专利名称：一种抗肿瘤生物制品及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制品，具体涉及一种抗肿瘤生物制品及其制备方法。属于生物技术领域。
肿瘤，特别是癌症，是人类的大敌，每年都会夺去成千上万人的生命。
癌症的治疗，是世界医学的难题，因为肿瘤的病因复杂，种类多，机理又太难全面认知，并因人类的个体差异，人种，地理，饮食，环境，遗传及基因等影响，增加了癌肿治疗的难度。通常早期肿瘤采用手术治疗，辅以放疗，化疗等，有令人难以忍受的痛苦，而往往效果不理想，因为手术虽可切除病灶，但肿瘤生成的条件没有改变，原因没有消除，所以一般预后不佳，癌肿病人的死亡率还是很高的。
长期以来，人们致力于探索癌肿的发病机理。已可确认的是，癌症并不传染，人体癌细胞仅仅是人体正常细胞的一种变异，正常情况下，癌细胞存在于几乎每一个人的体内。绝大多数的人并没有得癌症，那是因为人体正常的免疫系统制约了癌细胞的发展与转化。只有那些免疫功能减弱，抵抗力受损时，癌肿冲破了机体原有的免疫防卫屏障，才会得癌肿。由此可见，癌肿之所以得以形成与发展，与人体的免疫功能有着直接而且是根本的关系。因此，保持并加强人体免疫功能，特别是加强对肿瘤有特异免疫功能的细胞因子，才是肿瘤防治的积极，主动，而且是基本的有效方法。
在肿瘤治疗方法上，曾经采取过一种切取自身肿瘤组织，制成疫苗，再注射到自身机体中，即“细胞回输法”。目的是企图以本人的肿瘤抗原来刺激人体的免疫反应，产生特异免疫细胞因子，增强自身免疫力。但效果并不很理想，因为得了癌肿的病人，其免疫系统已极度衰竭，不足以产生免疫反应达到预期的目的。因此，以人体肿瘤为抗原，借助有强壮体魄的动物作为“生物反应器”，作为病人的“替身”，刺激其免疫系统，使其产生强大的免疫反应，大量生产出能对抗这种特异抗原的抗体，反过来补充人体，才是完善“细胞回输法”的根本出路。这种方法有很强的特异性，病人能获得良好的治疗，特别是手术后防治病人的抗复发与根治。
国际上，免疫食品，特别是免疫牛奶的研究已经多年的探索与实践。国内971168466专利的免疫牛奶，是以人体甲肝，乙肝病毒，幽门螺旋杆菌(HP)疫苗去免疫奶牛，以取得抗甲肝，抗乙肝，抗HP的免疫牛奶，事实证明，这种免疫牛奶确有保健作用，特别是抗HP的免疫牛奶，投放市场后大量病例证明，对养胃护胃确有疗效。
欧洲专利EPO 330521，EPO 143345，EPO 046909，EPO 395120，美国专利WO 93/25232等曾先后公告了一系列抗各种病菌的免疫牛奶，如抗葡萄球菌，沙门氏菌，链球菌，棒状杆菌，放线杆菌，布鲁氏菌，志贺氏杆菌，支原菌，芽孢梭菌等，对各种炎症，高血压，心血管病，肺部疾病，肠道疾病，狐臭，蛀牙，等有疗效。然而，至今为止尚没有人尝试提出以人体肿瘤作抗原，对肿瘤组织表面抗原进行异构后，再去免疫动物，来制造具有特殊识别能力的抗肿瘤生物制品。
本发明的目的，是提供一种抗肿瘤生物制品。其特征为该制品是直接以人体肿瘤组织，对其表面抗原的蛋白质进行异构，改变表面抗原的立体构像，制作人体肿瘤特异抗原。对动物进行免疫，借助有强壮体魄的动物作为“生物反应器”，刺激其免疫系统，产生强大的免疫反应，大量生产出能对抗这种特异抗原的抗体，采用被免疫动物的免疫反应高峰期的血制品或奶制品，生产具有特异性的免疫球蛋白和抗肿瘤细胞因子。
本发明的另一个目的，是提供上述抗肿瘤生物制品制备方法。
本发明的技术方案主要包括如下步骤一、制作人体肿瘤组织特异抗原用建株的人体肿瘤组织，或肿瘤病人活检时取下的少量肿瘤组织，进行组织培养，或直接用手术后切除的肿瘤组织，剔除其中央坏死部分，取其外围组织。收集其细胞培养物，以机械方法粉碎瘤块，获取其完整肿瘤细胞。也可取其肿瘤细胞表面膜蛋白抗原，以反复深冻法或超声粉碎法进行细胞破碎，以梯度离心法分离有效成份，用物理方法对其表面抗原的蛋白质进行异构，改变表面抗原的立体构像，制作人体肿瘤组织特异抗原。
二、以人体肿瘤特异抗原对动物进行免疫A、对动物的选择，可以是雄性，也可以是雌性(将来取其乳制品)，被选的动物身体健康，体魄强壮，对免疫有敏感的反应力。
B、人体肿瘤组织特异抗原进行复合，制作复合疫苗，同时扩展分子量，将几种抗原聚合成大分子颗粒，激发巨噬细胞吞噬，增强免疫作用。然后以“复合疫苗-多次免疫疫苗注射法”对动物进行免疫。
C、对动物进行基础免疫。对复合疫苗加进完全佐剂，以油性的佐剂研磨水性的抗原，实现油包水，佐剂本身也是免疫诱出剂，以此方法对奶牛进行基础免疫学处理，此阶段约30-60天。如此阶段基础免疫后的效价检测始终不理想，则认定此动物的个体差异，对免疫反应不敏感，只能淘汰。然后对有正常免疫反应的动物继续进行免疫，可以逐步转入单一肿瘤抗原的正常免疫。
三、对动物免疫的免疫反应高峰期的测定对动物免疫进入正常免疫后，一般采用7-15天为一周期。可以测定一个周期的免疫效价，制作效价曲线，找出高峰期。检测可以采用酶标法(ELISA)，检测其免疫效价OD值也可采用流式细胞检测仪(CELL SORTOR)，比较其巨噬细胞，NK，TK，IL-2等细胞的增减状态；以及其它方法进行检测。
四、制备被免疫动物的免疫反应高峰期产品确定了动物的免疫反应高峰期，可以在反复免疫反应高峰期采用定期放血，取其血清，以现有常规技术分离其有效成份，制成输液制品或口服制品；也可以在免疫反应高峰期采用定期取奶方式，根据需要按比例直接稀释制成口服产品。
使用抗肿瘤生物制品的方法在病人进行治疗的初期，应采用高效价的制品对病人进行治疗。在病情基本稳定后，根据医嘱，应逐步采用增加稀释比例，降低效价，最终在效价与同类食品效价之比稳定在1.2-1.5左右，可供病人长期使用。达到既增加人体免疫功能，巩固治疗效果，又不至于导致反馈抑制人体正常机理，使人体免疫系统产生依赖性，反而降低人体防病抗病能力。
本发明的抗肿瘤生物制品有明显的抗肿瘤作用以Balb/C小白鼠(中英合资LB公司提供)分三组，每组10只，A组普通饮食，B组服食普通牛奶，C组服食免疫高峰期的抗肿瘤免疫牛奶并注射免疫血清。5天后三组同样条件接种7721癌细胞约106只。接种期三组饮食与条件照旧。二周后三组同时解剖，发现A，B组无一例外均生长癌肿，C组中有二只基本没有肿瘤，三只仅有轻微癌变，三只生长癌肿，但大小较A，B组小1/3-1/5左右，只有二只与A，B组结果相似。
以市售1640培养液各加进5-10％正常牛血清与免疫高峰期的牛血清。然后同等条件培养SMMC-7721建株癌细胞(上海第二军医大学提供)，可发现正常牛血清中癌细胞正常分裂成长，而免疫高峰期牛血清中癌细胞对数生长曲线明显减缓本发明的抗肿瘤生物制品与一般免疫制剂，如胎盘球蛋白，人血白蛋白等不同，本制品因为是天然生成的，不是以化学方法或人工方法合成或添加的，因此是相当安全的，其有效成份完整地受到牛奶中其它成份保护，能禁受胃酸与胃蛋白酶的分解，安全经过胃部，在肠部被人体吸收，达到增强人体免疫功能的作用。
本发明以人体的肿瘤组织制作抗原，以动物作替身，设定动物的免疫系统为“生物反应器”，利用动物的强壮体魄与强大的免疫功能，生产的特殊免疫球蛋白与活性细胞因子，有很强的特异性，能有效地锁定肿瘤的起动基因，直接消除了肿瘤生成的病灶，根本改变了肿瘤发展的条件。是一种积极，主动，有效的方法，特别是对手术后抗复发的肿瘤病人，疗效比其它方法更为显著。
本发明方法简便，成本低廉，能为一般患者接受，容易普及推广。
本发明可以是以喝牛奶的方式实现，没有毒副作用，而且富有营养，能增强体质，保证了病人顺利恢复。
实施例(肝癌病人)在无菌条件下完成下列步骤，以制备肿瘤抗原。
取下肝癌病人手术后的肿瘤组织，用剪刀去除坏死组织，用生理盐水洗干净。
在200目的虑网上，用剪刀将肿瘤组织剪碎，在反复剪碎的过程中，不断以少量生理盐水淋洗，收集肿瘤细胞。
将收集到的肿瘤细胞以1000RPM离心，弃上清液。
冰浴，以超声破壁，8000RPM离心，取上清液。
以紫外分光光度计检测蛋白含量，用以下公式计算浓度C(mg/ml)＝1.45×OD280-0.47×OD260加入等量甘油分装，置-20℃备用。
以200-300Ug肿瘤抗原，加适量水杨酸，镁盐，于羊毛脂石腊油中研磨，制成复合疫苗完全佐剂。
于被免疫奶牛之颈部颈锥两边分3-4点皮下注射复合疫苗完全佐剂，隔十天再进行一次，进行3次后休息45天左右，进入正常免疫阶段，直接以肿瘤疫苗100-200Ug注射。每十天一次。
第二次正常免疫后，在一周期内进行峰值检测，可发现峰值期出现在第八，九，十天，总共约为三天。如不出现峰值期，则只好淘汰此牛。
峰值期以酶标法检测，可见明显的显色反应。以流式细胞检测仪检测，可发现巨噬细胞，HK，TK等细胞数量明显增加。
以市售1640培养液各加进5-10％正常牛血清与免疫高峰期的牛血清。然后同等条件培养SMMC-7721建株癌细胞(上海第二军医大学提供)，可发现正常牛血清中癌细胞正常分裂成长，而免疫高峰期牛血清中癌细胞对数生长曲线明显减缓以Balb/C小白鼠(中英合资LB公司提供)分三组，每组10只，A组普通饮食，B组服食普通牛奶，C组服食免疫高峰期的抗肿瘤免疫牛奶并注射免疫血清。5天后三组同样条件接种7721癌细胞约10只。接种期三组饮食与条件照旧。二周后三组同时解剖，发现A、B组无一例外均生长癌种，C组中有二只基本没有肿瘤，三只仅有轻微癌变，三只生长癌肿，但大小较A、B组小1/3-1/5左右，只有二只与A、B组结果相似。
权利要求
1.一种抗肿瘤生物制品，其特征在于该制品是以人体肿瘤组织制作的抗原，对动物进行免疫，利用被免疫动物的免疫反应高峰期的血制品或奶制品，生产具有特异性的免疫球蛋白和抗肿瘤细胞因子。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤生物制品的制备方法，其特征在于该制备方法包括下列步骤一、制作人体肿瘤组织特异抗原用建株的人体肿瘤组织，或肿瘤病人活检时取下的少量肿瘤组织，进行组织培养，或直接用手术后切除的肿瘤组织，剔除其中央坏死部分，取其外围组织，收集其细胞培养物，以机械方法粉碎瘤块，获取其完整肿瘤细胞，也可取其肿瘤细胞表面膜蛋白抗原，以反复深冻法或超声粉碎法进行细胞破碎，以梯度离心法分离有效成份，用物理方法对其表面抗原的蛋白质进行异构，改变表面抗原的立体构像，制作人体肿瘤组织特异抗原；二、以人体肿瘤特异抗原对动物进行免疫A、对动物的选择，可以是雄性，也可以是雌性(将来取其乳制品)，被选的动物身体健康，体魄强壮，对免疫有敏感的反应力；B、人体肿瘤组织特异抗原进行复合，制作复合疫苗，然后以“复合疫苗-多次免疫疫苗注射法”对动物进行免疫C、对动物进行基础免疫，对复合疫苗加进完全佐剂，以油性的佐剂研磨水性的抗原，实现油包水，以此方法对奶牛进行基础免疫学处理，此阶段约30-60天，然后对有正常免疫反应的动物继续进行免疫，可以逐步转入单一肿瘤抗原的正常免疫；三、对动物免疫的免疫反应高峰期的测定对动物免疫进入正常免疫后，一般采用7-15天为一周期。可以测定一个周期的免疫效价，制作效价曲线，找出高峰期。检测可以采用酶标法(ELISA)，检测其免疫效价OD值；也可采用流式细胞检测仪(CELL SORTOR)，比较其巨噬细胞，NK，TK，IL-2等细胞的增减状态；以及其它方法进行检测；四、制备被免疫动物的免疫反应高峰期产品确定了动物的免疫反应高峰期，可以在反复免疫的反应高峰期采用定期放血，取其血清，再分离其有效成份，制成输液制品或口服制品；也可以在免疫反应高峰期采用定期取奶方式，根据需要按比例稀释制成口服产品。
3.根据权利要求1或2所述的抗肿瘤生物制品的制备方法，其特征在于所用的被免疫动物为牛，羊，马，骆驼及灵长类动物。
全文摘要
本发明涉及一种抗肿瘤生物制品,该制品是以人体肿瘤组织制作的抗原,对动物进行免疫,激发其强大的免疫反应,利用动物的强壮体魄,为病人生产具有特殊识别能力的免疫球蛋白和抗肿瘤细胞因子。本发明属于生物技术领域。本发明产品特异性强,疗效显著,对肿瘤防治有积极主动作用,且成本较低,副作用较小。
文档编号A61K45/00GK1261541SQ9812288
公开日2000年8月2日 申请日期1998年12月29日 优先权日1998年12月29日
发明者黄河, 李徵, 孙培南 申请人:黄河