠体内测试的所有分子中，只有NPY剂量依赖性地明显升高血压。在测试剂量中其他化合物中没有一个明显改变血压。这说明缺乏对与升高血压有关的神经肽Y受体——Y1受体亚型的直接作用。
由于迷走神经的电刺激，给药表1中所列的所有化合物都剂量依赖性地抑制心率降低。明显的是，在Ac[Leu28，Leu31]NPY(24-36)中于24-31的任何位置上的Ala取代都导致作为迷走神经刺激心率之作用的抑制剂的效力增强(EC50下降)。该迷走神经刺激作用的抑制表明由交感神经使心脏受神经支配的乙酰胆碱释放降低，并归因于对NPYY2受体的刺激(Potterr等人，1994)。在24-31位的Ala取代都与NPYY2受体的高亲合性以及对NPYY1受体的低亲合性有关(表1)。出乎意料之外的是，在抑制迷走神经介导之心率降低的体内活性与Y2受体的亲合性之间没有直接的相关关系，而这可说明一些化合物的体内稳定性增加。在Ac[L28，L31]NPY24-36之8-13氨基酸残基的任何一个位置上的Ala取代可增加生物活性，这是非常令人意外的。更令人惊奇的发现是，产生如Ac[A24，A27，L28，L31]NPY24-36、Ac[A26，A27，L28，L31]NPY24-36以及Ac[A24，26，27，30，31，L28，L31]NPY24-36之化合物的多个Ala取代也可增强Y2受体处的体内活性。13的5个残基可被Ala替代，这意味着在这些位置(24，26，27，30，31)上相对较长的侧链对保持NPY Y2受体的效力或亲合性并不是必须的。这是令人惊奇的，因为替代的氨基酸残基在结构和性质上是不同的，两个是芳香性(His，Tyr)，一个带有羧酰胺侧链，其余的除Ala外带有3个碳原子的脂族侧链。而且，多Ala取代化合物NPYY2受体处的亲合性与Ac[L28，L31]NPY24-36的类似或者比它更好，虽然Leu24或His26仅被Ala取代导致亲合性明显降低。此等活性的保持或增强是不可预测的。估测了包含多Ala的化合物Ac[A24，A27，L28，L31]NPY24-36抑制由肾神经刺激引发的肾血管耐受性增加的能力。40nmol剂量的该化合物对循环没有直接的作用(表1)，几乎完全抑制神经刺激的作用(图1)，这证明抑制了神经递质从受刺激神经中的释放。该化合物对NPYY2受体具有高亲合性，因为虽然受体介导的抑制神经递质从肾神经中释放的作用尚未被鉴定，但他们的特征是Y2样的。表1一系列肽的体内活性(麻醉鼠在脉搏间隔(P1在Y2样受体处的活性)和血压(BP在Y1受体处的活性)上的变化)以及体外对Y1和Y2受体的亲合性
+对10nmole剂量无反应。
体内观察表明，这些化合物具有抑制神经递质从交感神经和副交感神经中释放的普通能力，而且希望该化合物在需要抑制任何类型的神经递质的情况中都有能力。希望抑制神经递质的情况的例子包括如鼻腔充血、肺充血和神经原性炎症的病症。
本领域的技术人员应认识到，在不偏离已描述之本发明的实质和范围的情况下，还可对本发明进行各种的改进和/或变化。因此，本发明的实施方案仅是示例性的，而不是限制性的。
参考文献Aakerlund，L.，U.Gether，T.W.Schwartz，and O.Thastrup(1990)，Yreceptors for neuropeptide Y are coupled to mobilization of intracellularcalcium and inhibition of adenylate cyclase，FEBS Lett，260，73-78.Baraniuk，J.N.，Castellino，S.，Lundgren，J.D.，Goff，J.，Mullol，J.，Merida，M.，Shelhamer，J.H.and Kaliner，M.A.(1990)，Neuropeptide Y(NPY)inhuman nasal mucosa.J.Respir.Cell Mol.Biol.3，165-173；Bard.J.A.，Walker，M.W.，Branchek，T.A.and Weinshank，R.L.(1995)，J.Biol.Chem.，270，26762-26765.Cloning and functional expression of Y4subtype receptor for pancreatic polypeptide，neuropeptide Y，and peptideYY.Dahloff，C.，P.Dahloff and J.M.Lundberg(1985)，Enhancement of bloodpressure increase upon α-adrenoceptor activation and direct pressor effectsin pithed rats，Eur.J.Pharmacol.109，289.Edvinsson，L.(1998)，The effects of neuropeptide Y on the circulation，ISIAtlas of SciencePharmacoloy 2，359.Fuhlendorff，J.，U.Gether，L.Aakerlund，N.Langeland-Johansen，H.Togerson，S.GF.Melberg，U.B.Olsen，O.Thastrup，and T.W.Schwartz(1990)，[Leu31，Pro34]Neuropeptide YA specific Y1receptor agonist，Proc.Natl.Acad.Sci.87，182-186.Gerald，C.，Walker，M.W.，Criscione，L.，Gustafaon，E.L.，Batzi-Hartmann，C.，Smith，K，E.，Vaysse，P.，Durkin，M.M.，Laz.T.M.，Linemeyer，D.L.，Schaffhauser，A.O.，Whitebread，S.，Hofbauer，K.G.，Taber，R，I.，Branchek，T.A.and Weinshank，R.L.(1960).A receptor subtype involved inneuropeptide-Y-induced food intake.Nature，382，168-171.Gerald，C.，Walker，M.W.，Vaysse，P.J.J，He，C.，Branchek，T.A.andWeinshank，R.L.(1995)J.Biol.Chem.，270，26758-26761.Expressioncloning and pharmacological characterisation of a human hippocampalneuropeptide Y/peptide YY Y2 rreceptor subtype.Gregor，P.，Millham，M.L.，Feng，Y.，DeCarr，L.B.，McCaleb，M.L.，andCornfield，L.J.(1996).FEBS Lett.，381，58-62.Cloning andcharacterisation of a novel receptor of pancreatic polypeptide，a member ofthe neuropeptide Y receptor family.Grundemar，L.，Grundstrom，N.，Joahansson.I.G.M.，Andersson，R.G.G.and Hakanson，R.(1990)Suppression by neuropeptide Y of capsaicin-seneitive sensory nerve-mediated contraction in guinea-pig airways.Br.J.Pharmacol.，99，473-476.；Grundemar，L.，Wahlestdet，C.and Wang，Z.Y.(1993)Neuropeptide Ysuppesses the neurogenic inflammatory response in the rabbit eye；mode ofaction.Regul.Pept.，43，57-64.Grunditz，T.，Uddman，R.and Sundler，F.(1994)Origin and peptide contentof nerve fibers in the nasal mucosa of rats.Anat，Embryol.189，327-337.Hashim，M.A.and Tadepalli，A.S.(1995)Cutaneous vasomotor effects ofneuropeptide Y，Neuropeptides，29，263-271.Herzog，H.，Y.J.Hort，H.J.Ball.G.Hayes，J.Shine，and L.A.Selbie(1992)，Cloned human neuropeptide Y receptor couples to two different secondmessenger systems，Proc，Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，5794-5789.Lacroix，J.S.，Ulman，L.G.and Potter，E.K.(1994)Modulation byneuropeptide Y of parasympathetic nerve-evoked nasal vasodilitation via Y2prejunctional receptor，Br.J.Pharmacol.，113，479-484.Lundberg，J.M.，Anggard，A.，Theodorsson，Norheim E.，Pernow.，J.(1984)Guanethidine-sensitive release of neuropeptide Y-like immunoreactivity inthe cat spleen by sympathetic nerve stimulation，Neurosci.Lett.，52，175-180.Lundberg，J.M.，Hensen，A.，Larsson，O.，Rudehill，A.，Saria，A & FredholmB.B.，(1988).Neuropeptide Y receptor in pig spleen；binding characteristics，reduction of cAMP formation and calcium antagonist inhibition ofvasoconstriction，Eur.J.Pharmacol.Vol.45；21-29Pernow，J.& Lundberg，J.M.(1989a).Release and vasoconstrictor effects ofneuropeptide Y in relation to non-adrenergic sympathetic control of renalblood flow in the pig.Acta Physiol Scand，136，507-517.Pernow，J & Lundberg，J.M.(1989b).Modulation of nonadrenaline andpolypeptide(NOY)release in the pig kidney in vivoinvolvement of alpha 2，NPY and angiotensin II receptor.Naunyn-Schmiedeberg′s Arch Pharmacol.，340，379-385.Potter，E.K.and M.J.D.McCloskey，(1992)，[Leu31，Leu34]neuropeptide Y，aselective functional agonist at neuropeptide Y receptors in anaesthetised rats，Neurosci.Lett.134，183-186.Potter，E.K.，(1985)，Prolonged non-adrenergic inhibition of cardiac vagalactionfollowing sympathitic stimulationneuromodulation by neuropeptideY Neurosci.Lett.54，117-121.Potter，E.K.(1988)，Neuropeptide Y as an autonomic neurotransmitter，Pharm.Ther.，37，251-273.Potter，E.K.，Mitchell，L.，McCloskey，M.J.，Tseng，A.，Goodman，A.E.，Shine，J.and McCloskey，D.I.(1989)Pre-and postjunctional action ofneuroprptide Y and related peptides.Regul.Pept..25，167-177.Potter，E.K.，J.Fuhlendorff and T.W.Schwartz(1991)，[Pro34]neuropeptideY selectively identifies postjunctional-mediated actions of neurpeptide Y invivo in rats and dogs，Eur.J.Pharmacol.193，15-19.Potter，E.K.，Barden，J.A.，McCloskey，J.D.，Selbie，L.A.，Tseng，A.，Herzog，H.And Shine，J.(1994)，A novel neuropeptide Y analog，N-acetyl[Leu28，Leu31]neuroprptide Y(24-36)，with functional specificity for thepresynaptic(Y2)receptor，Eur.J.Pharmacol.Mol.Pharmacol.Sect，267，253-262.Revington，M.L.，E.K.Potter and D.I.McCloskey，(1987)，Effects ofneuropeptide Y on the pressor responses to phenylephrine and to activationof the sympathetic nervous system in anaesthetised rats，Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.14.703-710.Rioux，F.，H.Bachelard，J.C.Martel and S.St.Piere，(1986)，Thevasoconstrictor effect of neuropeptide Y and related peptides in the guineapig isolated heart，Peptides，7，27-31.Schwartz，T.W.，J.Fuhlendorff，H.，Langeland，J.C.Togerson，S.P.Sheikh，(1989)，in Neuropeptide Y-XIV Nobel Symposium，edV.Mutt；T.Hokfelt，K.Fuxe and J.M.Lundberg，Raven，N.Y.pp143.Scott，C.W.Gomes，B.C.，Hubbs，S.J.，Koenigbauer，H.C.(1995).Afiltration-based assay to quantitate granulocyte-macrophage colony-stimulating factor binding，Anal.Biochem.，228，150-154.Sheikh，S.P.，R.Hakanson and T.W.Schwartz，(1989)，Y1and Y2receptorsfor neuropeptide Y，FEBS Lett，245，209-214.Tatemoto，K.，M.Carlquist and V.Mutt，(1982)，Neuropeptide Y-a novelbrain peptide with structural similarities to peptide YY and pancreaticpolypeptide，Nature 296，659-660.Tschopl，M.，Miller，R.C.，Pelton，J.，Stoclet，J.C.and Bucher，B.(1993)，Br.J.Pharmacol.，110，1098-1104.Vasoconstrictor effects of variousneuropeptide Y and analogues on the rat tail artery in the precence ofphenylephrine.Wahlestedt，C.，N.Yanaihara and R.Hakanson，(1986)，Evidence fordifferent pre-and post-junctional receptors for neuropeptide Y and relatedpeptides，Regul.Pep.13，307-318.Warner，M.R.and M.N.Levy，(1989)，Neuropeptide Y as a putativemodulator of the Vagal effects on heart rate，Cir.Res.64，882-889.
权利要求
1.一种具有以下式的神经肽Y受体的配体X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15其中X1是H、R1-CO或者一个或两个天然氨基酸，X2是Leu、Ile、Val、Nle、Sar、Gly、Ala、Aib、D-Leu、D-Ile、D-Val、D-Ala或D-Nle；X3是Arg、Lys、Orn、Ala、Dbu、或His；X4是His、Lys、Arg、Ala、Gly、Ser、Thr、Asn、Gln或Aib；X5是Tyr、Phe、Ala、Gly、Ser、Thr、Asn、Gln或Aib；X6是Leu、Ile、Val、Ala、Arg或Nle；X7是Asn、Ala或Gln；X8是Leu、Ile、Val、Ala、Aib或Nle；X9是Leu、Ile、Val、Ala、Aib或Nle；X10是Thr、Ala或Ser；X11是Arg、Lys或Orn；X12是Gln、Pro或Asn；X13是Arg、Lys或Orn；X14是Tyr、Phe、His、Trp、D-Tyr、D-Phe、D-His或D-Trp；X15是OH、NH2、NHR2、NR3R4或者一个或两个其端氨基酸是正常或酰胺形式的天然氨基酸，其中R1、R2、R3和R4独立地是直链、分枝或脂环结构的烷基；而且X2-X10中至少一个是Ala。
2.如权利要求1所述的配体，其中，X2、X4、X5、X8和X9中至少两个是Ala。
3.如权利要求1或2所述的配体，其中，X2和X5是Ala。
4.如权利要求1-3之一所述的配体，其中，R1是选自甲基、乙基、正丁基、叔丁基、环己基或具有10个或更少碳原子的其他烷基的烷基。
5.如权利要求1-4之一所述的配体，其中，R2、R3和R4是独立地选自甲基、乙基、异丙基、正丁基、环己基或具有10个或更少碳原子的其他烷基的烷基。
6.如权利要求1-5之一所述的配体，其以下式Ac-Ala-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Ala-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Ala-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-Ala-Tyr-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-His-Ala-Leu-Asn-Leu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-His-Tyr-Ala-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Ala-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Ala-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Ala-Arg-His-Ala-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Leu-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-Ala-Ag-His-Tyr-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-DLeu-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2；或Ac-DLeu-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Phe-NH2；或Ac-DLeu-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Phe-NH2；或Ac-DLeu-Arg-Ala-Aib-Leu-Asn-Ala-Aib-Thr-Arg-Gln-Arg-Phe-NH2；或Ac-DLeu-Lys-Ala-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Lys-Gln-Lys-Phe-NH2；或丁酰基-DLeu-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Phe-NH2；或Ac-Ala-Arg-Ala-Ala-Leu-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-DTyr-NH2；或Ac-Ala-Arg-Ala-Ala-Leu-Gln-Ile-Leu-Ser-Arg-Asn-Arg-Tyr-NH2。
7.如权利要求1-6之一所述的配体，其中，所述神经肽Y受体是神经肽YY2样受体。
8.如权利要求1-7之一所述的配体，其中，所述神经肽Y受体是神经肽YY2受体。
9.一种用于治疗降低神经递质释放对其有益的病症、特别是缓解鼻腔充血或者治疗易于引发急性肾衰竭的血管收缩症、抗高血压、心血管疾病、与肺充血有关的病症、炎症、神经原性炎症、睡眠紊乱、与交感神经活性增强有关的病症、与中枢神经系统有关的疾病、与疼痛或伤害性知觉有关的病症、与胃肠道运动和分泌有关的疾病、肥胖、或阿尔茨海默氏病、或者作为抗精神病药的组合物，该组合物包括如权利要求1-8之一所述的配体以及药物学载体。
10.一种用于在患者中缓解鼻腔充血、减轻心迷走神经作用、治疗易于引发急性肾衰竭的血管收缩症、高血压、心血管疾病、与肺充血有关的病症、炎症、神经原性炎症、睡眠紊乱、与交感神经活性增强有关的病症、与中枢神经系统有关的疾病、与疼痛或伤害性知觉有关的病症、与胃肠道运动和分泌有关的疾病、肥胖、或阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括向患者给药有效剂量的如权利要求1-8之一所述的配体。
11.一种用于缓解患者中鼻腔充血的方法，该方法包括向患者给药有效剂量的如权利要求1-8之一所述的配体。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述组合物是经鼻腔给药的。
全文摘要
本发明涉及得自于NPY24－36氨基酸序列的丙氨酸取代的神经肽Y受体配体。该配体可用于例如治疗鼻炎、呼吸疾病以及易于导致急性肾衰竭的血管收缩症。
文档编号A61P3/04GK1322212SQ97197106
公开日2001年11月14日 申请日期1997年6月5日 优先权日1996年6月5日
发明者埃丽卡·波特 申请人:派普泰克有限公司, Crc生药研究有限公司