专利名称：肝硬化的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及肝硬化的治疗，特别是用喹唑啉酮衍生物如卤夫酮治疗肝硬化。
肝硬化的原因有许多，包括由慢性酒精中毒，营养失调，血色素沉着，被动充血，高胆固醇血，接触了毒药或毒素如铅，接触药物，免疫反应，遗传决定的对某些物质的敏感性，如可在肝豆状核变性中见到的对铜敏感，以及传染病如病毒性肝炎、梅毒和各种寄生虫感染，包括但不限于曼氏血吸虫病和日本血吸虫病导致的肝纤维变性。出于下文中更详细给出的理由，该病目前是不能治愈的，且常常致死。
肝硬化发病要经过许多阶段。首先，看到有各种脂肪变化的肝扩大。其次，明显的纤维变性伴随肝功能明显降低。最后，肝开始萎缩，同时肝的大小和功能相应减小。肝的坏死在任何阶段都可见到，但在晚期硬化中尤为显著。通过显微镜观察，晚期硬化时，肝的正常结构明显完全破裂。
当肝硬化进一步发展时，除了肝以外，还出现其他明显的病理学变化。当肝中形成纤维变性组织时，门脉循环减少，进一步减少了肝的功能。这种循环减少导致侧支静脉循环增加，特别是在食管中。这些食管血管会破裂，引起严重出血。因此，尽管根本原因可发现是肝自身的特异性病理学变化，但肝硬化是一个影响不只限于肝的整体病理学过程。
肝硬化发病中的一个必然步骤是在肝中形成纤维变性组织。肝纤维变性是多数慢性肝病的特征，而并不仅仅是肝硬化的特征〔S.L.Friedan，《新英格兰医学杂志》3281828-35，1993〕。在肝纤维变性中，结缔组织在肝中积聚，代替了正常的肝主质，并降低了肝功能。在病理学过程中，该纤维变性组织取代了更复杂的正常肝组织，使得可用于正常功能、如去除血液中的毒性物质的肝组织数量减少，逐渐中断了肝内血流。肝中形成纤维变性组织的特征在于异常大量的胞外基质成分的沉积，包括至少五种类型的胶原，特别是I型、III型和IV型胶原，以及其他基质蛋白〔L.Ala-Kokko，《生物化学杂志》24475-9，1987〕。
胶原的合成还涉及许多其他病理学情形。例如，与原发性纤维变性或继发性纤维变性有关的临床情形和疾病，诸如全身性硬化症，移植物抗宿主疾病(GVHD)，肺纤维变性和大量自身免疫疾病，它们的区别特征是结缔组织过度产生，从而导致了正常组织结构和功能的破坏。这些疾病可以恰当地解释为扰乱了细胞功能，其主要表现是过度胶原合成和沉积。胶原在纤维变性中的决定性作用已激励了开发抑制其蓄积的药物的尝试〔K.T.Kivirikko，《医学纪事》第25卷，113-126页(1993)〕。
这些药物可通过调节前胶原多肽链的合成、或通过抑制特异性翻译后事件而起作用，由此减少胞外胶原纤维的形成或导致性能改变的纤维的蓄积。不幸的是，虽然此蛋白质在维持组织完整性中很重要，并且和多种疾病密切相关，但只有少数胶原合成抑制剂是可得到的。
例如，细胞毒性药物已尝试用于减慢产生胶原的成纤维细胞的增殖〔J.A.Casas等，Ann.Rhem.Dis.，46763，1987〕，诸如秋水仙碱，它减缓了胶原向胞外基质中的分泌〔D.Kershenobich等人，《新英格兰医学杂志》352652，1992〕。
不幸的是，这些抑制剂中没有一种是胶原型特异性的。而且，存在与干扰其他重要胶原分子，如经典补体途径中的Clq、神经肌肉接头终板的乙酰胆碱酯酶、胶固素和肝表面活性剂脱辅蛋白质等的生物合成的毒性后果有关的严重忧虑。
可抑制胶原合成的其他药物，如硝苯地平和苯妥英，也抑制其他蛋白质的合成，从而非特异性阻断了胶原的生物合成途径〔T.Salo等，《口腔病理学医学杂志》19404，1990〕。
胶原的交联抑制剂，如β-氨基-丙腈，尽管可用作抗纤维变性药，但也是非特异性的。它们长期使用会引起山黧豆中毒综合征和干扰弹性发生(elastogenesis)，因为另一种纤维性结缔组织蛋白质-弹性蛋白也是交联的。另外，胶原的交联抑制作用是继发性的，且胶原的过度产生不得不在其被胶原酶降解之前发生。因此，明显需要作为抗纤维变性药的胶原自身合成的特异型抑制剂。
美国专利5,449,678中公开了用于治疗纤维变性疾病的这种特异型胶原合成抑制剂。该特异性抑制剂是一种与药学有效量的、下式表示的药学活性化合物形成的组合物
其中R1是氢、卤素、硝基、苯并、低级烷基、苯基或低级烷氧基；R2是羟基、乙酰氧基或低级烷氧基；而R3是氢或低级链烯氧基-羰基，也包括其药学上可接受的盐。在这组化合物中，已发现卤夫酮对于这种治疗是尤为有效的。
美国专利5,449,678中公开了这些化合物在纤维变性疾病如硬皮病和GVHD的治疗中是有效的。PCT申请WO 96/06616进一步公开了这些化合物可有效地治疗再狭窄。前两种疾病与胶原的过度沉积有关，它们可以用卤夫酮抑制。再狭窄的特征在于血管损伤后，平滑肌细胞增殖，胞外基质在受影响的血管腔中蓄积〔Choi等，《外科学文献》130257-261，1995；美国专利5,449,678〕。
但是，卤夫酮的体外作用并不总是预示其体内作用。例如，如美国专利5,449,678中所证明，卤夫酮在体外抑制I型胶原在骨软骨细胞中的合成。然而，未报道用卤夫酮治疗的鸡的骨断裂率增加，这表明在体内未见到该作用。因此，卤夫酮在体内的确切行为不能总是从体外研究得到正确的预言。
另外，还未证明卤夫酮或其他相关喹唑啉酮有阻断或抑制与肝硬化有关的病理学过程的能力。已测试了其他胶原合成、交联和沉积抑制剂，如皮质类固醇、青霉胺、甲氨蝶呤和秋水仙碱，对肝纤维变性的治疗作用，但未证明它们是有效的〔S.L.Friedman，《新英格兰医学杂志》3281828-35，1993〕。尽管已显示卤夫酮对I型胶原合成具有特异性抑制作用，但这种抑制尚未显示在肝硬化的治疗中是有效的。的确，肝硬化的死亡率很高，而目前可得到的治疗方法有显著的副作用，且一般没能有效地减慢或终止硬化的进一步发展。此外，在肝纤维变性的发病过程中，沉积了许多其他类型的胞外基质成分，包括至少五种类型的胶原，特别是I、III和IV型胶原，以及其他基质蛋白〔L.Ala-Kokko，《生物化学杂志》24475-9，1987〕。因此，仅抑制I型胶原合成不一定能减慢或终止肝纤维变性的发展。
因此，简单地给予已显示能在体外抑制胶原合成、沉积和交联的化合物来试图治疗肝硬化是无效的。很明显，对于这种不能治愈的疾病，需要的是能特异性减慢或终止体内肝纤维变性的发病且没有非特异性或毒性副作用的新治疗方法。
因此，现已广泛意识到需要治疗肝硬化和纤维变性的方法，并且这将是非常有益的，该方法应实质上抑制体内纤维发生，而没有不期望的非特异性或毒性副作用。
出乎意料地，如下文中实施例所述，现已发现卤夫酮也可抑制体内肝纤维变性的病理生理学过程，可能是通过抑制I型胶原合成实现的，但也可能是另一种或几种机理起作用。当设想I型胶原合成的抑制为似乎合理的机理时，并不期望仅限于这种单一机理，而且也是不必要的，因为下文所列的体内数据清楚地证明了卤夫酮作为体内肝纤维变性抑制剂的效能。
按照本发明的教导提供了一种治疗肝硬化的组合物，包括药学有效量的化合物与药学上可接受的载体结合，该化合物是下式表示的化合物中的一员
其中R1是氢、卤素、硝基、苯并、低级烷基、苯基或低级烷氧基；R2是羟基、乙酰氧基或低级烷氧基；R3是氢或低级链烯氧基。还包括其药学上可接受的盐。
按照本发明的另一个优选实施方案，该化合物优选为卤夫酮。在下文中，术语“卤夫酮”定义为下式表示的化合物
及其药学上可接受的盐。该组合物优选包括该化合物的药学上可接受的载体。
按照本发明的另一个实施方案，它提供了用于治疗肝硬化的药剂的制备方法，包括将药学有效量的化合物置于药学上可接受的载体中的步骤，该化合物为下式表示的化合物中的一员
其中R1是氢、卤素、硝基、苯并、低级烷基、苯基或低级烷氧基；R2是羟基、乙酰氧基或低级烷氧基；R3是氢或低级链烯氧基-羰基。还包括其药学上可接受的盐。
按照本发明的另一个实施方案，它提供了治疗主体肝硬化的方法，包括给予药学有效量的下式表示的化合物的步骤
其中R1是氢、卤素、硝基、苯并、低级烷基、苯基或低级烷氧基；R2是羟基、乙酰氧基或低级烷氧基；R3是氢或低级链烯氧基-羰基。还包括其药学上可接受的盐。
按照本发明的另一个实施方案，它提供了用于实质上预防肝硬化发生的组合物，包括药学有效量的化合物与药学上可接受的载体结合，该化合物是下式表示的化合物中的一员
其中R1是氢、卤素、硝基、苯并、低级烷基、苯基或低级烷氧基；R2是羟基、乙酰氧基或低级烷氧基；R3是氢或低级链烯氧基。还包括其药学上可接受的盐。
按照本发明的另一个实施方案，它提供了用于实质上预防肝硬化发生的药剂的制备方法，包括将药学有效量的化合物置于药学上可接受的载体中的步骤，该化合物为下式表示的化合物中的一员
其中R1是氢、卤素、硝基、苯并、低级烷基、苯基或低级烷氧基；R2是羟基、乙酰氧基或低级烷氧基；R3是氢或低级链烯氧基-羰基。还包括其药学上可接受的盐。
按照本发明的另一个实施方案，它提供了实质上预防主体发生肝硬化的方法，包括给予药学有效量的下式表示的化合物的步骤
其中R1是氢、卤素、硝基、苯并、低级烷基、苯基或低级烷氧基；R2是羟基、乙酰氧基或低级烷氧基；R3是氢或低级链烯氧基-羰基。还包括其药学上可接受的盐。
按照本发明的另一个实施方案，提供了一种治疗肝纤维变性的组合物，包括药学有效量的化合物与药学上可接受的载体结合，该化合物是下式表示的化合物中的一员
其中R1是氢、卤素、硝基、苯并、低级烷基、苯基或低级烷氧基；R2是羟基、乙酰氧基或低级烷氧基；R3是氢或低级链烯氧基。还包括其药学上可接受的盐。
按照本发明还提供了用于治疗肝纤维变性的药剂的制备方法，包括将药学有效量的化合物置于药学上可接受的载体中的步骤，该化合物为下式表示的化合物中的一员
其中R1是氢、卤素、硝基、苯并、低级烷基、苯基或低级烷氧基；R2是羟基、乙酰氧基或低级烷氧基；R3是氢或低级链烯氧基-羰基。还包括其药学上可接受的盐。
还提供了治疗主体肝纤维变性的方法，包括给予药学有效量的下式表示的化合物的步骤
其中R1是氢、卤素、硝基、苯并、低级烷基、苯基或低级烷氧基；R2是羟基、乙酰氧基或低级烷氧基；R3是氢或低级链烯氧基-羰基。还包括其药学上可接受的盐。
按照本发明的另一个实施方案，它提供了用于实质上预防肝纤维变性发生的组合物，包括药学有效量的化合物与药学上可接受的载体结合，该化合物是下式表示的化合物中的一员
其中R1是氢、卤素、硝基、苯并、低级烷基、苯基或低级烷氧基；R2是羟基、乙酰氧基或低级烷氧基；R3是氢或低级链烯氧基。还包括其药学上可接受的盐。
还提供了用于实质上预防肝纤维变性发生的药剂的制备方法，包括将药学有效量的化合物置于药学上可接受的载体中的步骤，该化合物为下式表示的化合物中的一员
其中R1是氢、卤素、硝基、苯并、低级烷基、苯基或低级烷氧基；R2是羟基、乙酰氧基或低级烷氧基；R3是氢或低级链烯氧基-羰基。还包括其药学上可接受的盐。
按照本发明的另一个实施方案，它提供了实质上预防主体发生肝纤维变性的方法，包括给予药学有效量的下式表示的化合物的步骤
其中R1是氢、卤素、硝基、苯并、低级烷基、苯基或低级烷氧基；R2是羟基、乙酰氧基或低级烷氧基；R3是氢或低级链烯氧基-羰基。还包括其药学上可接受的盐。
优选的是，上文中所称的所有化合物可以是由结构式描述的化合物本身，和/或其药学上可接受的盐。
在下文中，术语“主体”是指给予卤夫酮的人或低级动物。术语“病人”是指人主体。术语“治疗”包括实质上预防肝硬化或纤维变性的发生，以及一旦出现肝硬化或纤维变性后，减慢或终止其发展。短语“实质上预防肝硬化或纤维变性的发生”应理解为是指预防这些疾病的临床或临床前症状的出现，包括预防与纤维变性和硬化过程自身直接相关的那些症状，如食管血管出血。
尽管在整个说明书中提到的是特异性喹唑啉酮衍生物“卤夫酮”，但应理解其他喹唑啉酮衍生物也可以用于其用的地方，这些衍生物具有下列结构式
其中R1是氢、卤素、硝基、苯并、低级烷基、苯基或低级烷氧基；R2是羟基、乙酰氧基或低级烷氧基；R3是氢或低级链烯氧基-羰基。还包括其药学上可接受的盐。
现在将联系某些优选实施方案，用以下附图和实施例来描述本发明，以便本发明的各个方面能得到更完全的理解和领会，但意图并不是将本发明限制在这些特定实施方案内。正相反，意图在于包括由所附权利要求书定义的、可包括在本发明范围内的所有选择、改进和等价物。因此，包括优选实施方案的下列附图和实施例将用于说明本发明的实施，大家应理解，所显示的这些特例是经由实施例的方式，目的仅是为了阐述本发明优选实施方案的讨论，还有是为了提供被相信为是最有用的和容易理解的配制方法的说明，以及本发明的原理和概念方面的说明。
附图的简要说明此处仅利用实施例，并参照附图来描述本发明，其中
图1A-1D说明了卤夫酮在大鼠肝中对胶原α1(I)基因表达的作用；图2说明了卤夫酮在大鼠肝中对羟脯氨酸浓度的作用；图3A-3D说明了卤夫酮在大鼠肝中对中度纤维变性的作用。
出乎意料地，如下文中实施例所述，现已发现卤夫酮可抑制体内肝硬化的病理学过程，可能是通过抑制I型胶原合成实现的，但也可能是另一种或几种机理起作用。的确，不论该特异性机理如何，下列数据清楚地证明了卤夫酮在体内抑制肝纤维变性的病理学发展的效能。
有许多理由证明这种发现是出乎人们意料的。首先，卤夫酮的体外行为与其体内行为并不完全对应。用骨软骨细胞观察到的卤夫酮在体内和体外的不同作用可证明这一点。如美国专利5,449,678中所证明，卤夫酮在体外抑制I型胶原在软骨细胞中的合成。然而，未报道用卤夫酮治疗的鸡的骨断裂率增加，这表明在体内未见到该作用。因此，卤夫酮在体内的确切行为不能总是从体外研究得到正确的预言。
其次，其他胶原合成、沉积和交联抑制剂还未证明是能有效治疗肝硬化的，这说明，单独抑制胶原的产生不足以确定对肝纤维变性的治疗是成功还是失败。因此，发现卤夫酮可成功地在合适的动物模型体内抑制肝纤维变性是新颖且非显而易见的。
第三，卤夫酮仅显示是I型胶原抑制剂。然而，肝中形成纤维变性组织的特征在于异常大量的胞外基质成分的沉积，包括至少五种类型的胶原，特别是I、III和IV型胶原，以及其他基质蛋白〔L.Ala-Kokko，《生物化学杂志》24475-9，1987〕。因此，卤夫酮抑制I型胶原合成和沉积的能力不能预示卤夫酮具有减慢、减少或其他改善肝纤维变性发病的能力。
第四，还没有教导指出卤夫酮可作为合适的预防性治疗，用于防止哺乳动物如人的象肝纤维变性和硬化这样的复杂病理生理学过程。例如，美国专利3,320,124仅教导，用与卤夫酮有关的化合物预防鸡的传染病球虫病。鸡与任何哺乳动物包括人的生理学有很大差异。的确，一般不认为鸡是可接受的哺乳动物的实验模型，并且肯定不用作肝病如肝纤维变性和肝硬化的实验模型。因此，该参考文献没有提示本发明化合物具有预防人或其他哺乳动物的肝纤维变性和肝硬化这种清楚的预防性治疗作用，背景技术中的其他参考文献也确实未作出这种提示。
第五，肝纤维变性和肝硬化之间的重要不同显示了肝纤维变性发生的病理学过程的复杂性。肝硬化并不仅仅是一种与肝纤维变性有关的疾病。肝硬化的发病分许多阶段进行，这可潜在地导致最后阶段肝衰竭和坏死。从首先肝中出现脂肪改变到最后肝坏死的所有阶段对于肝硬化的发生都是重要的。当肝硬化进一步发展时，除了肝以外，还出现其他明显的病理学变化。当肝中形成纤维变性组织时，门脉循环减少，进一步减少了肝的功能。这种循环减少导致侧支静脉循环增加，特别是在食管中。这些食管血管会破裂，引起严重出血。因此，尽管根本原因可发现是肝自身的特异性病理学变化，但肝硬化是一个影响不只限于肝的整体病理学过程。本发明显示，与在理论上认为应该是合适的、然而在体内实验中失败的许多物质相比，只有卤夫酮可成功地完成这种治疗。因此，卤夫酮可成功地用于减慢和/或预防在肝硬化的病理学过程中产生的各种相互影响症状的出现，这一发现是新颖且非显而易见的，并显示出了明显的创造性。
最后，所有其他在先技术文献都只是教导了卤夫酮对细胞如成纤维细胞和平滑肌细胞的功效。在肝中，伊藤细胞已显示是肝纤维变性过程中产生的胞外基质成分的来源，因此这种细胞型对于肝纤维变性的发病是决定性的〔S.L.Friedman，《新英格兰医学杂志》3281828-35，1993〕。但是，伊藤细胞是一种完全不同于成纤维细胞的细胞型。即使可以预测卤夫酮对某种类型的细胞的行为，这种预测对于除了这种类型以外的细胞也肯定是不可靠的。因此，卤夫酮对伊藤细胞的作用不可从其对成纤维细胞的作用预测出来。
因此，在先有技术中没有任何关于卤夫酮可在体内用于治疗肝纤维变性的教导。此外，卤夫酮以及相关化合物减慢或终止肝中纤维变性发展的能力是新颖且非显而易见的，并显示了明显的创造性。鉴于卤夫酮在体外和体内所显示的应答不同，这种对于哺乳动物的体内治疗能力的证明是尤其出乎意料的。
参照下列说明性实施例和附图可更加容易地理解本发明。应该注意，尽管参照只是针对卤夫酮进行的，但应相信在美国专利3,320,124中描述和请求保护的其他喹唑啉酮衍生物也具有相似的性能，该文内容结合在此作为参考。
本发明是用含有喹唑啉酮的化合物如卤夫酮治疗肝硬化。下面描述了具有特定药物制剂的组合物，以及这些化合物的使用和制备方法。
尽管肝硬化的发病过程不完全清楚，但已成功研制出这种疾病的合适动物模型。通过给大鼠腹膜内注射二甲基亚硝胺诱导产生肝纤维变性，具有相对短的起作用时间在给予大鼠二甲基亚硝胺的三周内，肝纤维变性已很明显〔A.M.Jezequel等，《肝脏病学杂志》5174-81，1987〕。
二甲基亚硝胺诱导的肝纤维变性的特征是胞外基质成分的沉积增加，包括各种类型的胶原如I型胶原。因此，无论是二甲基亚硝胺诱导的肝纤维变性还是其他类型的肝纤维变性，对纤维变性的抑制取决于减慢或终止导致纤维变性组织产生的病理学过程。
因此，意欲用于抑制肝硬化的化合物必须用体内实验动物模型、诸如上述大鼠肝纤维变性的二甲基亚硝胺模型来测试其减慢或终止导致纤维变性组织沉积的病理学过程的能力。用I型胶原合成抑制剂卤夫酮来进行这些实验，在下面的实施例1和2中将更详细描述。
另外，一旦已发现证明是有效的化合物，必须说明产生最大治疗效能的特定制剂和给药途径。这些制剂和给药途径必须能使该化合物有效地吸收并释放到预期治疗部位，同时将由该化合物的系统分布引起的非特异性副作用减至最小。下面的实施例3到5中给出了含有喹唑啉酮的化合物如卤夫酮的这些制剂和给药途径的说明性实施例。
实施例1卤夫酮对大鼠肝的组织学和形态学作用对对照大鼠和二甲基亚硝胺处理的大鼠的肝样品的组织学检查显示，二甲基亚硝胺在大鼠肝中诱导了特异性形态学改变，包括胶原纤维含量增加。卤夫酮实质上抑制了这些形态学改变的发生，使得大鼠肝的外观更正常。该实验方法如下。将雄性Sprague-Dawley大鼠分成四组。两组腹膜内注射1％二甲基亚硝胺的盐水溶液，每周连续注射三天，持续三周，剂量为1ml/kg体重。该剂量方案将诱导严重的肝纤维变性。另两组对照大鼠注射盐水。从用二甲基亚硝胺注射的前三天开始，一个二甲基亚硝胺处理的大鼠组和一个对照组以5mg/kg餐重的剂量在饮食中加入卤夫酮。在实验结束时，将这些大鼠处死，取出肝并称重。
对这些肝样品进行组织学检查。简言之，将这些组织样品集中到磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，在4℃下用4％聚甲醛的PBS溶液固定过夜。当样品已用梯度乙醇溶液脱水后，制备连续的5μm切片，用氯仿清洗并植入Paraplast中。用0.1％夕利红(Sirius red)和0.1％坚牢绿作为苦味酸中的复染剂对胶原和非胶原蛋白进行不同染色。此方法使胶原染成红色〔Gascon-Barre，M.等，《组织化学与细胞化学杂志》37377-381，1989〕。
然后这些肝样品与大鼠胶原α1(I)表达的探针杂交。对于与遗传探针的杂交，将这些切片用二甲苯脱蜡，通过系列梯度乙醇溶液再水化，用蒸馏水冲洗5分钟，然后在2X SSC中在70℃下培养30分钟。这些切片再用蒸馏水冲洗并用链霉蛋白酶，0.125mg/ml在50mMTris-HCl，5mM EDTA，pH7.5中，处理10分钟。消化后，载玻片用蒸馏水冲洗，用10％福尔马林的PBS溶液后固定，并用0.2％甘氨酸封闭。封闭后，载玻片用蒸馏水冲洗，通过梯度乙醇溶液迅速脱水并空气干燥数小时。在杂交前，从原始质粒上切下1600bp大鼠胶原α1(I)插入片段pUC18，并将其插入到pSafyre质粒中。用地高辛配基标记后，这些切片与此探针杂交〔M.Pines等，《基质生物学》14765-71，1996〕。
图1显示了大鼠肝组织切片与大鼠胶原α1(I)探针的就地杂交。在对照大鼠的肝中(图1A)或在单独给予卤夫酮的大鼠的肝中(图1B)见到胶原α1(I)基因的弱表达。在单独给予二甲基亚硝胺的大鼠的肝中见到胶原α1(I)基因的表达显著增加(图1C)。基因表达主要是在小叶周围的中隔中，在稀疏的胶原性组织部位。与单独给予二甲基亚硝胺的大鼠相比，给予卤夫酮和二甲基亚硝胺的大鼠显示出显著减少的胶原α1(I)基因表达(图1D)。尽管这种剂量的卤夫酮实质上减少了由二甲基亚硝胺引起的大鼠胶原α1(I)基因表达的增加，但它没有完全抑制这种表达，还是可观察到少量表达(见箭头标记)。然而，大鼠胶原α1(I)基因表达实质上减少了，表明卤夫酮有效地对抗了二甲基亚硝胺对表达的诱导。
大鼠肝组织切片用夕利红染色，以证明该组织的胶原含量，结果并未用图显示，因为组织学样品必须查看颜色才知道作用情况。对照大鼠或单独给予卤夫酮的大鼠的肝组织中几乎没有观察到胶原纤维。用二甲基亚硝胺处理的大鼠的肝显示胶原含量增加，小叶周围显现出多束胶原，产生了大纤维性中隔。在给予二甲基亚硝胺和卤夫酮的大鼠中，这些胶原束的增厚显著减少，再次表明了卤夫酮实质上抑制由二甲基亚硝胺诱导的纤维变性的病理生理学过程的能力。
令人感兴趣的是，在用相当高剂量的二甲基亚硝胺引起这种严重肝纤维变性时，用二甲基亚硝胺处理而未给予卤夫酮的六只大鼠在三周实验结束时死亡了四只。相反，给予二甲基亚硝胺和卤夫酮的六只大鼠中只有一只死亡。没有给予二甲基亚硝胺的那两组中的六只大鼠都存活下来。因此，单独的卤夫酮没有毒性，还能几乎完全阻止二甲基亚硝胺诱导的死亡。
卤夫酮还抑制了二甲基亚硝胺诱导的总的形态学水平的变化。单独用二甲基亚硝胺处理的大鼠的肝重量显著降低(4.5g和5.0g)，特别是当与对照大鼠或单独给予卤夫酮的大鼠对比时(分别为12±1g和11±1.5g)。给予卤夫酮和二甲基亚硝胺的大鼠的肝重(8.5±1.7g)几乎是单独给予二甲基亚硝胺的大鼠的两倍，虽然与对照大鼠相比稍有降低。
因此，卤夫酮能在所有水平上防止二甲基亚硝胺诱导的纤维变性作用的出现几乎消除了二甲基亚硝胺诱导的死亡，并显著减少了由二甲基亚硝胺诱导的纤维变性的总的和细小的形态学变化。显然，卤夫酮防止在肝纤维变性的病理学过程中产生的形态学变化的作用是强有力的，而且是特异性的。
实施例2卤夫酮在大鼠肝中对中度纤维变性的作用通过测量胶原α1(I)基因表达和羟脯氨酸含量，证明卤夫酮实质上完全阻止了少量二甲基亚硝胺诱导的纤维变性。所用的具体实验方法与实施例1类似，只是用二甲基亚硝胺处理的大鼠仅给予0.25％二甲基亚硝胺的盐水溶液，比在上述实施例1中所给的剂量低得多。而且，大鼠处死前的处理持续时间也更长相对于实施例1中的三周为四周。
如上述实施例1中所述测量胶原α1(I)基因表达。对于羟脯氨酸分析，将肝样品在110℃下用6N HCl水解22小时。如Krom所述〔M.D.Krom，《化验师》105305-16，1980〕，经过Kjeldahl消化后，利用自动分析器通过分光光度法确定氮。在阳离子交换柱(BTC2710，Biotronik)上经过柱后衍生后，通过氨基酸分析(Biotronik LC5000，Germany)确定相同水解产物中的单一胶原氨基酸羟脯氨酸。结果表示为肝总蛋白质中的胶原百分数。
羟脯氨酸是一种胶原中相当大量存在的氨基酸，因此它可用作特定组织中胶原总浓度的指示剂。因此，如图2所示，二甲基亚硝胺清楚地导致大鼠肝中羟脯氨酸浓度显著增加，因此胶原浓度也显著增加。这种增加通过用卤夫酮处理而受到完全抑制。但是，给予大鼠卤夫酮而不给予二甲基亚硝胺则没有使羟脯氨酸浓度产生任何变化。因此，卤夫酮的作用仅是抑制二甲基亚硝胺诱导的羟脯氨酸浓度的增加。
图3C表明，这样低剂量的二甲基亚硝胺仍使胶原α1(I)基因表达增加，特别是对血管周围的细胞。图3D显示，卤夫酮消除了这种增加的基因表达。与上述实施例1中一样，再次证明了单独的卤夫酮对胶原α1(I)基因表达没有作用(图3B)，对照大鼠也没有胶原α1(I)基因表达(图3A)。
因此，卤夫酮清楚地完全抑制了大鼠肝中二甲基亚硝胺诱导的胶原合成水平的升高。但是，单独的卤夫酮在大鼠中没有显示任何这样的作用，表明卤夫酮对于那些病理生理学过程、如由二甲基亚硝胺诱导的纤维变性引起的胶原合成的抑制作用是特异性的。另外，如实施例1和2中所证明，卤夫酮显然能实质上完全消除由二甲基亚硝胺引起的生化和生理学变化。
实施例3利用胆管结扎诱导的纤维变性的抑制除了二甲基亚硝胺诱导的肝纤维变性外，还可得到第二种大鼠肝纤维变性模型。此模型是依靠胆管的手术结扎来诱导肝纤维变性，而不需要给予外源性物质或毒性化学物质，已显示这是一种合适的研究人肝硬化的模型〔Kountaras，J.等，《英国实验病理学杂志》65305-311，1984；Muriel，P.等，《肝脏病学杂志》2195-102，1994；Muriel，P.等，《应用毒理学杂志》15449-453，1995〕。因此，胆管结扎模型的特别有益之处在于任何保护性治疗必须直接保护肝不出现纤维变性诱导的病理学变化，而不是间接地改变用于导致动物模型出现肝纤维变性的外源性物质的作用。实验方法如下。
将重200-250g的雄性Wistar大鼠分成四个实验组，每组三只大鼠。第一组不进行胆管结扎手术，也不给予卤夫酮。第二组不进行胆管结扎手术，但给予卤夫酮。应注意，头两组中的所有动物都要经历假操作，包括实际手术过程的所有步骤，只是不结扎胆管。第三组进行胆管结扎手术，但不给予卤夫酮。第四组进行胆管结扎手术，并给予卤夫酮。实际手术过程与文献中报道的基本相似〔Kountaras，J.等，《英国实验病理学杂志》65305-311，1984〕。
所有动物随意给予饮用水。给予卤夫酮的大鼠在手术前一周和实验持续期间，即手术后3天或7天，在正常大鼠饮食中加入浓度为5mg/kg餐重的卤夫酮。实验结束时将这些大鼠处死。如上述实施例1中所述，测量胶原含量(通过夕利红染色)和胶原α1(I)基因表达。另外，利用Boerringher-Mannheim的日立自动分析器系统，比色测量血清碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶浓度。结果如下。
在经历假操作的大鼠中未观察到胶原合成。另外，这些大鼠没有显示体重或肝重有任何增加，或任何肝组织学变化。最后，无论是否给予卤夫酮，这些大鼠在手术后3或7天都未显示碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶等酶浓度有任何变化。
相反，在用卤夫酮处理和未用卤夫酮处理的组中，经历胆管结扎的大鼠都观察到这三种酶浓度升高。这些升高的浓度是肝纤维变性和肝硬化的病理学过程的特征性标志。但是，给予卤夫酮的大鼠的这些酶浓度低于未给予卤夫酮的大鼠。具体地说，未给予卤夫酮的大鼠的丙氨酸转氨酶浓度比给予了卤夫酮的大鼠高56％，碱性磷酸酶浓度高257％，天冬氨酸转氨酶浓度高15％。因此，显然卤夫酮减少了经历胆管结扎的大鼠中酶浓度的升高程度。
此外，当经历胆管结扎且给予卤夫酮的大鼠与仅经历胆管结扎的大鼠相比时，卤夫酮显著减少了胆管结扎诱导的胶原合成和胶原α1(I)基因表达的增加。因此，卤夫酮显然能抑制胆管结扎诱导的大鼠肝纤维变性模型中肝纤维变性的过程。
实施例4用于卤夫酮给药的合适制剂本发明的卤夫酮和相关化合物，以及其药学上可接受的盐，可以用本领域中熟知的许多方式给予主体。在下文中，术语“主体”是指给予卤夫酮的人或低级动物。例如，可以通过口服给药，或胃肠外给药，例如通过静脉滴注或腹膜内、皮下或肌内注射。
用于口服给药的组合物包括粉末剂或颗粒剂，在水中或非含水基质中的悬浮液或溶液，扁囊剂，胶囊或片剂。增稠剂、稀释剂、调味剂、分散助剂、乳化剂或粘合剂也是可取的。
用于胃肠外给药的制剂包括但不限于无菌水溶液，它还可含有缓冲液、稀释剂和其他合适的添加剂。
给药量取决于症状的严重程度和主体对卤夫酮或本发明的其他化合物之一及其药学上可接受的盐的响应能力。本领域普通技术人员可容易地确定最佳剂量，给药方法和重复率。
实施例5治疗肝纤维变性和肝硬化的方法如上所述，卤夫酮已显示是肝纤维变性，肝硬化前体的有效抑制剂。以下实施例仅是为了说明用卤夫酮或本发明的其他化合物之一及其药学上可接受的盐治疗肝纤维变性和肝硬化的方法，意图不在于限制。
该方法包括以下步骤将实施例4中所述的、在药学上可接受的载体中的、卤夫酮或本发明的其他化合物之一及其药学上可接受的盐给予主体进行治疗。卤夫酮按照有效剂量方法学给药，优选直到达到预定终点，如主体中肝纤维变性或肝硬化不再进一步发展，肝纤维变性或肝硬化受到抑制，或防止了肝纤维变性或肝硬化的形成。
这种治疗针对的肝纤维变性类型的实例可有效地包括但不限于由慢性酒精中毒，营养失调，血色素沉着，被动充血，高胆固醇血，接触了毒药或毒素如铅，接触药物，免疫反应，遗传决定的对某些物质的敏感性，如可在肝豆状核变性中见到的对铜敏感，以及传染病如病毒性肝炎、梅毒和各种寄生虫感染，包括但不限于曼氏血吸虫病和日本血吸虫病导致的肝纤维变性。另外，这样的治疗对于病因学未知或不完全清楚的肝纤维变性疾病也是有效的。
特别是，在前面的实施例中描述的证据清楚地显示，卤夫酮和本发明的其他化合物适于治疗由肝细胞毒性物质的摄取引起的肝病。即使一般不具有肝细胞毒性的物质以过量浓度存在时也会引起肝损害，例如药物。由于肝是通过许多不同化学物质的代谢而解毒的主要器官，因此肝细胞毒性物质的摄取引起的肝病不是一个少见的现象。如实施例1中所述的二甲基亚硝胺诱导的肝纤维变性模型的实验清楚地显示了本发明对这种肝病的治疗效能。
我们并不想用单一机理来限制本发明化合物的作用，因为肝纤维变性是已用本发明化合物实质上预防或改善的肝硬化发病的必需基本因素，除了可治疗以单独的肝纤维变性为特征的那些疾病外，所有这些方法也可用于治疗肝硬化。
实施例6含有卤夫酮的药剂的制备方法以下是卤夫酮或本发明的其他化合物之一及其药学上可接受的盐的制备方法的例子。作为举例描述的是卤夫酮的制备，但应理解这种描述包括本发明其他化合物及其药学上可接受的盐，以及卤夫酮自身的药学上可接受的盐的制备方法。首先，按照良好的药物制备惯例合成卤夫酮。美国专利3,338,909中给出了合成卤夫酮及相关喹唑啉酮衍生物的方法的例子。其次，如实施例4中所述，再次按照良好的药物制备惯例，将卤夫酮置于合适的药物载体中。
应理解，上述说明书的意图仅在于作为实施例，在本发明的精神和范围内还可能有许多其他实施方案。
权利要求
1.一种用于治疗主体肝硬化的组合物，该组合物包含药学有效量的下式表示的化合物及其药学上可接受的盐
其中R1是氢、卤素、硝基、苯并、低级烷基、苯基或低级烷氧基；R2是羟基、乙酰氧基或低级烷氧基；和R3是氢或低级链烯氧基-羰基。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述化合物是卤夫酮。
3.如权利要求1所述的组合物，它进一步包含药学上可接受的载体。
4.如权利要求1所述的组合物，其中肝硬化是由肝细胞毒性物质引起的。
5.一种用于治疗主体肝纤维变性的组合物，它包含药学有效量的下式表示的化合物及其药学上可接受的盐
其中R1是氢、卤素、硝基、苯并、低级烷基、苯基或低级烷氧基；R2是羟基、乙酰氧基或低级烷氧基；和R3是氢或低级链烯氧基-羰基。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述化合物是卤夫酮。
7.如权利要求6所述的组合物，它进一步包含药学上可接受的载体。
8.如权利要求7所述的组合物，其中肝纤维变性是由肝细胞毒性物质引起的。
9.用于治疗主体肝硬化的药剂的制备方法，它包含将药学有效量的化合物置于药学上可接受的载体中的步骤，所述化合物是下式表示的化合物中的一员及其药学上可接受的盐
其中R1是氢、卤素、硝基、苯并、低级烷基、苯基或低级烷氧基；R2是羟基、乙酰氧基或低级烷氧基；和R3是氢或低级链烯氧基-羰基。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述化合物是卤夫酮。
11.如权利要求9所述的方法，其中肝硬化是由肝细胞毒性物质引起的。
12.用于治疗主体肝纤维变性的药剂的制备方法，该方法包含将药学有效量的化合物置于药学上可接受的载体中的步骤，所述化合物是下式表示的化合物中的一员
其中R1是氢、卤素、硝基、苯并、低级烷基、苯基或低级烷氧基；R2是羟基、乙酰氧基或低级烷氧基；和R3是氢或低级链烯氧基-羰基；及其药学上可接受的盐。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述化合物是卤夫酮。
14.如权利要求12所述的方法，其中肝纤维变性是由肝细胞毒性物质引起的。
全文摘要
本发明公开了治疗肝纤维变性和肝硬化的组合物,以及该组合物的使用和制备方法。该组合物包括喹唑啉酮衍生物,优选卤夫酮。
文档编号A61K31/505GK1265034SQ98805389
公开日2000年8月30日 申请日期1998年5月22日 优先权日1997年5月23日
发明者M·皮尼斯, A·纳格勒 申请人:哈达斯特医疗研究服务和开发有限公司, 以色列农业部农业研究组织