专利名称：使用去乙氧羰基氯雷他定治疗过敏性哮喘和其它疾病的方法和组合物的制作方法
1.发明领域本发明涉及包括施予治疗有效量的被称为去乙氧羰基氯雷他定的氯雷他定代谢衍生物的治疗方法。
2.相关领域氯雷他定是一种H-1组胺受体蛋白拮抗剂。组胺受体分为H-1和H-2两种类型。H-1受体介导的反应被传统抗组胺药拮抗。H-1受体存在于，例如，人和其它哺乳动物的回肠、皮肤和支气管平滑肌。
氯雷他定与其说与中枢H-1受体结合倒不如说优先与外周H-1受体结合。Quercia等，Hosp.Formul.28137-53(1993)。与特非那定相比，已经显示出氯雷他定是一个5-羟色胺-诱导的豚鼠支气管痉挛的更强的抑制剂。同上137-38页。它在动物模型的抗-过敏活性方面表明与特非那定和阿司咪唑相当。同上第138页。然而，使用标准动物模型测试，以毫克比毫克为基准，在抑制过敏性支气管痉挛方面氯雷他定显示出较特非那定强4倍多。同上。而且，通过评价药物抵制人体风团形成能力证实了氯雷他定的抗组胺活性。同上。有效的临床试验说明氯雷他定是一个有效的H-1拮抗剂。见Clissold等，药物(Drugs)3742-57(1989)。
通过H-2受体-介导的反应，组胺刺激哺乳动物胃酸分泌和对离体哺乳动物心房变速作用。氯雷他定对组胺-诱导的胃酸分泌无作用，也不影响组胺对心房的变速作用。因此，氯雷他定对H-2组胺受体没有明显作用。
氯雷他定很易吸收但大部分被代谢。Hilbert等，临床药理学杂志(J.Clin.Pharmacol.)27694-98(1987)。DCL，已经被确定为主要代谢物，据报道具有药理活性。Clissold，药物3742-57(1989)。美国专利4,659,716也报道它具有抗组胺活性。该专利推荐口服剂量范围为5～100mg/天，优选10～20mg/天。
氯雷他定治疗季节性鼻炎的效力与特非那定相当。Quercia等，Hosp.Formul.28137，141(1993)。氯雷他定也较阿司咪唑更快起效，同上。
Clissold等药物3742，50-54(1989)描述了证明氯雷他定用于季节性和常年性鼻炎、感冒(联合假麻黄硷)和荨麻疹有效的研究。它也提示氯雷他定可用于治疗过敏性哮喘。Templ等，前列腺素(Prostaglandins)35549-554(1988)。
氯雷他定也可有效治疗晕车病和眩晕。已经发现一些抗组胺药对预防和治疗晕车病有效。见Wood，Drugs，17471-79(1979)。一些抗组胺药也已被证明可用于治疗前庭失调，如梅尼埃尔氏病，和其它类型的眩晕。见Cohen，等，神经学进展(Archives of Neurolology)，27129-35(1972)。
另外，氯雷他定还可用于治疗糖尿病性视网膜病和其它与糖尿病有关的小血管障碍。用链佐星-诱导的糖尿病大鼠试验，用抗组胺药物治疗可预防视网膜组胺受体的激活，而视网膜组胺受体激活暗示糖尿病性视网膜病发展。抗组胺药治疗视网膜病和糖尿病相关小血管障碍的用途在美国专利5,019,591中公开。
已经提议氯雷他定与联合非甾体类抗炎药或其它非麻醉性镇痛剂联合，将可用于治疗咳嗽、感冒、感冒样和/或流感症状及不适、疼痛、头痛、发热和与此相关的全身不适。
许多抗组胺药引起不良副作用。这些不良副作用包括，但不限于，镇静、胃肠道刺激、口干、便秘或腹泻。与其它抗组胺药相比，已经发现氯雷他定引起相对小的镇静。此外，疲劳、头痛和恶心与在特非那定观测到的相似。见Quercia等，Hosp.Formul.28137，142(1993)。
另外，非镇静性抗组胺类范围内的化合物，包括氯雷他定、阿司咪唑和特非那定，已知可引起其它严重的不良电生理学副作用。这些不良副作用与QT间歇延长有关，包括但不限于心室纤维性颤动与心律失常，如室性心动过速或尖端扭转型心动过速(torsades de pointes)。Knowles，Canadian Journal Hosp.Pharm，4533，37(1992)；Craft，英国医学杂志(British Medical Journal)，292660(1986)；Simons等，柳叶刀(Lancet)，2624(1988)；和Unknown，药物副作用年报(Side Effects of DrugsAnnual)，12142和14135。
Quercia等，Hosp.Formul.28137，142(1993)声明同时接受特非那定和酮康唑或红霉素的“健康”患者据报道有严重的心血管不良副作用，包括尖端扭转型心动过过速和其它室性心动过速。
Quercia等还指出据报道同时施予阿司咪唑和红霉素或红霉素加酮康唑引起心律失常。因此，他告诫不要将氯雷他定与酮康唑、伊曲康唑、及大环内酯类如红霉素同时使用。另外，已知酮康唑和/或红霉素干扰细胞色素P450，故而抑制非镇静抗组胺药如特非那定和阿司咪唑的代谢。由于干扰氯雷他定的代谢，氯雷他定或其它非镇静抗组胺药和已知抑制细胞色素P450药物，例如但不限于酮康唑、伊曲康唑和红霉素之间就存在更大的潜在不良相互作用。
在Brandes等，Cancer Res.(52)3796-3800(1992)中，Brandes证实药物促进体内肿瘤生长的倾向与抑制刀豆球蛋白A刺激淋巴细胞有丝分裂的效力有关。在Brandes等，国家癌症研究杂志(J.Nat’I Cancer Inst)，86(10)771-775(1994)中，Brandes在离体实验中评价氯雷他定以预测体内肿瘤的增长。他发现氯雷他定和阿司咪唑与黑素瘤和纤维肉瘤的生长均相关。该研究中使用的氯雷他定剂量是10mg/天。
因此，特别期望发现具有已知非镇静抗组胺药的优点而没有前面提到的缺点的治疗方法。
3.发明概述本发明提供涉及去乙氧羰基氯雷他定，即，8-氯-6，11-二氢-11-(4-哌啶亚基)-5H-苯并[5，6]环庚三烯并[1，2-b]吡啶(“DCL”)的方法和组合物。该化合物在Quercia等Hosp.Formul，28137-53(1993)和美国专利4,659,716中被特别描述。
一方面，本发明提供一种治疗人过敏性哮喘同时避免伴发与施予非镇静性抗组胺药有关的不良副作用倾向的方法，该方法包括施予人一种组合物，所述组合物包括(i)治疗有效量的DCL或其可药用盐；(ii)治疗有效量的减轻充血剂；和可药用的载体。
本发明也提供一种治疗人过敏性哮喘同时避免伴发与施予非镇静性抗组胺药有关的不良副作用倾向的方法，包括施予人一种组合物，所述组合物包括(i)治疗有效量的DCL或其可药用盐；(ii)一种选自5-脂氧合酶抑制剂、5-脂氧合酶激活蛋白拮抗剂和白三烯D4拮抗剂的白三烯抑制剂；及可药用的载体。
本发明还涉及治疗过敏性哮喘同时避免伴发与施予非镇静性抗组胺药有关的不良副作用倾向的方法，包括施予人治疗有效量的DCL和治疗有效量的减充血剂。
另外，本发明提供一种治疗过敏性哮喘同时避免伴发与施予非镇静性抗组胺药有关的不良副作用倾向的方法，包括施予人治疗有效量的DCL和治疗有效量的白三烯抑制剂。
本发明也提供一种治疗皮炎同时避免伴发与施予非镇静性抗组胺药有关的不良副作用倾向的方法，包括施予人治疗有效量的DCL或其可药用盐。
4.发明详述本发明包括治疗人过敏性哮喘同时避免伴发与施予非镇静性抗组胺药有关的不良副作用倾向的方法，包括施予人一种组合物，所述组合物包括(i)治疗有效量的DCL或其可药用盐；(ii)治疗有效量的减充血剂；及可药用载体。在治过敏性哮喘的方法中DCL和减血管充血剂也可分开施予。例如，DCL和减充血剂可同时或顺次给予，即，DCL和减充血剂联合给药时既可同时给予也可按DCL和减充血剂的顺序给予或按减充血剂和DCL的顺序给予。
因此，本发明也包括治疗人过敏性哮喘同时避免伴发与施予非镇静性抗组胺药有关的不良副作用倾向的方法，包括施予人治疗有效量的DCL和治疗有效量的减充血剂。
本发明也涉及治疗人过敏性哮喘同时避免伴发与施予非镇静性抗组胺药有关的不良副作用倾向的方法，包括施予人一种组合物，所述组合物包括(i)治疗有效量的DCL或其可药用盐；(ii)治疗有效量的选自5-脂氧合酶(“5-LO”)抑制剂、5-脂氧合酶激活蛋白(“FLAP”)拮抗剂和白三烯D4(“LTD4”)拮抗剂的白三烯抑制剂；及可药用载体。在本发明治疗过敏性哮喘的方法中DCL和白三烯抑制剂即可同时也可顺次给予，即，DCL和白三烯抑制剂可以联合给予，同时但分另给予，或者按DCL和白三烯抑制剂的顺序给予或按白三烯抑制剂和DCL的顺序给予。
因此，本发明包括治疗人过敏性哮喘同时避免伴发与施予非镇静性抗组胺药有关的不良副作用倾向的方法，包括施予人治疗有效量的DCL和治疗有效量的白三烯抑制剂。
另一方面，本发明包括治疗皮炎同时避免伴发与施予非镇静性抗组胺药有关的不良副作用倾向的方法，包括施予人治疗有效量的DCL或其可药用盐。
本发明的方法可避免的副作用包括但不限于，心律失常和促进肿瘤生长。已经发现当DCL与抑制细胞色素P450的药物包括但不限于酮康唑、伊曲康唑、红霉素和本领域熟知的其它药物联合时，药物-药物相互作用较氯雷他定或其它非镇静性抗组胺药与所述药物同时给予时的相互作用小。所以，上面介绍的本发明方法特别适于治疗具有较正常更高发生癌症可能性的/或同时避免与抑制细胞色素P450药物相互作用的人过敏性疾病如皮炎和哮喘。
本发明也包括上述方法所使用的新的组合物。
已经发现DCL较氯雷他定对组胺受体作用至少强约20倍。因此，这里描述的给药方式的剂量范围和本发明方法使用的剂量范围是约0.1～小于约10mg每天。该剂量范围显著低于其它非镇静性抗组胺药的推荐剂量范围，包括氯雷他定，其推荐口服剂量为5～100mg每天。然而，由于显著少的副作用，DCL可按较氯雷他定治疗建议的更高剂量给予从而较氯雷他定提供改进的治疗范围。
氯雷他定和其它非镇静性抗组胺药具有抗组胺活性并可治疗和减轻与过敏性鼻炎和其它过敏性疾病、糖尿病和其它状况有关的各种状况和疾病的症状；然而，此类药物，尽管提供预期疗效，但却引起不良副作用。使用DCL导致更清晰的剂量-相关的疗效界定、减少的不良副作用和相应地，提高的治疗指数。因而，与使用氯雷他定或其它非镇静性抗组胺药相比，使用DCL更为有利。
术语“副作用”包括，但不限于促进肿瘤生长、心律失常、心脏传导障碍、刺激食欲、增加体重、镇静、胃肠道不适、头痛、口干、便秘和腹泻。术语“心律失常”包括，但不限于室性心动过速、尖端扭转型心动过速和室性纤维颤动。
短语“治疗有效量”指在治疗或控制过敏性疾病如荨麻疹、过敏性鼻炎、症状性皮肤划痕现象、皮炎、过敏性哮喘、与糖尿病有关的视网膜病或其它小血管障碍、及与过敏性鼻炎有关的症状如咳嗽、感冒、感冒-样、和/或流感症状，包括但不限于喷嚏、流涕、流泪和皮肤刺激中提供的有益于治疗的DCL的量。
术语“过敏性哮喘”定义为以气管和支气管对导致包括哮鸣、咳嗽和呼吸困难症状的各种刺激增高的强烈反应为特征的疾病。
术语“皮炎”是由皮肤发炎包括内源性和接触性皮炎例如，但不限于光化性皮炎(光照性皮炎)、特应性皮炎、化学性皮炎、化妆品性皮炎、夏令皮炎和脂溢性皮炎引起的疾病。
术语“白三烯抑制剂”包括任何抑制、遏制、阻碍白三烯的作用或活性或与其相互作用的药物或化合物，例如，但不限于，5-脂氧合酶(“5-LO”)抑制剂、5-脂氧合酶激活蛋白(“FLAP”)拮抗剂和白三烯D4(“LTD4”)拮抗剂。
术语“5-脂氧合酶抑制剂”或“5-LO抑制剂”包括任何抑制、遏制、阻碍5-脂氧合酶酶活性或与其相互作用的药物或化合物，例如，但不限于，弃白通、多西苯醌、吡前列素和ICI-D2318。
术语“5-脂氧合酶激活蛋白拮抗剂”或“FLAP拮抗剂”包括任何抑制、遏制、阻碍5-脂氧合酶激活蛋白的作用或活性或与其相互作用的药物或化合物，例如，但不限于MK-591和MK-886。
术语“白三烯D4拮抗剂”或“LTD4拮抗剂”包括任何抑制、遏制、阻碍5-脂氧合酶激活蛋白的作用或活性或与其相互作用的药物或化合物，例如，但不限于zarfirlukast(ICI-204219)。
在急性或慢性控制过敏性疾病或状态中，DCL预防或治疗剂量的大小将依被治疗状况的严重程度和给药途径而不同。剂量，和可能的剂量频率，也将依据病人个体的年龄、体重和反应而不同。总体上，对这里所描述的状况而言，DCL每日总剂量范围是约0.1mg～小于约10mg按单次或分次口服，通常是经皮或局部吸入。例如，优选的每日口服剂量范围是约0.1mg～约5mg。更优选每日口服剂量范围约02mg～约1mg。减充血剂如假麻黄碱优选的每日口服剂量范围应是约50mg～约300mg，更优选约150mg～约250mg。此外，白三烯抑制剂的适宜每日口服剂量可由本领域技术人员方便地决定。
进一步推荐儿童、年龄超过65岁和其它肝、肾功能障碍的病人开始接受低剂量，然后根据个体反应或血液水平滴定。对本领域技术人员来说，显然有时使用此剂量范围之外的剂量是必要的。再者，临床医师或治疗医师将懂得如何和何时结合病人反应来调整、中断、或终止治疗。
术语“治疗有效量的DCL或其可药用盐”包括在上面描述的剂量用量之内。另外，术语“所述组合物包括(i)治疗有效量的DCL或其可药用盐；(ii)治疗有效量减充血剂”；和“所述组合物包括(i)治疗有效量的DCL或其可药用盐；(ii)治疗有效量的白三烯抑制剂”也包括在上面描述的剂量用量和剂量频率表之内。
可使用任何适宜的给药途径以根据本发明方法提供给患者有效量的DCL。例如，可使用口服、口内、直肠、非肠道、表皮、经皮、皮下、肌内、鼻内、舌下、硬膜内、眼内、呼吸道内、口或鼻腔吸入和类似的给药方式。对于治疗皮炎的方法而言，优选局部给药。
本发明方法使用的药物组合物包含作为活性成分的DCL或其可药用盐，和并可包含可药用载体，和任选地，其它治疗组分；所述DCL是氯雷他定的代谢产物。
术语“可药用盐”指由药学上可接受的无-毒酸或碱包括无机酸或碱或有机酸或碱制备的盐。此类无机酸的例子有盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸和磷酸。适宜的有机酸可选自，例如，脂肪酸、芳香族酸、羧酸和有机磺酸，所述有机酸的例子是甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡萄糖醛酸、马来酸、糠酸、谷氨酸、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、水杨酸、苯乙酸、杏仁酸、扑酸(双羟萘酸)、甲磺酸、乙磺酸、泛酸、苯磺酸、硬脂酸、对氨基苯磺酸、藻酸和半乳糖醛酸。此类无机碱的例子包括铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌形成的金属盐。适宜的有机碱可选自，例如，N，N-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆硷、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲葡糖胺)、赖氨酸和普鲁卡因。
本发明方法使用的组合物可包括适宜的赋型剂或载体如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。
剂型包括片剂、锭剂、分散剂、混悬剂、溶液、胶囊、贴剂、糖浆剂、酏剂、凝胶、散剂、乳浆剂、糖锭、软膏、霜、泥膏剂、硬膏剂、洗剂、盘、栓剂、鼻或口腔喷雾、气溶胶等等。
因为给药容易，片剂和胶囊代表最具优势的口服剂型，其中使用固体药物载体。如果需要，片剂可用标准的水性和非水性技术进行包衣。
除上面所列举的普通剂型外，本发明方法使用的化合物也可通过控释方式和/或如在美国专利3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123和4,008,719描述的释放装置给予，这些公开专利在这里引入参照。
本发明方法使用的药物组合物可由任何药学方法制备，但所有方法均包括将活性成分与由一种或多种必要组分组成的载体结合的步骤。总之，该组合物制备经过将活性成分与液体载体或微细地分开的固体载体或两者进行均匀而紧密地混合，然后，如果必要，将产品制成所需的外观。
例如，片剂可经过压制或模塑。任选地，与一种或多种助剂而制备。压片可通过在一个适宜机械中将自由流动形式如粉或粒的活性成分压紧而制备，所述活性成分可任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂混合。模塑片剂可通过在一个适宜机械中将润湿的粉状化合物与惰性液体稀释剂的混合物进行模塑而制备。最好每片含约0.1mg～小于约10mg活性成分，每个扁囊剂或胶囊含约0.1mg～小于约10mg的DCL。
通过参考下面详细描述的本发明方法使用的化合物和组合物的制备，以及它们的用途的实施例，来进一步定义本发明。对于本领域技术人员，在本发明范围内进行许多更改，包括原料和方法，是显然的。
5.实施例5.1实施例1氯雷他定和其代谢物的制备氯雷他定可通过美国专利4,282,233公开的方法合成。使用本领域惯用的反应步骤，如在此引入参考的在美国专利4,659,716中描述的全部内容，相似地制备代谢物。制备DCL的一种普通方法是如下面阐述的在氢氧化钠和乙醇存在时回流氯雷他定。
NaOH，EtOH回流氯雷他定 DCL从市售氯雷他定片剂(600×10mg)中提取将氯雷他定片剂用水和氯仿稀释。搅拌混合物，然后经硅藻土过滤，用氯仿漂洗直至滤液中不含氯雷他定。分出的水层用氯仿萃取两次。合并的有机层用水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥。蒸发溶剂得到纯的氯雷他定白色固体。氯雷他定的皂化氯雷他定(4.0g)加入到280ml纯的乙醇氢氧化钠(5.9g)溶液中，搅拌混合物回流4天。冷却和浓缩混合物以除去乙醇。用水稀释残余物并用二氯甲烷萃取水层5次。合并的有机层用水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥。蒸发溶剂得到2.82g(87％)纯的氯雷他定衍生物(或代谢物)谈-黄褐色固体。
5.2实施例2抗组胺活性在用组胺收缩的离体豚鼠回肠上比较氯雷他定和DCL的抗组胺活性。该标本通常被本领域技术人员作为断定对外周组胺H-1受体的效力而使用。方法试验在取自雄性豚鼠(Hartley品系，419-560克；Ellm Hill Breeding Laboratories，Chelmsford，MA)的回肠段上进行。该组织悬挂于盛有40ml通着95％氧气和5％二氧化碳的35℃台罗德氏溶液的组织槽内。台罗德氏溶液含有(用mM表表)137NaCl、2.7KCl、2.2CaCl2、0.025MgCl2、0.4NaHPO4、11.9NaHCO3和5.5葡萄糖。通过等张换能器用墨水描计多种波动描记器(Model 7，Grass Instrument Company，Quincy，MA)记录对组胺的收缩反应。在所有时间所有组织保持1克的张力。
每个试验中将取自一个动物的3或4段回肠悬挂于独立的组织槽内，加入任何药物之前用浴液平衡1小时。在4个预试验中，组织暴露于浓度为1×10-7、1×10-6和1×10-5的组胺，1×10-6摩尔/升的组胺在对数-浓度-效应曲线的线性部分产生最强收缩，故在所有进一步的试验中选用此组胺浓度。
为测定氯雷他定和DCL的抗组胺作用，按15分钟的间隔将组织短暂(约15秒)暴露于1×10-6摩尔/升的组胺中。在两次连续暴露于组胺产生大致相同大小的收缩后，氯雷他定或DCL，以相差3-或10-倍的终浓度，加入除一个之外的所有组织槽中，该未处理组织作为未处理对照组织。每次药物处理的组织暴露于组胺之后，组织槽中的液体换为不含组胺但含有同样浓度同样药物的液体。在暴露于药物5、20、35、50、65、80、95、110和125分钟时或对照组织在可比时间时进行组胺刺激。
继后对每个试验结果的分析涉及(i)所有收缩用最后predug收缩百分比表示而将得自每个固有收缩性不同组织的数据标准化处理，(ii)用占未处理组织的对应百分比表示在药物-暴露期间记录的收缩性而将可能的时间-相关的收缩性变化的数据标准化处理，及最后(iii)计算药物-相关的每次收缩下降百分比。
然后将药物浓度和相应组胺-反应百分比降低的成套数据结果用于评价每个试验药物浓度，从而得到对组胺反应降低50％的药物浓度，即IC50。使用最小二乘方法将数据拟合直线并从直线方程式中计算出IC50。计算每个药物的试验均值+/-标准差值，和使用克鲁斯凯-沃利斯1-法秩和方差分析检验药物之间的差异。
下面两个表显示结果一览表。离体豚鼠回肠暴露于每种药物的不同浓度中125分钟产生的组胺-诱导收缩下降百分比陈列如下
表1—组胺-诱导的豚鼠回肠收缩的下降(百分比)药物 试验编号 药物浓度(摩尔/升)3×10-101×10-93×10-91×10-83×10-81×10-7氯雷他定 1 - 19.05-13.33-88.572 - --8.32 54.4298.663 - --39.6444.6893.384 - --55.8645.8386.46DCL 111.93 73.12238.91 38.8156.71340.00 62.6976.21435.43 44.1376.43表2—组胺-诱导的豚鼠回肠收缩的下降(IC50)药物 试验 IC50(M)氯雷他定 1 1.90×10-82 2.21×10-83 2.10×10-84 1.22×10-8均值 1.86×10-8SE. 0.22DCL1 6.36×10-102 19.2×10-103 5.26×10-104 8.66×10-10均值 9.75×10-8S.E. 3.20注解药物-诱导的IC50值具有统计学显著性差异(P＝0.0209)。
这些结果表明DCL对组按受体的作用大约较氯雷他定强20倍。
5.3实施例3受体结合研究进行了氯雷他定和DCL对组胺H-1受体结合亲和力的受体结合研究。
Dini等描述的方法在此引入参考(Agents and Actions，33181-184，1991)，用于结合研究。豚鼠小脑膜与0.5nM 3H-吡拉明在25℃孵育10分钟。孵育后，样本迅速在真空状态下经GF/B玻璃纤维滤器(Whatman)过滤并使用Brandel细胞收集器用冰冷缓冲液冲洗数次。使用液闪合剂(Formula 989，DuPont NEN)在液闪计数器(LS6000，Beckman)上测定结合放射活性。
测定了试验化合物和吡拉明对H-1受体的IC50值表3—对吡拉明与H-1受体结合的抑制H-1受体化合物 IC50(nM)氯雷他定 721 (1.55)DCL 51.1 (1.12)吡拉明 1.4 (0.98)如上所示，发现DCL对组胺H-1受体的亲和力是氯雷他定的14倍。这些结果与证明DCL较氯雷他定对抑制组胺-诱导的豚鼠回肠收缩具有更强效力的发现相一致。
这些研究证实DCL较氯雷他定对组胺受体具有更强的效力。
5.4实施例4促进肿瘤生长活性抑制淋巴细胞有丝分裂被用于筛选氯雷他定和DCL作为肿廇促进剂的效力。有丝分裂研究取自5-周大BALB/c小鼠(Charles River，ST.Constant，PQ)的新鲜脾细胞(5×105)用含2％胎儿小牛血清(Grand Island Biological Co.，Grand Island，YN)的RPMI 1640介质悬浮接种于复制式微孔板(Nunc)，向微孔板中加入刀豆球蛋白(Con)A(2μg/ml；Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)并在不含或含有递增浓度的溶于盐水或其它载体的试验药物的条件下孵育(37℃，95％空气，5％二氧化碳)。加入ConA后43小时，向每个微孔中加入0.25nmol的3H-胸腺嘧啶核苷(6.7Ci/nmol；ICNRadiopharmaceuticals，Montreal，PQ)。再孵育5小时，使用一个自动细胞分类器将微孔中的细胞洗到过滤纸上。将过滤纸置于含5ml闪烁液(Readysafe；Beckman)的小瓶中，测定48小时整合到DNA中的放射活性(n＝3)。在宽的浓度范围内(0.1～10μM)测定抑制有丝分裂的IC50值。
表4—对刀豆球蛋白A诱导的淋巴细胞刺激作用的抑制(IC50)氯雷他定1.0μMDCL 5.6μM结果表明DCL在促进肿瘤生长方面的活性较氯雷他定小5-7倍。
5.5实施例5心血管作用研究了DCL对心脏钾离子流的影响。方法使用酶分散技术分离豚鼠和兔的单个心室肌细胞(见Carmeliet等，J.Pharmacol.Exper.Ther，1992.262.809-817，在此将其全部内容引入参考)。电阻为2～5MΩ的单个吸力贴片电极用于电压钳(AxoClamp 200A)。P-钳软件系统(Axon Instruments)用于启动电压-钳程序并记录与分析数据。标准液含NaCl137.6mM，KCl5.4mM，CaCl21.8mM，MgCl20.5mM，HEPES 11.6mM和葡萄糖5mM，并加入NaOH将pH调整为7.4。细胞内液含KCl120mM，MgCl26mM，CaCl20.154mM，Na2ATP5mM，EGTA5mM，和HEPES 10mM，加入KOH将pH调整为7.2。对兔心室肌细胞迟缓性整流K+电流(IK)的作用电压钳方案由在4秒的期间保持-50mV～+10mV电势的钳构成。测定尾电流的变化作为药物浓度的函数。在10-7M～10-5M范围内浓度呈5个阶梯变化。于每个浓度的暴露持续15分钟。结束时，进行30分钟冲刷。对豚鼠肌细胞内向整合电流的作用应用始于-50mM的斜线电压钳和以10mV/秒速度使膜超极化到-120mV来测定内向整合电流。起始浓度是在前试验测定的50％有效浓度。如果起始浓度无效则使用更高浓度。对豚鼠心室肌细胞IKs的作用去极化钳在电压-30mV和-60mV之间持续2秒测定尾电流；保持电压-50mV。
这些研究结果表明DCL在抑制心脏迟发整合电流方面弱于特非那定因而没有潜在的心脏副作用。所以，本发明方法较使用其它非镇静性抗胺药的方法具有较小的毒性。
5.6实施例6抑制细胞色素P450该研究用于测定氯雷他定和DCL对人细胞色素P4503A4(CYP3A4)抑制的程度。CYP3A4涉及许多药物-药物相互作用，定量氯雷他定或DCL对CYP3A4的抑制作用说明潜在的药物-药物相互作用。使用睾酮模型底物和cDNA-起源的CYP3A4在由指定为h3A4V3的人成淋巴细胞(lymphoblastoid)株系制备的微粒体测定抑制作用。研究设计抑制研究由测定试验药物50％抑制浓度(IC50)构成。单一的睾酮浓度(120μM，大约是表现Km的2倍)和10个试验药物浓度，按大约1/2log分开，进行平行试验。通过产生的6(β)-羟睾酮代谢物分析睾酮代谢。使用HPLC吸光度检测分离可方便地定量该代谢物。存储/制备试验物质和加入孵育试验物质在室温储存。为了添加到孵育中将试验物质溶于乙醇。对于试验物质的所有浓度，溶剂浓度保持恒定。IC50测定终试验物质浓度是100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003和0μM。按照下面的方法每个试验浓度进行平行孵育测定方法将含有0.7mg/ml蛋白质、1.3mMNADP+、3.3mM葡萄糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、3.3mM氯化镁和用100mM磷酸钾(pH7.4)配制的120μM睾酮的0.5ml反应混合物在37℃孵育30分钟。加入已知量的11(β)-羟睾酮作为内标来校正萃取过程的回收率。用1ml二氯甲烷萃取反应混合物。萃取液通过无水硫酸镁干燥并在真空下蒸发。样本溶于甲醇注射进4.6×250mm 5μC18HPLC柱中并在50℃分离，所用流动相是流速为每分1ml的甲醇/水。6(β)-羟睾酮、11(β)-羟睾酮和睾酮的保留时间分别大约为6分钟、8分钟和12分钟。在254nm的吸收度检测产物和内标并通过11(β)-羟睾酮吸收峰与内标6(β)-羟睾酮标准曲线的吸收度相比校正萃取效率从而进行定量。数据报告对每一试验物质，测定了每一个平行孵育的6(β)-羟睾酮代谢物浓度并计算了相对于溶剂对照的抑制百分比。用线性插值法计算出IC50。
本发明方法使用的化合物的适宜给药剂型例举如下5.7实施例7胶囊通过填充标准的上下两节的硬明胶胶囊制备了大量的胶囊粒，每粒胶囊含0.1～10毫克粉状活性成分、150毫克乳糖、50毫克纤维素和6毫克硬脂酸镁。
5.8实施例8软明胶胶囊制备在可消化油如豆油、卵磷脂、棉籽油或橄榄油中的活性成分混合物并通过容积泵注入明胶形成含有0.1～10毫克活性成分的软胶囊。冲洗并干燥胶囊。
5.9实施例9片剂用传统工艺制备大量片剂使得剂量单位含0.1～10毫克活性成分、0.2毫克胶态二氧化硅、5毫克硬脂酸镁、275毫克微晶纤维素、11毫克淀粉和98.8毫克乳糖。可应用适宜的包衣以增加适口性或延迟吸收。
除了在这里显示和描述的之外，本领域技术人员从前面描述中进行多种更改是显然的。这种更改也落入本发明权利要求范围之内。
前面的公开包括了注定能够使本领域技术人员实现要求权利的发明的所有信息。由于引证专利或出版物可提供进一步有益的信息，所以这些引证资料在此将其全部引入参考。
权利要求
1.治疗人过敏性哮喘同时避免伴发与施予非镇静性抗组胺药有关的不良副作用倾向的方法，包括施予人一种组合物，所述组合物包括(i)治疗有效量的DCL或其可药用盐；(ii)治疗有效量的减轻充血剂；和可药用载体。
2.治疗人过敏性哮喘同时避免伴发与施予非镇静性抗组胺药有关的不良副作用倾向的方法，包括施予人一种组合物，所述组合物包括(i)治疗有效量的DCL或其可药用盐；(ii)治疗有效量的选自5-脂氧合酶抑制剂、5-脂氧合酶激活蛋白拮抗剂和白三烯D4拮抗剂白三烯抑制剂；及可药用载体。
3.治疗人皮炎同时避免伴发与施予非镇静性抗组胺药有关的不良副作用倾向的方法，包括施予人治疗有效量的DCL或其可药用盐。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中，所述不良副作用是心率失常或促进肿瘤生长。
5.根据权利要求1、2或3所述个方法，其中，所述的人具有较正常更高的发生肿瘤的倾向。
6.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中，避免了与可抑制细胞色素P450的药物之间的相互作用。
7.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中DCL给药量是约0.1mg～小于约10mg每天。
8.根据权利要求7所述的方法，其中DCL给药量是约0.1mg～约5mg每天。
9.根据权利要求1所述分方法，其中DCL给药量是约0.1mg～小于约10mg每天，减充血剂的量是约50mg～约300mg每天。
10.一种治疗人过敏性哮喘同时避免伴发与施予非镇静性抗组胺药有关的不良副作用倾向的方法，包括施予人治疗有效量的DCL和治疗有效量的减轻充血剂。
11.治疗人过敏性哮喘同时避免伴发与施予非镇静性抗组胺药有关的不良副作用倾向的方法，包括施予人治疗有效量的DCL和治疗有效量的白三烯抑制剂。
12.一种药物组合物，包括约0.1mg～小于约10mg DCL和约50mg～约300mg减充血剂。
13.一种药物组合物，包括治疗有效量的DCL和治疗有效量的选自5-脂氧合酶抑制剂、5-脂氧合酶激活蛋白拮抗剂和白三烯D4拮抗剂的白三烯抑制剂。
14.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中，组合物以鼻腔或口腔喷雾施予。
15.根据权利要求10所述的方法，其中，DCL以鼻腔或口腔喷雾施予。
16.权利要求11所述的方法，其中，DCL以鼻腔或口腔喷雾施予。
全文摘要
本发明公开了使用去乙氧羰基氯雷他定(“DCL”)治疗过敏性疾病同时避免伴发其它非镇静性抗组胺药相关的不良副作用倾向的方法。本发明还包括使用DCL和减充血剂或白三烯抑制剂治疗过敏性哮喘同时避免伴发其它非镇静性抗组胺药相关的不良副作用倾向的方法。本发明还包括鼻腔或口腔喷雾施予DCL。
文档编号A61K31/445GK1246793SQ98802439
公开日2000年3月8日 申请日期1998年2月10日 优先权日1997年2月11日
发明者D·A·汉德莱, P·D·鲁宾 申请人:塞普拉科有限公司