专利名称：促甲状腺激素的突变体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及促甲状腺激素的突变体，及其衍生物和类似物。还提供了促甲状腺激素的突变体、衍生物、和类似物的制备方法。本发明进一步涉及药物组合物以及诊断和治疗方法。发明背景糖蛋白激素是一类调节生殖和代谢的进化保守的激素(Pierce和Parsons，1981，内分泌学综述(Endocr.Rev.)11354-385)。该激素家族包括促卵泡激素(FSH)、促黄体生成激素(LH)、促甲状腺激素(TSH)、和绒膜促性腺激素(CG)。
TSH是脑下垂体前叶腺促甲状腺细胞产生的28-30 kDa的异二聚体糖蛋白。TSH分子量的差异主要是由于碳水化合物链的异质性决定。在典型的内分泌负反馈循环中，TSH的合成和分泌由促甲状腺激素释放激素激活，由甲状腺激素抑制。TSH通过与G蛋白偶联TSH受体(TSHR)相互作用控制甲状腺的功能(Vassant和Dumont，1992，内分泌学综述(Endocr.Rev.)13596-611)。TSH与甲状腺细胞上的TSH受体结合导致主要由环3′5′-一磷酸腺苷(cAMP)、肌醇1，4，5-三磷酸酯(IP3)和甘油二酯(DAG)参与的第二信使途径激活，最终导致甲状腺基因表达的调节。TSH的生理作用包括激活分化的甲状腺功能，例如刺激碘的摄取和有机化，刺激甲状腺激素从腺体释放，以及促进甲状腺的生长(Wondisford等，1996，促甲状腺素，Braverman等编辑，Wemer andIngber’s The Thyroid，Lippencott-Raven，Philadelphia，pp.190-207)。
从结构上看，糖蛋白激素为含有共同的α-亚基和激素特异性β-亚基的异二聚体。共同的人α-亚基含有92个氨基酸的脱辅基蛋白核心，这92个氨基酸包括10个半胱氨酸残基，它们均参与形成二硫键。它由单独基因编码，定位于人第6号染色体上，因此在特定物种中具有相同的氨基酸序列(Fiddes和Goodman，1981，J.Mol.Appl.Gen.13-18)。激素特异性β-亚基在长度、结构组织、和染色体定位上存在差别(Shupnik等1989，内分泌学综述(Endocr.Rev.)10459-475)。人TSHβ-亚基基因是编码118个氨基酸残基的成熟蛋白质，定位在1号染色体上(Wondisford等，同上)。各种β-亚基可以按照形成6个二硫键的12个固定的半胱氨酸残基校准。尽管在这些激素中30-80％的氨基酸序列相同，β-亚基却差别显著，以至高度特异性地与不同的受体结合(Pierce和Parsons，同上)。
这些激素的一个重要的结构成分是其中重量占15-35％的碳水化合物部分。共同的α-亚基具有两个天冬酰胺(N)-连接低聚糖，TSH和LH中的β-亚基具有1个，CG和FSH中的β-亚基具有2个。另外，CG的β-亚基含有独特的32个残基的羧基末端延长肽(CTEP)，其中含有四个丝氨酸(O)-连接糖基化位点(Baenziger，1994，糖基化和糖蛋白激素的功能(Glycosylation and glycoprotein hormone function)，Lustbander等编，糖蛋白激素结构、功能和临床意义(Glycoprotein HormonesStructure，Function and Clinical Implications)，Springer-Verlag，New York，167-174页)。
通常主要用促性腺激素，特别是hCG研究人糖蛋白激素的构效关系。最近，确定了部分脱糖基化hCG的晶体结构，该结构显示了两个相关结构特征，它们可能与其它糖蛋白激素也相关(Lapthom等，1994，自然(Nature)369455-461；Wu等，1994，结构，2548-558)。α-亚基和hCGβ-亚基都具有类似的整体拓扑结构…每个亚基在中心半胱氨酸结(由三个二硫键形成)的一侧具有两个β-发夹环(L1和L3)，在另一侧有一个长环(L2)。
TSHβ-亚基cDNA和基因的克隆(Joshi等，1995，内分泌学(Endocrinol.)1363839-3848)，TSH受体的克隆(Parmentier等，1989，科学(Science)2461620-1622；Nagayama等，1990，生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophy.Res.Commun.)166394-403)，以及TSH的重组表达(Cole等，1993，生物技术(Bio/Technol.)111014-1024；Grossmann等，1995，分子内分泌学(Mol.Endocrinol.)9948-958；Szkudinski等，1996同上)促进了人TSH的分子生物学研究。以前关于TSH的构效研究主要集中在高度保守区和嵌合亚基的创建上。然而，这些研究没有得到体外生物活性增加的激素(Grossmann等，1997，内分泌学综述(Endocr.Rev.) 18476-501)。
已经开始研制延长糖蛋白激素的激素循环半衰期的策略。在基因融合实验中，将含有几个O-连接碳水化合物的hCGβ-亚基的羧基末端延长肽加入人TSHβ-亚基中(Joshi等，1995，内分泌学(Endocrinol.)1363839-3848；Grossmann等，1997，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)27221312-21316)。尽管这些嵌合体的体外活性没有改变，但它们的循环半衰期延长了，导致体内生物活性增加。另外，经基因融合成为单一链而表达出的β和α亚基与野生型糖蛋白激素相比增加了稳定性，延长了血浆半衰期(Sugahara等，1995，美国国家科学院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)922041-2045；Grossmann等，1997，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)27221312-21316)。
2.1 TSH在甲状腺癌诊断和监测中的应用曾在19位分化型甲状腺癌患者的诊断和跟踪中测试了重组TSH刺激131I摄取和Tg分泌的作用，因此避免了甲状腺激素停药后的副作用(Meier等，临床内分泌代谢杂志(J.Clin.Endocrinol.Metab.)78188-196)。首次实验的初步结果十分令人鼓舞。在美国甲状腺癌的发生率每年约14,000个病例。其中大多数是分化型的，乳头癌或卵泡癌是最常见的亚型。因为这些分化型甲状腺癌的10年和20年存活率分别为90％和60％，因此长期监测以检测局部复发和长距离移位在这些患者的监控中显得十分重要，特别是初步治疗甚至十年后肿瘤还可能复发。跟踪中应用的基本方法是全身放射性碘扫描和血清甲状腺球蛋白(Tg)测定。为了在这些诊断方案中得到最佳灵敏度，需要用TSH刺激残留的甲状腺组织以分别增加131碘的摄取或Tg的分泌。然而，甲状腺切除后的甲状腺癌患者需要用甲状腺激素治疗来抑制内源性TSH，以避免TSH对残留甲状腺组织的潜在刺激作用，并维持甲状腺功能正常。因此，通常在放射性碘扫描和Tg测定之前4-6周和2周停止左旋-T4，或不常使用的T3给药，以便刺激内源性TSH的分泌。随之而来的短暂但严重的甲状腺功能低下严重地损害了这些患者的生活质量，并可能干扰他们的工作能力。而且，因为TSH可以作为恶性甲状腺组织的生长因子，故增加内源性TSH分泌的延长期可能对这些患者存在潜在危险。
在二十世纪六十年代，曾使用牛TSH(bTSH)刺激残留甲状腺组织，以实现升高内源性TSH的需要(Blahd等，1960癌症(Cancer)13745-756)。然而，不久就发现若干不利因素，从而停止了它在临床治疗中的应用。与停用激素相比，bTSH证明在检测恶性甲状腺组织的残留和转移上功效较差。另外，经常发现过敏反应和中和抗体形成，它们会进一步限制随后的bTSH给药效果和干扰内源性TSH的测定(Braverman等，1992，临床内分泌代谢杂志(J.Clin.Endocrinol.Metab.)741135-1139)。
从诊断或治疗前景来看，研制新的具有期望特性的hTSH类似物值得重点关注。通常，激素活性可以通过延长激素半衰期(长效作用类似物)或通过增加其自身活性(超作用类似物)得以增加。本发明人研制出突变的TSH和类似物，这些新分子显示具有优于野生型TSH的体外和体内生物活性。下文将描述这些发现。发明概述本发明涉及促甲状腺激素(TSH)突变体，包括糖蛋白激素共有的α-亚基的突变体、TSHβ-亚基的突变体、TSH类似物、衍生物、及其片段，优选由具有一个或多个氨基酸残基取代的突变亚基构成的TSH异二聚体和/或经修饰(如下文所述)增加了体内半衰期的TSH异二聚体。突变亚基、突变TSH异二聚体、TSH类似物、衍生物、及其片段在与TSH受体(TSHR)结合方面和刺激TSHR信号传导方面比野生型TSH活性更强，并能够延长激素在循环系统中的半衰期。
在一个优选实施例中，本发明提供了在靠近或在α亚基β发夹L1环中的氨基酸位置上以及在靠近或在β亚基β发夹L3环中的氨基酸位置上发生突变的TSH或TSH类似物，更优选的是，突变的TSH被修饰以增加体内半衰期，例如但不限于，使TSHβ亚基与人绒膜促性腺激素(hCG)β亚基的羧基末端延长肽(CTEP)融合，和/或使突变的α和β亚基融合产生单链TSH类似物。通过化学合成或重组DNA技术制备上述物质的方法均在本发明的范围内。
在另一个优选实施例中，本发明提供了TSH异二聚体的突变α亚基，它具有在如
图1(SEQ ID NO1)所示的人α亚基的第22位存在氨基酸取代的突变α亚基。
还提供了编码α和β亚基突变体和TSH融合类似物的核酸序列，以及用于制备激素的亚基、生物测定方法、和宿主-载体系统。
本发明进一步提供了突变TSH和TSH类似物、TSH衍生物、及其片段在诊断和治疗甲状腺功能低下和癌症，尤其是甲状腺癌的应用方法。在一个优选实施例中，在对甲状腺癌患者的诊断和跟踪监测中，用突变TSH刺激放射性碘的摄取和甲状腺球蛋白的分泌。在另一个优选实施例中，本发明的突变TSH异二聚体可以在TSH受体结合抑制作用分析中用于检测抗TSH受体的抗体存在与否，例如用于检测属于疾病和病症特征(例如但不限于格雷夫斯病)的TSHR自身抗体。还提供了含有突变TSH或TSH类似物的药剂组合物和诊断组合物。
3.1定义本文中应用的下列名词应当具有如下所示的含义TSH＝人促甲状腺激素，除非对该种类另有说明TSHR＝人促甲状腺激素受体，除非对该种类另有说明hCG＝人绒膜促性腺激素CTEP＝hCGβ亚基的羧基末端延长肽α亚基＝人糖蛋白激素共有的α亚基，除非另有说明β亚基＝人TSHβ亚基，除非另有说明氨基酸残基用常规单字母代码表示。
在本文中，TSH亚基中的突变表示为TSH亚基，之后是野生型氨基酸残基，氨基酸位置，以及突变的氨基酸残基。例如，βI58R应当理解为人TSHβ亚基58位的异亮氨酸突变为精氨酸。附图描述图1.人糖蛋白激素共有的α亚基的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。靠近或在αL1环中的氨基酸残基(第8-30位)在序列上面划线表示。序列上面的号码表示优选突变的氨基酸位置。
图2.人TSHβ亚基的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。靠近或在βL3环中的氨基酸残基(第52-87位)在序列上面划线表示。序列上面的号码表示优选突变的氨基酸位置。
图3.hCGβ亚基的氨基酸序列。CTEP的氨基酸残基由下划线表示。
图4.由具有αG22R突变的突变α亚基和野生型β亚基形成的突变TSH异二聚体刺激CHO-JP26细胞产生cAMP(实心三角)；和由野生型TSH刺激产生cAMP(实心圆)。
图5.由含有具有αQ13K+αE14K+αP16K+αQ20K突变的α4K亚基和β亚基与CTEP的融合蛋白的突变TSH异二聚体(α4K+βCETP；交叉方块)刺激JP09细胞产生cAMP；含有αQ13K+αE14K+αP16K+αQ20K突变和野生型TSHβ亚基的突变TSH异二聚体(α4K，空心方块)刺激JP09细胞产生cAMP；以及野生型TSH(实心圆)刺激JP09细胞产生cAMP。
图6.在TSH-特异性β亚基的βL1环中的突变。线图说明以体外检测cAMP产生为标准，βI3E和βR14E与野生型TSH的生物活性基本上相同，但含有任何βF1R、βE6N或βA17R突变亚基的异二聚体表现出基本上较高的生物活性。
图7.以体外检测cAMP产生为标准，TSH-特异性β亚基中的组合突变表现比野生型TSH基本上较高的生物活性。突变的异二聚体包括βF1R和βE6N突变的组合，或者βF1R、βE6N和βA17R突变的组合。
图8A-8B.线图表示hTSH类似物的体内活性。图8A表示给预先抑制T3的鼠腹膜内注射野生型hTSH(hTSH-wt)和TSH类似物后6小时血中的T4水平。数值表示为五只鼠各数据点的平均值±平均值的标准偏差。图8B是柱状图，表示特定构建物的总T4与TSH的比率。单位为腹膜内注射后6小时测定出来的血清平均总T4(μg/dl)除以同时测定的血清平均hTSH(ng/ml)得到的单位。腹膜内注射后6小时，200或20ng注射材料的回收率相近(野生型、α4K、和α4K/β3R的回收率分别为2％、1％和1％)。发明详述本发明涉及新的突变TSH蛋白，编码突变TSH蛋白的核酸分子，及其制备方法，和诊断和治疗方法。本发明人设计和研制出突变的促甲状腺激素(TSH)、TSH衍生物、TSH类似物、以及它们的片段，它们在α和β亚基中均具有突变(优选氨基酸取代)，从而使含有这些亚基的TSH异二聚体的生物活性相对于野生型TSH的生物活性有所增加，并且对它们进行修饰，从而延长了激素在循环系统中的半衰期。本发明人发现上述增加生物活性的突变和增加激素半衰期的策略具有协同增效作用，以至于具有超作用突变和长效作用修饰的TSH异二聚体比超作用突变和长效作用修饰单独赋予的活性加合所期望得到的生物活性更高。
本发明人还发现在人α亚基的第22位氨基酸发生氨基酸取代(如图1(SEQ ID NO1)所示)，优选碱性氨基酸的取代，例如赖氨酸或精氨酸，更优选精氨酸，相对于野生型TSH增加了TSH的生物活性。
本发明人通过组合单一亚基中的特定突变并对亚基和异二聚体进行修饰设计出突变亚基，用来增加异二聚体的体内半衰期(如下文所述)。具体地说，本发明人设计了包含突变的突变α、突变β、突变TSH异二聚体，尤其在特定区域的突变。这些区域包括共有α亚基的β发夹L1环(如图1所示)，和TSHβ亚基的β发夹L3环(如图2所示)。在一个实施例中，本发明提供了突变的α亚基、突变的TSHβ亚基、和含有一个突变α亚基或一个突变β亚基的TSH异二聚体，其中突变的α亚基含有一个或多个氨基酸取代，优选定位于靠近或在α亚基的β发夹L1环中，其中突变的β亚基含有一个或多个氨基酸取代，优选定位于靠近或在β亚基的β发夹L3环中(优选，这些突变能够增强含有突变亚基的TSH异二聚体的生物活性，以及具有突变亚基的TSH异二聚体经修饰，相对于野生型TSH异二聚体增加了的血清半衰期)。
按照本发明，含有一个或多个氨基酸取代，优选定位于靠近或在β亚基的β发夹L3环中的突变β亚基，可以在其羧基末端与CTEP融合。这种突变β亚基-CTEP亚基可以与野生型或突变α亚基共表达和/或组合，形成比野生型TSH具有更高生物活性和更长血清半衰期的功能性TSH异二聚体。
在另一个实施例中，含有一个或多个氨基酸取代，优选定位于靠近或在β亚基的β发夹L3环中的突变β亚基，与含有一个或多个氨基酸取代，优选定位于靠近或在α亚基的β发夹L1环中的突变α亚基，融合形成单链TSH类似物。这种突变β亚基-突变α亚基融合体具有比野生型TSH更高的生物活性和更长的血清半衰期。
在另一个实施例中，含有一个或多个氨基酸取代，优选定位于靠近或在β亚基的β发夹L3环中，并进一步在羧基末端含有CTEP的突变β亚基，与含有一个或多个氨基酸取代，优选定位于靠近或在α亚基的β发夹L1环中的突变α亚基，融合形成单链TSH类似物。
还提供了融合蛋白、类似物、和编码这些蛋白质和类似物的核酸分子，以及上述蛋白质和类似物的制备，例如，通过重组DNA技术。
在一个特别方面，本发明提供了突变α和β亚基的氨基酸序列，及其具有功能活性(functionally active)的片段和衍生物。本文用到的“功能活性”突变TSHα和β亚基指表现一种或多种与野生型亚基有关的已知功能活性的物质，例如，与TSHR的结合、引发TSHR的信号传导、抗原性(与抗TSH抗体结合)、免疫原性等。
在具体实施例中，本发明提供了有至少6个氨基酸、10个氨基酸、50个氨基酸、或至少70个氨基酸组成的突变α和TSHβ亚基的片段。在各实施例中，突变α亚基含有或基本上由突变的αL1环区组成；突变β亚基含有或基本上由突变的βL3环区组成。
本发明进一步提供了编码突变α和突变β亚基的核酸序列，以及修饰的突变α和β亚基(例如，突变β亚基-CTEP融合体或突变β亚基-突变α亚基融合体)的核酸序列，还提供了这些核酸序列的应用方法。α亚基和β亚基中的突变分别在下面5.1和5.2部分更详细地描述。
本发明还涉及基于突变α亚基、突变β亚基、突变TSH异二聚体、和TSH类似物、衍生物，及其片段的治疗和诊断方法，以及基于它们的组合物。本发明提供了本发明突变TSH和类似物在诊断和治疗甲状腺癌中的应用，即具有比野生型TSH更强活性和更长循环半衰期的突变TSH和类似物的给药。本发明进一步提供了在TSH受体结合抑制分析中利用本发明的突变TSH异二聚体和类似物诊断特征在于存在抗TSH受体的自身抗体的疾病和病症的方法。本发明还提供了诊断试剂盒。
本发明还提供了治疗甲状腺病症，例如甲状腺癌的治疗方法。
为清楚公开本发明，而不是为了限定，分下面几小部分详细描述本发明。
5.1共有α亚基的突变人糖蛋白激素的共有α亚基如图1所示(SEQ ID NO1)含有92个氨基酸，包括10个半胱氨酸残基，它们都参与形成二硫键。本发明涉及人糖蛋白激素的α亚基突变体，其中亚基含有一个或多个氨基酸取代，优选定位于靠近或在α亚基的β发夹L1环中。定位于靠近或在α亚基的β发夹L1环中，如图1所示从8-30位的氨基酸残基发现对于影响受体结合和信号传导发挥十分重要的作用。定位在αL1环中的氨基酸残基，例如11-22位的氨基酸残基，在除类人动物外的所有脊椎动物中形成一簇碱性残基团，具有促进受体结合和信号传导的能力。特别是发现第22位的氨基酸是一个影响TSH效力的残基。
按照本发明，突变α亚基为野生型蛋白质中的一个、两个、三个、四个或多个氨基酸残基被取代、缺失或插入的产物。
在一个实施例中，突变α亚基相对于野生型α亚基具有一个或多个氨基酸残基取代，优选，在选自8-30、11-22、8-22、11-30、11-16、14-22、13-14、或16-17位残基的氨基酸残基中具有一个或多个氨基酸取代。
在本发明的另一个实施例中，突变α亚基在α亚基序列的11、13、14、16、17、20或22位具有一个氨基酸取代。在本发明的再一个实施例中，在选自α亚基序列的11、13、14、16、17、20或22位残基的氨基酸残基中具有多个氨基酸取代。
在各实施例中，用选自赖氨酸、精氨酸和，组氨酸(不太优选)的正电荷残基或碱性残基进行氨基酸取代。
在一个优选实施例中，本发明的突变α亚基在22位具有一个氨基酸取代，其中甘氨酸残基取代为精氨酸，即αG22R。具有αG22R的突变α亚基可以至少含有一个或多个其它的氨基酸取代，例如但不限于αT11K、αQ13K、αE14K、αP16K、αF17R、和αQ20K。在另一个优选实施例中，突变α亚基具有选自αT11K、αQ13K、αE14K、αP16K、αF17R、αQ20K、和αG22R中的一个、两个、三个、四个、或多个氨基酸取代。例如，本文中的α4K也是一个优选的突变α亚基(与修饰联用，以增加具有突变α亚基的TSH异二聚体的血清半衰期)，它含有四个突变αQ13K+αE14K+αP16K+αQ20K。
本发明的突变α亚基具有功能活性，即能够表现一种或多种与野生型α亚基有关的功能活性。优选，突变α亚基能够与野生型或突变β亚基非共价结合，形成能够与TSHR结合的TSH异二聚体。优选，该TSH异二聚体还能够引发信号传导。更优选，该含有一个突变α亚基的TSH异二聚体具有比野生型TSH更强的体外和/或体内生物活性。发明试图将一种以上突变组合到一个突变α亚基中，从而制备超活性的α突变，它再与野生型或突变β亚基联合，形成相对于野生型TSH生物活性明显增加的TSH异二聚体。还试图将α亚基突变和使含突变α亚基的TSH异二聚体的血清半衰期延长的方法结合起来(即，含有β亚基-CTEP融合体或β亚基-α亚基融合体的TSH异二聚体)。亚基中的突变和长效作用修饰协同作用，导致生物活性出乎意料地增加。
在另一个实施中，具有理想的免疫原性和抗原性的这类突变α亚基可以用于，例如，形成免疫的免疫分析、抑制TSHR信号传导的免疫分析等。突变α亚基可以通过本领域已知方法检测需要的活性，包括但不限于，5.8部分中描述的分析法。
5.2 TSHβ亚基的突变人糖蛋白激素的共有β亚基含有118个氨基酸，如图2所示(SEQ IDNo2)。本发明涉及TSHβ亚基的突变，其中所述亚基含有一个或多个氨基酸取代，优选定位于靠近或在β亚基β发夹L3环中，其中该突变β亚基与hCGβ亚基的CTEP融合，或者该突变β亚基是含有22位氨基酸取代的突变α亚基(如图1所示(SEQ ID NO1)的TSH异二聚体的一部分，或者是α亚基-β亚基融合体TSH异二聚体的一部分。定位在或靠近人TSHβ亚基βL3环中的52-87位氨基酸残基与定位于hCG外周并看起来暴露在晶体结构表面的氨基酸相对应。尤其值得关注的是TSH中没有但存在于hCG中的一簇碱性残基(从58-69位)。将碱性或正电荷残基取代引入人TSH的该区域，导致TSHR结合亲合力和自身活性本质提高。
本发明的突变TSH异二聚体具有野生型β亚基中的一个、两个、三个、四个、或多个氨基酸残基被取代、缺失或插入的β亚基。
在一个实施例中，突变β亚基相对于野生型β亚基具有由一个或多个氨基酸残基取代，优选，在选自β亚基(如图2(SEQ ID NO2)所示)52-87、52-69、58-69、或58-87位残基的氨基酸残基中具有一个或多个氨基酸取代。
在本发明的另一个实施例中，突变β亚基在β亚基序列(如图2(SEQ ID NO2)所示)的58、63或69位上具有一个氨基酸取代。在本发明的再一个实施例中，突变β亚基在选自β亚基序列(如图2(SEQ ID NO2)所示)58、63或69位残基的氨基酸残基中具有多个氨基酸取代。
在各实施例中，用选自赖氨酸、精氨酸、以及组氨酸(不太优选)的正电荷残基或碱性残基进行氨基酸取代。
在一个优选实施例中，突变β亚基具有选自βI58R、βE63R、和βL69R中的一个、两个、三个、或更多的氨基酸取代。例如，本文中提到的β3R也是一个优选的突变β亚基，它包括三个突变βI58R+βE63R+βL69R。
本发明的具有突变β亚基的突变TSH、TSH类似物、衍生物，及其片段还具有22位氨基酸取代的突变α亚基(如图1(SEQ ID No1)所示)和/或具有血清半衰期高于野生型TSH的的突变α亚基。在一个实施例中，含有一个或多个相对于野生型TSH的氨基酸取代的突变β亚基与hCG的羧基末端延长肽(CTEP)共价结合。含有hCGβ亚基羧基末端32个氨基酸的CTEP(如图3所示)与突变β亚基共价结合，优选突变β亚基的羧基末端与CTEP的氨基末端共价结合。β亚基和CTEP可以通过本领域任何已知方法共价结合，例如，通过肽键结合或通过能够在蛋白质的氨基末端和羧基末端之间形成共价键的异源双功能试剂结合，例如但不限于肽连接物。在一个优选实施例中，突变β亚基和CTEP经肽键连接。在各优选实施例中，突变β亚基-CTEP融合体可以含有选自βI58R、βE63R、和βL69R中的一个、两个、三个或更多的氨基酸取代。
在另一个实施例中，突变β亚基为融合的，即与α亚基共价结合，优选突变的α亚基(例如上述5.2部分中描述)。
本发明的突变β亚基具有功能活性，即能够表现与野生型β亚基有关的一种或多种功能活性。优选，突变β亚基能够与野生型或突变α亚基非共价联合，形成能够与TSHR结合的TSH异二聚体。优选，该TSH异二聚体还能够引发信号传导。更优选，该含有突变β亚基的TSH异二聚体具有比野生型TSH的生物活性更高的体外生物活性和/或体内生物活性。本发明试图将一种以上突变组合到一个突变β亚基中，以制备生物活性相对于野生型TSH明显增加的突变TSH异二聚体。本发明人发现一个亚基中存在多个突变和增加TSH异二聚体半衰期的修饰(即β亚基-CTEP融合体和/或β亚基-α亚基融合体)能够协同作用，获得高于突变和长效作用修饰单独促进活性增加之和的生物活性。
突变β亚基可以通过本领域已知方法检测所需的活性，包括但不限于5.8部分中描述的分析法。
5.3突变的TSH异二聚体和TSH类似物本发明提供了含有一个突变α亚基和一个突变β亚基的突变人TSH异二聚体和人TSH类似物，其中突变α亚基含有一个或多个氨基酸取代，优选定位在或靠近α亚基β发夹L1环中(如5.1部分中所述)，突变β亚基含有一个或多个氨基酸取代，优选定位在或靠近β亚基β发夹L3环中(如5.2部分中所述)，该异二聚体或类似物还被修饰，以增加血清半衰期(例如，β亚基-CTEP融合体或α亚基-β亚基融合体)。可以在选自人α亚基氨基酸序列8-30，优选11-22位的氨基酸残基中制备一个或多个氨基酸取代的突变α亚基。可以在选自人TSHβ亚基氨基酸序列52-87位，优选58-69位的氨基酸残基中制备一个或多个氨基酸取代的突变TSHβ亚基。该突变TSH的非限制性实例包括如上述的突变α亚基——α4K，和突变β亚基——β3R构成的异二聚体。
在一个实施例中，本发明提供了含有α亚基，优选突变的α亚基和β亚基，优选突变的β亚基的TSH异二聚体，其中突变α亚基或突变β亚基与hCGβ亚基的CTEP融合(如5.2部分所述)。名词“融合蛋白质”本文中指两种肽经共价结合形成的蛋白质。共价结合包括本领域已知的将两种肽的氨基末端和羧基末端分别共价连接起来的任何方法，该方法包括但不限于经肽键连接或经异源双功能试剂连接，例如但非限制，肽连接物。在一个优选实施例中，突变TSH异二聚体可以含有一个突变的人α亚基和一个突变的人TSHβ亚基，其中突变的人TSHβ亚基在其羧基末端与CTEP的氨基末端共价连接。
本发明还涉及含有突变人α亚基共价结合于突变人TSHβ亚基(如前面所述的β亚基-CTEP融合体)的单链人TSH类似物，其中突变α亚基和突变人TSHβ亚基在各自亚基的氨基酸序列中分别含有至少一个氨基酸取代。在一个优选实施例中，突变β亚基经肽连接物与突变α亚基连接。在一个更为优选的实施例中，所述肽连接物是丝氨酸/脯氨酸含量较高并缺乏明显二级结构的hCG的CTEP。
优选的突变α亚基(优选在或靠近α亚基β发夹L1环中含有单个或多个氨基酸取代(如前面5.1部分所述))共价结合于突变β亚基(优选在或靠近β亚基β发夹L3环中含有一个或多个氨基酸取代(如前面5.2部分所述))。
在一个实施例中，在选自人TSHβ亚基氨基酸序列52-87位，优选58-69位的氨基酸残基中含有至少一个氨基酸取代的突变人TSHβ亚基在其羧基末端共价结合于野生型人TSHα亚基或至少含有一个氨基酸取代的突变TSHα亚基(其中一个或多个取代优选选自人α亚基氨基酸序列8-30位，优选11-22位的氨基酸残基)。
突变α亚基或突变人TSHβ亚基可以缺乏各自的信号序列。
本发明还提供了人TSH类似物，其含有与CTEP共价结合的突变人TSHβ亚基，它又与突变α亚基共价结合，其中突变α亚基和突变人TSHβ亚基在各自亚基的氨基酸序列中各自包含至少一个氨基酸取代。
在一个具体实施例中，突变β亚基-CTEP融合体与突变α亚基共价结合，使突变β亚基的羧基末端通过hCG的CTEP连接到突变α亚基的氨基末端。优选，突变β亚基的羧基末端与CTEP的氨基末端共价结合，CTEP的羧基末端与无信号肽的突变α亚基的氨基末端共价结合。
因此，在一个具体实施例中，人TSH类似物含有一个突变人TSHβ亚基(它在选自人TSHβ亚基氨基酸序列的58-69位氨基酸残基中至少含有一个氨基酸取代)，所述突变人TSHβ亚基的羧基末端与CTEP的氨基末端共价连接，所述羧基末端延长肽的羧基末端与至少含有一个氨基酸取代的突变α亚基的氨基末端共价连接(其中突变α亚基中的一个或多个取代位于选自人α亚基氨基酸序列11-22位的氨基酸残基中)。
在另一个优选实施例中，突变TSH异二聚体含有在人α亚基序列的22位具有一个氨基酸取代的突变α亚基(如图1所示(SEQ ID No1))，优选用碱性氨基酸(例如精氨酸、赖氨酸，不太优选组氨酸)，更优选用精氨酸取代。
在具体实施例中，如上述含有至少一个突变亚基或单链TSH类似物的突变TSH异二聚体具有功能活性，即，能够表现与野生型TSH有关的一种或多种功能活性，例如与TSHR结合、TSHR信号传导和胞外分泌。优选，突变TSH异二聚体或单链TSH类似物能够与TSHR结合，优选比野生型TSH具有更高的亲合力。还优选该突变TH异二聚体或单链TSH类似物能够引发信号传导。最优选的是，本发明的含有至少一个突变亚基或单链TSH类似物的突变TSH异二聚体具有比野生型TSH更强的体外生物活性和/或体内生物活性，并具有比野生型TSH更长的血清半衰期。本发明的突变TSH异二聚体和单链TSH类似物可以通过本领域已知的方法检测所需的活性，包括但不限于，5.8部分描述的分析法。突变TSH异二聚体的working examples在第6部分中描述。
5.4编码突变TSH和类似物的多核苷酸本发明还涉及含有本发明的人TSH突变亚基和TSH类似物的编码序列的核酸分子，其中所述序列含有至少一个碱基插入、缺失或取代，或者它们的组合，其导致相对于野生型TSH具有单个或多个氨基酸加入、缺失和取代。优选碱基突变不改变编码区的读码框。如本文所用，当说到两个编码区融合，即一个核酸分子的3′端连接到另一个核酸分子的5′端上(或通过肽连接物的编码核酸连接)，使翻译从一个核酸分子的编码区进入另一个核酸分子，而不需要移码。
由于编码序列的核苷酸的简并性，编码与突变α或β亚基相同氨基酸序列的任何其它DNA序列可以用于本发明的实践。它们包括但不限于含有全部或部分α或β亚基编码区的核苷酸序列，它们由不同的密码子取代而改变，这些取代密码子编码序列中同样的氨基酸残基，因此产生沉默突变。
在一个实施例中，本发明提供了含有突变α亚基编码序列的核酸分子，其中突变α亚基包括一个或多个氨基酸取代，取代优选定位在或靠近α亚基β发夹L1环中(如5.1部分所述)。在一个具体实施例中，本发明提供了编码突变α亚基的核酸，所述突变α亚基在α亚基氨基酸序列的22位具有一个氨基酸取代，如图1所示(SEQ ID NO1)，优选用碱性氨基酸取代，更优选用精氨酸取代。本发明进一步提供了含有突变β亚基编码序列的核酸分子，所述突变β亚基含有一个或多个氨基酸取代，所述取代优选定位在或靠近β亚基β发夹L3环中，和/或与CTEP共价连接(如5.2部分所述)。
再一个实施例中，本发明提供了含有单链TSH类似物(例如5.3部分中所述的)的编码序列的核酸分子，其中突变α亚基(优选在或靠近α亚基β发夹L1环中含有一个或多个氨基酸取代)的编码区与突变β亚基(优选在或靠近β亚基β发夹L3环中含有一个或多个氨基酸取代)的编码区融合。还提供了编码单链TSH类似物的核酸分子，其中突变β亚基的羧基末端通过hCGβ亚基的CTEP连接到突变α亚基的氨基末端上。在一个优选实施例中，核酸分子编码单链TSH类似物，其中突变β亚基的羧基末端与CTEP的氨基末端共价结合，CTEP的羧基末端与突变α亚基的氨基末端共价结合，而不需要信号肽。
本发明的单链类似物可以用本领域已知的方法将适当编码框中的突变α和β亚基的编码核酸序列彼此连接起来，然后用本领域普遍已知的方法表达该融合蛋白制备。或者，可以用蛋白质合成技术制备融合蛋白质，例如，应用肽合成器。
5.5突变TSH亚基和类似物的制备本发明的突变α亚基、突变β亚基、突变TSH异二聚体、TSH类似物、单链类似物、衍生物及其片段的制备在本发明的范围内。下面将描述制备上述物质的方法。
5.5.1 TSH基因克隆编码人共有α亚基的基因和cDNA的核苷酸序列已有公开(Fiddes和Goodman，1979，自然，281351-356；Fiddes和Goodman，1981，分子应用遗传学杂志(J.Mol.Appl.Gen.)13-18)，以及编码人TSHβ亚基的基因和cDNA的核苷酸序列也有公开(Hayashizaki等1985，FEBS论文集(FEBS Lett.)88394-400；Wondisford等，1988，生物化学杂志(J.Bio.Chem.)26312538-12543；Wondisford等，1988，分子内分泌学(Mol.Endocrinol.)232-39)。
上述亚基的编码区可以通过本领域已知的标准程序从克隆DNA(例如，DNA“文库”)得到，可以通过化学合成得到，可以通过cDNA克隆得到，或者通过基因组DNA或其片段的克隆得到，然后从所需的细胞中纯化出来(参见，例如，Sambrook等，1989，分子克隆，实验室手册，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，纽约；Glover，D.M.(编)，1985，DNA克隆实践研究，MRL Press，Ltd.，Oxford，U.K.第I，II卷)。可以用聚合酶链反应(PCR)在基因组文库或cDNA文库中扩增编码共有α或TSHβ亚基的序列。合成低聚核苷酸可以用作PCR引物，扩增来源于文库(RNS或DNA，优选cDNA文库)的序列。被扩增的DNA可以包括任何来源于人的cDNA或基因组DNA。成功分离或扩增亚基的DNA片段后，可以分子克隆所述片段，并测序，然后将其用作探针分离完全cDNA或基因组克隆。因此，这将能够对该基因的核苷酸序列进行鉴定，并生产其蛋白质产物，用于如下文所述的功能性分析和/或治疗或诊断用途。
分离亚基编码区的替换方式包括但不限于，从已知的序列化学合成自身的基因序列。其它的方法是可能的，也在本发明范围内。上述方法不意味着限制下列可以用来制备激素亚基突变体的方法的一般性描述。
经鉴定并分离出的基因可以插入合适的用于扩增该基因序列的克隆载体。可以使用本领域已知的大量载体-宿主系统。可能的载体包括但不限于，质粒或改良病毒，但是载体系统必须与使用的宿主细胞相容。这些载体包括但不限于，噬菌体例如λ衍生物，或者质粒例如pBR322或pUC质粒衍生物或BLUESCRIPT载体(Stratagene)。可以，例如，通过将DNA片段连接到具有互补粘性末端的克隆载体中实现向克隆载体中的插入。然而，如果克隆载体中不存在用于切断DNA的互补限制性位点，那么可以用酶修饰该DNA分子的末端。或者，可以通过将核苷酸序列(连接物)连接到DNA末端制备任何需要的位点；这些连接上的连接物可以含有特定的化学合成的编码限制性核酸内切酶识别序列的低聚核苷酸。在一种替换方法中，切割载体和突变亚基的基因可以用均聚物尾巴修饰。可以将重组分子经转化、转染、感染、电融合等导入宿主细胞，从而产生该基因序列的一些拷贝。
在一种替换方法中，可以将需要的基因插入适当的“鸟枪”研究中的克隆载体后，再鉴定和分离该需要的基因。在将需要的基因插入克隆载体之前，可以通过，例如，尺寸分级分离，浓缩需要的基因。
在具体实施例中，用含有突变亚基基因、cDNA、或合成DNA序列的重组DNA分子转化宿主细胞能够产生该基因的多拷贝。因此，可以通过使转化体生长、从转化体中分离重组DNA分子、和如果需要，从分离的重组DNA中回收插入基因，来得到大量该基因。该基因的拷贝用于诱变实验，以便研究突变亚基、TSH异二聚体和TSH类似物的结构和功能。
5.5.2 诱变本发明的突变α或β亚基、突变TSH异二聚体、TSH类似物、单链TSH类似物中的存在的突变可以通过本领域已知的多种方法产生。导致上述突变产生的操作可以发生在基因水平或蛋白质水平。例如，亚基的克隆编码区可以用本领域已知的大量方法中的任何一种修饰(Sambrook等，1990，分子克隆，实验室手册，第二版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，纽约)。可以用限制性核酸内切酶在序列的适当位点切割，如果需要进一步用酶修饰，随后分离、体外连接。在制备突变亚基时，需要注意确保在编码亚基的基因区中经修饰的基因保留在同一个翻译读码框中，未被翻译终止信号间隔。
另外，可以在体外或体内使编码亚基的核酸序列突变，以便在编码区中发生变异(例如，氨基酸取代)，和/或产生和/或破坏翻译序列、起始序列、和/或终止序列，和/或形成新的限制性核酸内切酶位点或破坏先前存在的酶切位点，以促进进一步的体外修饰。可以使用本领域已知的任何诱导突变的技术，包括但不限于，化学诱变、体外定点诱变(Hutchinson，C.，等，1978，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2536551)，基于PCR的重叠延伸(Ho等，1989，基因，7751-59)，基于PCR的大引物诱变(Sarkar等，1990，生物技术，8404-407)等。可以通过双链二脱氧DNA测序，确定突变的发生。
亚基中的一个或多个氨基酸残基可以用另一种氨基酸取代，优选用不同性质的氨基酸，以便产生一些功能上的差别。序列中氨基酸的取代可以选自不同于该氨基酸所属类别的其它类别中的成员。非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺。正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
突变亚基序列的操作也可以在蛋白质水平进行。翻译中或翻译后进行其它修饰(例如糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白质水解分裂、连接到抗体分子或其它类型的细胞配体上等)的突变亚基、突变TSH异二聚体、TSH类似物、单链类似物包括在本发明的范围内。可以用已知技术进行任意种类的化学修饰，包括但不限于用溴化氰、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4进行特定的化学分裂；乙酰化、甲酰化、氧化、还原；存在衣霉素下进行代谢合成；等。
另外，可以化学合成突变亚基和TSH类似物。例如，含有需要突变区的突变亚基部分对应的肽可以用肽合成仪合成。另外，如果需要，非典型氨基酸或化学氨基酸类似物可以通过取代或添加引入突变亚基序列中。非典型氨基酸包括但不限于常见氨基酸的右旋-异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基已酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯甘氨酸、环己烷丙氨酸、β-丙氨酸、氟丙氨酸、设计的氨基酸例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸、和一般的氨基酸类似物。另外，氨基酸可以是D(右旋)或L(左旋)的。
在具体实施例中，突变亚基或TSH类似物是融合蛋白质，它或者含有，例如但不限于，突变β亚基和hCGβ亚基的CTEP，或者含有突变β亚基和突变α亚基。在一个实施例中，该融合蛋白质通过突变亚基或野生型亚基的编码核酸在读码框内与另一个蛋白质(例如但不限于毒素，例如篦麻毒素或白喉毒素)的编码序列连接，并重组表达制备。可以将若干合适的编码所需氨基酸序列的核酸序列用本领域已知的方法在适当的读码框中彼此连接起来，并用本领域已知的常规方法表达该融合蛋白质，以制备该融合蛋白质。或者，可以用蛋白质合成技术，例如，应用肽合成仪制备该融合蛋白质。可以构件含有与任何异源蛋白质融合的突变α和/或β亚基的编码序列的嵌合基因。一个具体的实施例涉及含有融合了突变β亚基的突变α亚基的单链类似物，优选在α亚基和突变β亚基之间具有肽连接物。
5.6 突变亚基基因的表达编码TSH突变亚基，或者其功能活性类似物或片段或其它衍生物(参见5.4部分)的核苷酸序列可以插入合适的表达载体，即，含有必要的转录和翻译插入蛋白质编码序列的元件的载体。必要的转录和翻译信号也可以由自身的共有α亚基的cDNA或基因提供、或由人TSHβ亚基的cDNA或基因提供，和/或由这两种基因的各自旁侧基因组序列提供。可以应用大量宿主-载体系统表达蛋白质编码序列。它们包括但不限于病毒(例如，牛痘病毒、腺病毒等)感染的哺乳动物细胞系统；病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物例如含有酵母载体的酵母。载体的表达元件在强度和特异性方面存在差异。根据应用的宿主-载体系统不同，可以使用任何一种适当的转录和翻译元件。在具体实施例中，突变的人α亚基编码区和/或人突变TSHβ亚基编码区，或突变的、各突变亚基的功能活性部分的编码序列得以表达。
以前描述过的将DNA片段插入载体的任何方法都可以用于构建含有由适当转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列组成的嵌合基因的表达载体。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术和体内重组体(基因重组)。编码突变α亚基和/或突变TSHβ亚基或其肽片段的核苷酸序列的表达可以通过第二核苷酸序列调节，以使一种或多种突变亚基或肽在重组DNA分子转化的宿主中表达。例如，突变α亚基和/或突变TSHβ亚基或其肽片段的表达可以用本领域已知的任何启动子/增强子元件调控。可以使用的启动子包括但不限于SV40早期启动子区(Bemoist和Chambon，1981，自然290304-310)，劳氏肉瘤病毒的3′长末端重复序列中含有的启动子(Yamamoto等，1980，细胞22787-797)，疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，美国国家科学院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)781441-1445)，金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等，1982，自然29639-42)。
在一个具体实施例中，使用的载体含有与突变α亚基或突变TSHβ亚基或二者的编码区有效地连接的一个或多个启动子，一种或多种复制起点，以及任选的一种或多种可选择标识子(例如抗生素抗性基因)。优选在同一个真核宿主细胞中表达这两种亚基，因为这种共表达有利于适当的装配和功能性TSH异二聚体的糖基化。因此，在一个优选实施例中，用这样的表达载体将突变α和突变β亚基表达到一个宿主细胞中。各突变亚基的编码区可以克隆到不同的载体中；再将载体先后或同时导入一种宿主细胞。或者，可以将两种亚基的编码区插入一种有效地连接有适当启动子的载体。可以筛选对插入序列的表达进行调节，或者以所需的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株系。在存在某些诱导子的情况下可以促进某些启动子引起的表达；因此，可以调控基因工程构建的突变亚基的表达。另外，不同的宿主细胞具有不同的翻译和翻译后加工及修饰的特征和特定机制(例如，蛋白质的糖基化、磷酸化)。可以选择适当的细胞系或宿主系统，以确保对表达出的外源蛋白质进行所需的修饰和加工。在哺乳动物细胞中的表达可以保证异源蛋白质的“天然”糖基化。另外，不同的载体/宿主表达系统可以不同程度地影响加工反应。
一旦对表达突变TSHα和/或β亚基基因序列的重组宿主细胞鉴定后，即可分析基因产物。这可以通过基于产物的物理或功能特征的分析法实现，方法包括对产物进行放射性标记，然后用凝胶电泳免疫法分析等。
5.7 突变亚基及其类似物的抗体制备按照本发明，突变α和β亚基、突变TSH异二聚体、TSH类似物、单链TSH类似物、其片段或它的其它衍生物可以用作免疫原，制备与该免疫原免疫特异性结合的抗体。该抗体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、和Fab表达文库。在一个具体实施例中，制备了突变TSH的抗体。在另一个实施例中，制备了突变α或β亚基区的抗体。
可以用本领域已知的多种方法制备突变α和β亚基、突变TSH异二聚体、TSH类似物、单链TSH类似物、其片段或它的其它衍生物的多克隆抗体。为了制备抗体，可以通过注射亚基、异二聚体、单链类似物、及其衍生物免疫多种宿主动物，这些宿主动物包括但不限于兔、小鼠、大鼠等。可以根据宿主动物的种类使用多种佐剂，以加强免疫反应，这些佐剂包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)，矿物胶例如氢氧化铝，表面活性剂例如溶血卵磷脂、普流罗尼多元醇、多聚阴离子、多肽、油型乳剂、钥孔血蓝素、二硝基酚，以及潜在有用的人类佐剂例如BCG(Calmette-Guerin杆菌)和小棒状杆菌。
为了制备定向突变α和β亚基、突变TSH异二聚体、TSH类似物、单链TSH类似物、其片段或它的其它衍生物的单克隆抗体，可以使用能够使培养中的连续细胞系产生抗体分子的任何技术。例如，最早由Kohler和Milstein(1975，自然256495-497)研制出的杂交瘤技术，和trioma技术，人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，今日免疫学(Immunology Today)472)，以及制备人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等，1985，单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies andCancer Therapy)，Alan R.Liss，Inc.，77-96页)。在本发明另一个实施例中，可以用最新的技术(PCT/US90/02545)在无菌状态下出生的动物体内制备单克隆抗体。按照本发明，可以使用人抗体，并可以利用人杂交瘤得到人抗体(Cote等，1983，美国国家科学院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)802026-2030)，或者用EBV病毒体外转化的人B细胞得到人抗体(Cole等，1985，单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy)，Alan R.Liss，Inc.，77-96页)。事实上，按照本发明，可以使用研究出的通过连接鼠抗体分子表位特异性基因和具有适当生物活性的人抗体分子基因制备“嵌合抗体”的技术(Morrison等，1984，美国国家科学院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)816851-6855；Neuberger等，1984，自然312604-608；Takeda等，1985，自然314452-454)；该抗体在本发明范围内。
按照本发明，报道的制备单链抗体的技术适用于制备抗TSH亚基、异二聚体、单链类似物、或其片段或衍生物的特异性单链抗体。本发明的另一个实施例应用了报道的构建Fab表达文库的技术(Huse等，1989，科学2461275-1281)，以便快速简便地鉴定具有需要特异性的单克隆Fab片段。
可以通过已知技术制备含有分子的个体基因型的抗体片段。例如，该片段包括但不限于用胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab′)2片段；通过还原F(ab′)2片段中的二硫键产生的Fab′片段，通过用胃蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段，以及Fv片段。
在抗体的制备中，可以用本领域已知技术筛选所需的抗体，例如ELISA(酶联免疫吸收法)。例如，为了筛选识别突变亚基的特异区域的抗体，可以分析与含该区的突变亚基片段结合的产物产生的杂交瘤。为了筛选特异性结合突变亚基或单链类似物而不特异性结合野生型TSH的抗体，可以选择与突变体结合阳性，而与野生型蛋白质结合缺乏的抗体。还提供了突变亚基、突变TSH或单链类似物片段的特异性抗体。
上述抗体可以应用于本发明的突变亚基、突变TSH或单链类似物的本领域已知的定位和确定活性的方法中，例如，描述这些蛋白质的图象、测定它们在适当生理样品中的浓度，在诊断方法中的应用等。
5.8 突变TSH亚基的分析本文描述了确定突变TSH亚基、突变异二聚体和TSH类似物的结构的方法，以及分析上述物质体外活性和体内生物功能的方法。
突变α或TSHβ亚基经鉴定后，即可用标准方法分离和纯化，所述方法包括色谱法(例如离子交换柱色谱法、亲合柱色谱法、尺寸排阻柱色谱法)、离心、差示溶解、或使用任何其它纯化蛋白质的标准方法。可以利用任何适当的分析法(包括下文描述的免疫分析法)评价功能特性。
或者，通过重组宿主细胞制备出突变α亚基和/或TSHβ亚基后，可以用蛋白质测序的标准方法确定亚基的氨基酸序列，方法例如，自动化氨基酸测序仪。
可以通过亲水性分析对突变亚基序列进行特征分析(Hopp，T.和Woods，K.，1981美国国家科学院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)783424)。可以用亲水谱鉴定亚基的疏水区和亲水区，以及编码这些区的相应基因区。
还可以进行二级结构分析(Chou，P.和Fasman，G.，1974，生物化学13222)，以鉴定亚基的假定二级结构区域。
还可以使用其它的结构分析方法。它们包括但不限于X-射线结晶学(Engstom，A.，1974，Biochem.Exp.Biol.117-13)和计算机模型(Fletterick，R.和Zoller，M.编，1986，计算机图形和分子模型，分子生物学当前交流(Current Communications in Molecular Biology)，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，纽约)。结构预测、结晶数据分析、序列排列比较、以及同源性模型也可以用本领域应用的计算机软件程序完成，例如BLAST，CHARMm(Convex发布的21.2版本)和QUANTA v.3.3(Molecular Simulations，Inc.，York，UnitedKingdom)。
突变α亚基、突变β亚基、突变TSH异二聚体、TSH类似物、单链类似物、其衍生物和片段的功能活性可以通过本领域已知的多种方法分析。
例如，如果需要分析突变亚基或突变TSH与野生型TSH或其亚基在与抗体结合方面的结合或竞争能力时，可以使用本领域已知的多种免疫分析法，包括但不限于例如下述技术进行的竞争性和非竞争性分析系统，例如放射性免疫分析法、ELISA(酶联免疫吸收剂分析法)、“三明治”免疫法、免疫辐射测定法、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散法、原位免疫法(例如用胶态金，酶或放射性同位素标记)、western印记法、沉淀反应、凝集分析(例如，凝胶凝集分析、红血球凝聚分析)，补体固定分析、免疫荧光分析、蛋白A分析、和免疫电泳分析等。结合的抗体可以通过检测初级抗体上的标记确定。或者，通过检测二级抗体或试剂与初级抗体的结合，确定初级抗体，特别是当二级抗体被标记时更是如此。在免疫分析中检测结合的某些方法是本领域已知的，也在本发明范围内。
突变α亚基、突变β亚基、突变TSH异二聚体、TSH类似物、单链类似物、其衍生物和片段与促甲状腺激素受体(TSHR)的结合可以通过本领域公知方法确定，例如但不限于基于从另一物种的放射性标记TSH(例如牛TSH)的TSHR中替换的体外分析，例如但不限于，Szkudlinski等所述的方法(1993，内分泌学(Endocrinol.)1331490-1503)。还可以测定突变TSH异二聚体、TSH类似物、单链类似物、其衍生物和片段的生物活性，例如，基于环AMP刺激的细胞中TSHR的表达分析，例如但不限于下述6.2.3部分中所述的分析法和Grossmann等描述的分析法(1995，分子内分泌学(Mol.Endocrinol.)9948-958)；以及刺激甲状腺细胞摄取胸苷，例如但不限于Szkudilinski等的描述(1993，内分泌学(Endocrinol.)1331490-1503)。
体内生物活性可以通过在动物细胞模型中结合TSHR的生理相关性确定，例如East-Palmer等所述(1995，甲状腺555-59)和前面6.2部分所述。例如，预先给白化病瑞士CrlCF-1小鼠在引用水中加入3μg/ml T3，连续给药6天，以抑制内源性TSH，然后腹膜内注射野生型TSH和突变TSH。6小时侯从眼眶窦收集血样，用化学发光分别测定血清T4和TSH水平(Nichols Institute)。
蛋白质的半衰期是蛋白质稳定性的测量指标，表明蛋白质浓度减少一半所需要的时间。可以用测定受试者一段时间内样品中TSH水平的任何方法测定突变TSH的半衰期，例如但不限于，突变TSH给药后用抗TSH抗体测定一段时间取到的样品中突变TSH水平的免疫分析法，或者放射性标记突变TSH给药后检测取自受试者的样品中的放射性标记突变TSH的免疫分析法。
其它方法将是本领域技术人员已知的，并在本发明范围内。
5.9诊断和治疗用途本发明通过给药本发明的治疗化合物，治疗或预防各种疾病和病症(本文定义为治疗剂)。该治疗剂包括具有如图1(SEQ ID NO1)所述在α亚基的22位具有至少一个氨基酸取代的突变α亚基和一个突变或野生型β亚基构成的TSH异二聚体；优选在或靠近L1环中(如图1(SEQ ID NO1)所述8-30位的氨基酸)具有一个或多个氨基酸取代的突变α亚基和优选在或靠近L3环中(如图2(SEQ ID NO2)所述52-87位的氨基酸)具有一个或多个氨基酸取代的突变β亚基和共价结合hCGβ亚基的CTEP构成的TSH异二聚体；优选在或靠近L1环中具有一个或多个氨基酸取代的突变α亚基和优选在或靠近L3环中具有一个或多个氨基酸取代的突变β亚基构成的TSH异二聚体，其中突变α亚基和突变β亚基共价结合成单链类似物，也包括突变α亚基和突变β亚基和hCGβ亚基的CTEP共价结合成单链类似物，其它衍生物、它们的类似物和片段(例如，本文前面描述的那些)，以及编码本发明突变TSH异二聚体、衍生物、类似物、及其片段的核酸。
上述治疗剂施用的受体优选动物，包括但不限于例如牛、猪、马、鸡、狗等，还优选哺乳动物。在一个优选实施例中，受体是人。通常优选用于给药的产品的来源物种与受体属于同样的物种。因此，在一个优选实施例中，人突变和/或修饰TSH异二聚体、衍生物或片段、或核酸用于给人类患者治疗或预防或诊断目的的给药。
在一个优选方面，本发明的治疗剂基本上是纯的。
一些表明是甲状腺功能低下的疾病可以用本发明的方法治疗。TSH水平相对于正常或理想水平缺乏或低下的疾病通过本发明突变TSH异二聚体或TSH类似物的给药来治疗或预防。TSH受体相对于正常水平缺乏或低下或者比正常TSHR对野生型TSH应答反应低的疾病也可以通过突变TSH异二聚体或TSH类似物的给药治疗。组成活性的TSHR会导致甲状腺功能亢进，突变TSH异二聚体和TSH类似物可望用作拮抗剂。
在具体实施例中，能够刺激分化的甲状腺功能的突变TSH异二聚体或TSH类似物用于治疗以及预防给药。可以被治疗或预防的疾病或病症包括但不限于甲状腺功能低下、甲状腺功能亢进、甲状腺扩张、甲状腺癌、良性甲状腺肿、甲状腺增大，凋亡的甲状腺细胞的保护等。
TSH蛋白或功能、或者TSHR蛋白和功能水平的缺乏或降低可以容易地检测出来，例如，通过提取患者组织样品(例如活检组织)，体外分析其中的RNA或蛋白质水平、表达出的TSH或TSHR的RNA或蛋白质的结构和/或活性。因此可以使用本领域的一些标准方法，包括单不限于检测和/或显示TSH或TSHR蛋白的免疫分析法(例如，Western印记法、十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳之后的免疫沉淀、免疫化学分析等)和/或通过检测和/或显示TSH或TSHR的mRNA杂交分析检测TSH或TSHR的表达(例如、Northern分析，斑点印迹、原位杂交等)，等。
在具体实施例中，本发明的治疗剂用于治疗甲状腺癌。在放射性碘治疗性消融之前，用突变TSH异二聚体和类似物刺激甲状腺组织和转移性组织。例如，在给甲状腺癌患者使用用于放射性消融的放射性标记碘之前，预先使用本发明的突变TSH异二聚体。本发明的治疗剂还可以在用放射性消融治疗多节性甲状腺肿之前，用于刺激良性多节性甲状腺肿摄取碘，或者在用放射性消融治疗甲状腺扩大之前，用于刺激甲状腺组织摄取碘。
具体地说，放射性消融治疗通过给用本发明的治疗剂进行，优选肌肉内给药该治疗剂，一到三个单剂量为一个疗程，例如但不限于，一到两天一个剂量，或者在七天的疗程中分别于第一天、第四天和第七天给用一个剂量。剂量可以是如下文5.10部分所述的任何适当剂量，例如但不限于约10μg到1mg一个剂量，优选约10μg到100μg一个剂量。疗程的最后一个剂量给药后当天，给受试者使用治疗癌症、非癌性甲状腺肿或甲状腺扩大的足够量的放射性标记碘，优选131I。放射性标记碘的用量依赖于疾病的种类和严重程度。通常治疗甲状腺癌131I的用量为30到300mCi。
在另一个具体实施例中，本发明的突变TSH异二聚体可以用于靶向传送甲状腺治疗剂或甲状腺癌细胞治疗剂，例如，靶向给药用于基因治疗的核酸(例如靶向给药治疗甲状腺癌细胞的肿瘤抑制剂基因)或者靶向给药毒素，例如但不限于，篦麻毒素、白喉毒素等。
本发明进一步提供了诊断、预防、筛选甲状腺癌症，优选甲状腺癌的方法，以及检测性治疗甲状腺癌症的方法，例如，通过给用本发明的TSH异二聚体。在具体实施例中，给受试者使用本发明的治疗剂，刺激甲状腺细胞(包括甲状腺癌症细胞)摄取碘(优选放射性标记碘，例如但不限于131I或125I)和/或刺激甲状腺球蛋白从甲状腺细胞(包括甲状腺癌细胞)分泌。给用该治疗剂后，可以给患者使用放射性标记碘，然后检测受试者体内放射性标记碘的存在和定位(即甲状腺细胞)(例如但不限于全身扫描)和/或测定或检测受试者体内甲状腺球蛋白的水平，其中与未患甲状腺癌症或病症的患者体内水平或标准水平相比，放射性碘摄取的增加或甲状腺球蛋白分泌水平的增加表明受试者患有甲状腺癌。某些受试者可能接受甲状腺切除或甲状腺组织消融治疗，甲状腺组织较少或没有残留。对于这些受试者或者非癌性甲状腺细胞缺乏的任何其它受试者，检测到碘摄取或甲状腺球蛋白分泌(高于甲状腺切除或消融治疗后或者任何其它原因导致的甲状腺组织失去后保留的所有残存水平)表明存在甲状腺癌细胞。吸收的放射性标记碘在受试者体内的定位可以用于检测疾病或恶性肿瘤的扩散或转移。另外，本发明的诊断方法可以用于通过测定治疗过程中放射性标记碘或甲状腺球蛋白水平的改变或者通过检测甲状腺瘤或甲状腺转移的扩展或增长，监测甲状腺癌症的治疗。
具体地说，诊断方法如下进行，给药本发明的治疗剂，优选肌肉内给药，疗法为一到三个剂量，例如但不限于，每天一剂量，连续两天，或者第一、第四和第七天分别给药一剂量的七天疗法。剂量为下面5.10部分所述的任何适当剂量，例如但不限于一剂量约为10μg到1mg，优选一剂量约为10μg到100μg。所述疗法最后一剂量给药后的当天，给受试者使用检测甲状腺细胞(包括癌细胞)足够量的放射性标记碘，优选131I，通常给药1-5mCi的131I以诊断甲状腺癌。放射性碘给药后两天，通过，例如但不限于，全身放射性碘扫描，检测患者体内放射性标记碘的摄取和/或在患者体内的定位。或者，对于全部或大部分甲状腺组织除去的病例(例如，早先接受甲状腺切除或甲状腺组织消融治疗的的患者)，可以在本发明治疗剂最后一剂量给药后的2-7天内测定甲状腺球蛋白的水平。可以用本领域已知的任何方法测定甲状腺球蛋白，包括应用特异于甲状腺球蛋白的免疫放射测量法(该分析法是本领域已知方法)。
本发明的TSH异二聚体还可以用于TSH结合抑制分析，测定TSH受体的自身抗体，例如，如Kakinuma等的所述(1997，临床内分泌代谢杂志(J.Clin.Endo.Met.)822129-2134)。抗TSH受体的抗体涉及某些甲状腺疾病，例如但不限于格雷夫斯病和桥本甲状腺炎；因此，这些结合抑制分析可以用于诊断例如格雷夫斯病和桥本甲状腺炎等的甲状腺疾病。简单地说，含TSH受体的细胞或膜于待测TSHR抗体的样品接触，然后与放射性标记的本发明突变TSH接触，放射性标记的本发明突变TSH的结合相对于无待测样品时放射性标记突变TSH与细胞或膜结合的抑制作用表明待测样品含有与TSH受体结合的抗体。应用比野生型TSH具有更高生物活性的本发明突变TSH异二聚体的结合抑制分析比应用野生型TSH的结合抑制分析对抗-TSH受体的抗体灵敏度更高。
因此，本发明的实施例提供了诊断或筛选特征在于存在TSHR抗体的疾病或病症(优选格雷夫斯病)的方法，包括使含TSH受体的培养细胞或分离膜与来自受试者(推测含有抗体)的样品接触，然后与诊断有效量的放射性标记的本发明突变TSH异二聚体接触；测定放射性标记突变TSH与培养细胞或分离膜的结合，其中放射性标记TSH的结合相对于缺乏所述样品或在未患所述疾病或病症的相似样品存在下的结合有所降低，表明患有所述疾病或病症。
突变异二聚体和类似物还可以用于检测自主甲状腺结节机能亢进患者或接受外源性甲状腺激素治疗的患者体内被抑制、但属功能性的甲状腺组织的诊断方法。突变TSH异二聚体和TSH类似物可以有其它应用，例如但不限于诊断中心性和初级和中心性的组合甲状腺机能减退、甲状腺单侧萎缩、和TSH作用的抗性。
5.10 药物组合物本发明提供了诊断方法和治疗方法，具体为给受试者给药有效量的本发明治疗剂。在一个优选方面，治疗剂基本上是纯化的。受试者优选动物，包括但不限于例如牛、猪、马、鸡、猫、狗等的动物，优选哺乳动物，最优选人。在一个具体方面，受试者是非人哺乳动物。
本发明的突变TSH异二聚体和TSH类似物优选进行体外试验，然后进行需要的体内试验，最后用于人。在各具体实施例中，可以用涉及患者病症的细胞类型的代表细胞(例如，甲状腺细胞)进行体外测试，测定是否突变TSH异二聚体或TSH类似物对所述细胞类型具有如前面5.8部分所述的理想效果。在对人试验之前，可以在适当的动物模型系统中测试化合物的治疗用途，包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔等。对于对人给药之前的体内试验，可以使用本领域已知的任何动物模型系统。
多种传递系统是已知的，可以用于给药本发明的突变TSH异二聚体或TSH类似物，例如，包封于脂质体、微粒、微囊、能够表达突变TSH异二聚体或TSH类似物的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见，例如，Wu和Wu，1987，生物化学杂志，2624429-4432)等。导入方法包括但不限于，真皮下、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、和口腔途径。可以用常规途径给药本化合物，例如灌输或浓注，通过上皮或粘膜衬层的吸收(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)，可以与其它生物活性物质一起给药。可以系统给药或局部给药。另外，通过任何合适途径包括心室内和鞘内注射将本发明的药物组合物导入中枢神经系统是理想的；心室内插管，例如连接储库(例如Ommaya储库)的插管有利于心室内注射。还可以应用肺部给药，例如，应用吸入器或喷雾器，与气雾剂一起配制。
在具体实施例中，将本发明的药物组合物局部给药到需要治疗的区域是理想的；这可以通过，例如但不限于，手术中局部灌注、通过导管的方法、通过栓剂的方法、或者通过移植物的方法，所述移植物为多孔、无孔、或凝胶状材料，包括膜(例如硅橡胶膜)或纤维。
在另一个实施例中，突变TSH异二聚体或TSH类似物可以置于载体中给药，具体地说是脂质体(参见Langer，科学2491527-1533(1990)；Treat等，脂质体在治疗感染性疾病和癌症中的应用(Liposomes in theTherapy of Infectious Disease and Cancer)，Lopez-Berestein和Fidler(编)，Liss，纽约，353-365页(1989)；Lopez-Berestein，同书，317-327页；一般参见同书)。
在一个实施例中，突变TSH异二聚体或TSH类似物可以置于控释系统中给药。在一个实施中，可以使用渗透泵(参见Langer，同上；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14201(1987)；Buchwald等，外科学(Surgery)88507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321574(1989))。在另一个实施例中，可以使用聚合材料(参见，控制释放的医学应用，Langer和Wise(编)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；控释药物的生物利用度，药品设计和性能(Controlled Drug Bioavailability，DrugProduct Design and Performance)，Smolen和Ball(编)，Wiley，纽约(1984)；Ranger和Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361(1983)；还参见Levy等，科学228190(1985)；During等，Ann.Neurol.25351(1989)；Howard等，J.Neurosurg.71105(1989))。再一个实施例中，可以将控释系统置于治疗靶区附近，因此仅需要系统剂量的一小部分(参见，例如，Goodson，控制释放的医学应用，同上，第2卷，115-138页(1984))。
Langer的综述中(科学2491527-1533(1990))探讨了其它控释系统。
在一个具体实施例中，可以将编码突变TSH异二聚体或TSH类似物的核酸体内给药，促进其编码蛋白质的表达，即通过将所述核酸构建成为适当核酸表达载体的一部分，然后将它给药，以便使它进入胞内，例如应用逆转录载体(参见，美国专利，4980286)，或者通过直接注射，或者使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)，或者用脂类或细胞表面受体或转染试剂涂层，或者连接于同源异形盒样肽(本领域已知能够进入细胞核)后给药(参见，例如，Joliot等，1991，美国国家科学院刊881864-1868)等。或者，可以通过同源重组将编码突变TSH异二聚体或TSH类似物的核酸分子导入胞内或整合到宿主细胞DNA中。
本发明还提供了药物组合物。该组合物含有治疗有效量的突变TSH异二聚体或TSH类似物，和药物可接受载体。在具体实施例中，术语“药物可接受”意味着经联邦或洲政府的调整机构批准或美国药典或其它普遍承认的药典中列出的可用于动物，特别是人。术语“载体”指稀释剂、助剂、赋形剂、或治疗药物利用其给药的载体。这些药物载体可以是无菌液体、例如水和油，油包括石油，动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。如果药物组合物静脉内给药，则水是优选载体。生理盐水和葡萄糖水和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是可注射溶液。适当的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白晋、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，该组合物还可以含有少量湿润剂或乳化剂，或者pH缓冲剂。这些组合物可以制成溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等剂型。该组合物可以用传统粘合剂和载体例如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂包括标准载体例如制剂级甘露糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。E.W.Martin的“Remington’s药物学”中记载了合适的药物载体的例子。该组合物将含有治疗有效量的突变TSH异二聚体或TSH类似物，优选为纯化形式，与适量载体混合，从而提供适于给患者用药的剂型。该制剂的配方应当与给药方式相适应。
在一个优选实施例中，按照适于对人静脉给药的药物组合物的常规方法配制该组合物。优选，用于静脉给药的组合物为无菌等渗缓冲水溶液。如果需要，该组合物还可以含有增溶剂和局麻药例如利诺卡因，以缓解注射部位的疼痛。通常，单独应用各成分，或者混合到单剂量剂型中，例如，作为冻干粉末或者无水浓缩物置于标明活性物质量的密封容器例如安瓿或小袋(sachette)中。当灌注给药该组合物时，可以分散于装有无菌药用水或盐水的灌注瓶。如果注射给药该组合物，可以使用用于注射的无菌水或生理盐水安瓿，以便给药前混合各成分。
本发明的突变TSH异二聚体或TSH类似物可以配制成中性或盐型。药物可接受盐包括通过游离氨基形成的盐，例如源于盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等的盐，和通过游离羧基形成的盐，例如源于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
在治疗特定疾病或病症中有效的本发明的突变TSH异二聚体或TSH类似物的量将依赖于疾病或症状的性质，它可以通过标准临床方法确定。另外，可以任选使用体外分析法和动物模型，有助于确定优选剂量范围。制剂中使用的精确剂量还将依赖于给药途径、疾病或病症的严重程度，应该按照执业医生的判断和各患者的病情确定。
在具体实施例中，本发明的治疗剂肌肉内给药。肌肉给药的适当剂量范围通常约为每剂量10μg到1mg，优选约为每剂量10μg到100μg。通常，对于给药突变TSH异二聚体刺激碘摄取的诊断和治疗方法，突变TSH异二聚体可以以1-3次注射的疗法给药。在一个实施例中，治疗剂给药两个剂量，其中第二剂量在第一剂量给药后24小时给药；在另一个实施例中，治疗剂给药三个剂量，即在第1、4和7天分别给药一个剂量的7天疗法。
有效剂量可以从体外或动物模型实验系统得到的量效曲线外推得到。
栓剂含有的活性成分的量通常在0.5％到10％重量百分比范围内；口服制剂优选含有10％到95％的活性成分。
本发明还提供了用于治疗或诊断的试剂盒，其中含有一个或多个装有一种或多种本发明药物组合物成份的容器。可以任意注明与这些容器有关的标注，它们按照药品或诊断品生产、使用或销售的政府调节机构规定的形式书写，该标注反应生产、使用或销售机构批准为人类给药。
6.实施例以下提供新突变TSH异二聚体的两个实施例。数据表明突变TSH异二聚体比野生型TSH具有更高的生物活性。
6.1 材料限制性酶、DNA报告基因和其它分子生物学试剂购自GibcoBRL(Gaithersburg，MD)或者Bohringer-Mannheim(Indianapolis，IN)。细胞培养基、胎牛血清、和LIPOFECTAMINE购自New EnglandBiolabs(Beverly，MA)。全长人αcDNA(840 bp)亚克隆到pcDNA I/Neo载体(Invitrogen，San Diego，CA)的BamHI/Xhol位点中，hCG-β基因得自T.H.Ji(Wyoming大学，Laramine，WY)。无第一内含子、具有不翻译的第一外显子和原始翻译起始位点的hTSH-β小基因由本发明人构建。重组人TSH标准品得自Genzyme(Framingham，MA)。稳定表达hTSH受体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(CHO-hTSHR克隆JP09和克隆JP26)由G.Vassart提供(Brussels大学，Brussels，Belgium)。放射性标记比活力为40-60μCi/μg的125I-cAMP、125I-人TSH、和125I-牛TSH得自Hazleton Biologicals(Vienna，VA)。
6.2 方法6.2.1 定点诱变人αcDNA的定点诱变通过基于PCR的巨引物法实现(Sarkar等，1990，生物技术(Biotechniques)，8404-407)。用VentDNA聚合酶(NewEngland Biolabs)实现最佳扩增。用BamHI和Xhol消化后，将PCR产物连接到切除BsmHI/Xhol片段片段的pcDNA/Neo(Invitrogen)中。用Ultracomp E.Coli转化试剂盒(Invitrogen)转化MC1061/p3大肠杆菌。使用用于多质粒DNA制品的QIAprep 8质粒试剂盒(Qiagen)。应用Qiagen Mega和Maxi纯化方案纯化大量含有存在单个或多个突变αcDNA的质粒，用作进一步诱变的模版。用Sanger’s二脱氧核苷酸链终止程序通过双链测序验证诱变。Joshi等曾报道(1995，内分泌学，1363839-3848)突变TSHβ亚基与CTEP融合的构建体。
6.2.2 重组激素的表达CHO-K1细胞在含谷氨酰胺和10％FBS、青霉素(50单位/ml)、和链霉素(50μg/ml)的HAM’s F-12培养基上维持生长。利用LIPOFECTAMINE试剂(Gibco BRL)，用整合入pcDNA I/NEO的野生型或突变αcDNA和插入p(LB)CMV载体的突变hTSHβ小基因共转染细胞平板(100mm的培养皿)。24小时后，将转染细胞转移到无血清的CHO培养基中(CHO-SFM-II，Gibco BRL)。培养基包括用无基因插入体的表达质粒进行模拟转染得到的对照培养基，转染后72小时收获培养基，浓缩，离心；等分试样储存于-20℃，进行各种分析前融化。用各种活性测试法和免疫分析法测定和验证。
6.2.3 在表达人TSH受体的哺乳动物细胞中cAMP的激活使hTSH受体cDNA(JP09或JP26)稳定转染的CHO-K1细胞与所述连续稀释的野生型和突变TSH一起生长，培养。通过放免分析法测定释放到培养基中的cAMP。模拟对照和来自转染细胞的含hTSH的样品使用培养基总蛋白质的相同量。
6.2.4 体内TSH生物活性测试通过hTSH诱导表达hTSH受体的CHO细胞(克隆JP09和JP26)和表达内源性大鼠TSH受体的FRLT-5细胞产生cAMP的能力评价其促甲状腺活性。FRTL-5细胞还用于测试hTSH-诱导的细胞生长。之后，使稳定表达hTSH受体的CHO细胞(JP09和JP26)在含补充的HAM’sF12培养基的96孔组织培养板中生长到铺满。随后，在无盐条件下或生理NaCl浓度(0.9％)下，于37℃、5％CO2条件下，将细胞与连续稀释的野生型和突变hTSH以及来自模拟转染的对照培养基一起培养2小时。通过放免法测定释放到培养基中的cAMP的量。如Szkudlinski等所述(天然生物技术(Nat.Biotechnol.)141257(1996))将hTSH类似物腹膜内注射到T3-抑制鼠体内后，测定总甲状腺素(T4)水平，来测试hTSH类似物的体内活性。
6.3 结果图4-8的结果支持这样的结论，即按照本发明的突变TSH异二聚体与相应的野生型TSH相比表现增强的生物活性。特别是，该结果表明上述方法中TSH亚基中的单个或多个突变可以整合到表现增强的体外和体内活性的异二聚体中。对几种不同的突变体和其组合物均如此，并因此阐明了本发明的基本原理。
在一个阐述共有人α亚基的αL1环中的突变能够增强激素活性的实施例中，制备了一种突变体，其中起初存在于α亚基22位的甘氨酸残基被精氨酸残基取代(αG22R)。该突变体与野生型β亚基组合的突变TSH异二聚体通过各亚基在CHO-K1细胞中的瞬时共表达制备。然后用表达TSH受体的CHO-JP26细胞测试得到的突变异二聚体的生物活性。图4所示结果表明，突变激素结合TSHR，并且比野生型TSH诱导更高水平的环AMP。
突变TSH超活性异二聚体、野生型或含四种突变(Q13K+E14K+P16K+Q20K，即α4K)的突变共有α亚基的血浆半衰期和稳定性通过在CHO-K1细胞中共表达α4K亚基和野生型人TSHβ亚基或融合hCG CTEP的人TSHβ亚基(β-CTEP)得以增强。利用化学发光免疫分析法定量分析野生型和突变TSH异二聚体(NicholsInstitute)。结果如表1所示(100％表达为每毫升47ng野生型TSH)。
表1
CTEP的存在不会降低含α4K和β-CTEP融合蛋白质相对含α4K和野生型TSHβ异二聚体的表达。
通过刺激稳定表达转染TSHR的CHO-J09生产环AMP，评价野生型和突变TSH异二聚体结合TSHR的能力。如图5所示的结果表明，α4K/β-CTEP异二聚体与野生型TSH相比，能力增强200倍，Vmax增加1.5倍。令人惊讶的是，期望延长α4K/β-CTEP异二聚体的体内半衰期而加入的CTEP，还使其体外活性比α4K/野生型β异二聚体的体外活性进一步增强了3-4倍。
结果表明，增强突变TSH生物活性的突变可以有利地与延长循环半衰期的突变或修饰联合，以制备表现优越的体外和体内特性的突变激素。
在另一个实施例中，共有人α亚基β发夹L3环中的突变也增强了激素活性。突变之一是81位的丙氨酸残基取代为赖氨酸残基(αA81K)。另一个突变是66位的天冬氨酸残基取代为赖氨酸残基(αN66K)。每种突变人α亚基在CHO-K1细胞中与野生型人TSH-β亚基一起瞬时表达，产生突变TSH异二聚体。在生物活性分析中，用表达人TSH受体的CHO-JP09对这些突变TSH异二聚体的每一种利进行测试。这些程序的结果表明两种突变激素均比野生型激素刺激更高水平的cAMP产生。α亚基81位的丙氨酸取代位赖氨酸(αA81K)代表赖氨酸残基引入β发夹环的首次确证，它不存在于其它同源序列。
再一个实施例中，人TSHβ亚基β发夹L1环附近的突变增强了包括该突变亚基的异二聚体的激素活性。该突变是6位的谷氨酸取代为天冬酰胺残基(βE6N)，其除去了β发夹L1环周围的负电荷残基。突变人TSH-β亚基再在CHO-K1细胞中与野生型人共有α亚基一起瞬时表达，产生突变TSH异二聚体。然后在生物活性分析中，用表达TSH受体的CHO-JP09细胞测试突变TSH异二聚体。同样，结果表明该突变TSH激素能够结合受体并比野生型TSH诱导更高水平的cAMP产生。
图6和7中的结果进一步证实βL1环中的突变可以用于制备突变异二聚体(当利用体外分析法试验时，它们有利地拥有增强的生物活性)。特别是，图6所示的结果表明突变βF1R、βE6N和βA17R可以单独与野生型α亚基结合形成拥有增强的激素活性的突变异二聚体。图7表明含有βF1R和βE6N，或者βF1R、βE6N和βA17R的β亚基也拥有增强的激素活性。
按照上述体外试验结果，突变TSH类似物表现体内活性平行增加。事实上，在一个验证按照上述方法制备的TSH突变体的体内活性试验中，制备了具有三点突变βI58R、βE63R和βL69R的TSH-β亚基(β3R)。上述α4K突变α亚基和β3R突变亚基在胞内共表达，可从条件介质中收集到，得到的异二聚体进行生物活性试验，测量总T4。诱变并不显著影响类似物从循环系统中的清除。图8A所示的结果表明两种不同的突变异二聚体表现显著增强的体内生物活性。图8B所示的结果表明α4K/β3R异二聚体相对于野生型对照的生物活性增强至少100倍。另外，这些结果证实突变TSH亚基的联合能够显著增强激素的体内活性。根据这些结果，理所当然地认为本文所述的TSH突变体和类似物在诊断治疗甲状腺癌中将优越于常规重组hTSH。
上面得出的结论证实按照本文提供的有利指示进行的TSH亚基的突变，可以用于制备和应用于生物活性增强的TSH突变体。
本文得出的结论进一步表明hTSH的αL1和βL3环区附近代表“修饰-许可”区，可以对该区进行遗传操作，以便得到更高受体结合和活性。这些修饰许可区的定位产生二价配体，其中均二聚体或异二聚体的头对尾二聚化作用导致结合表面的对称性，认为其介导配体诱导的受体二聚化作用。虽然G蛋白-偶联受体的功能相关受体二聚化作用还未曾描述，推测相互作用位点定位在肾上腺素能受体的第六跨膜区，相应区域是构建TSH受体活化突变的“热点”。
因此，利用基于进化考虑和同源性比较的合理策略，对不到20个突变进行试验，我们鉴定了在TSH分子的总共204个氨基酸中仅存在7个突变的α4K/β3R hTSH类似物，结合亲和力增加了50,000倍，激素效力增加了1,300倍。如果不希望被任何具体操作理论所束缚，糖蛋白激素进化过程中对外围环的修饰可能会在系统发生的各阶段改变激素功能。这两个经基因操作的环区在受体结合方面的协同作用表明，这种空间距离较远区域的修饰的组合(其在激素进化的不同阶段被优化)，可以提供基因操作人蛋白质类似物的一般方法。本文描述的这种类型的重组类似物含有任何已知天然激素在任何进化阶段都不存在的碱性残基的组合，它们比来源于任何物种的TSH具有更优越的受体结合亲和力或活性。
应当理解本发明的某些改变对本领域技术人员来说是显而易见的。上述详细描述以举例说明的方式给出，为了便于清楚理解本发明，本发明的实质和范围将参考附加的权利要求书得以进一步说明。
权利要求
1.一种在如图1(SEQ ID NO1)所示的α亚基氨基酸序列的22位含有一个氨基酸取代的突变α亚基。
2.权利要求1的突变α亚基，其中22位取代的氨基酸是精氨酸。
3.权利要求1的突变α亚基，它是纯化的。
4.权利要求1的突变α亚基，在如图1(SEQ ID NO1)所示的α亚基氨基酸序列的选自11-21位氨基酸残基中进一步含有一个或多个氨基酸取代。
5.权利要求5的突变α亚基，其中一个或多个氨基酸取代位于如图1(SEQ ID NO1)所示的α亚基氨基酸序列的选自11、13、14、16、17和20位的氨基酸残基。
6.权利要求1的突变α亚基，在α亚基β发夹L1环中进一步含有一一个或多个氨基酸取代。
7.权利要求4或6的突变α亚基，其中一个或多个取代氨基酸为精氨酸或赖氨酸。
8.权利要求4的人α亚基，其中一个或多个取代选自αT11K、αQ13K、αE14K、αP16K、αF17R、和αQ20K。
9.一种突变α亚基，其中唯一的突变是在如图1(SEQ ID NO1)所示的α亚基氨基酸序列22位上的一个氨基酸取代。
10.权利要求9的突变α亚基，其中22位取代为精氨酸。
11.权利要求9的突变α亚基，它是纯化的。
12.突变TSH异二聚体，其含有一个突变α亚基和一个β亚基，所述突变α亚基在如图1(SEQ ID NO1)所示的α亚基氨基酸序列的22位含有一个氨基酸取代，其中突变TSH异二聚体的生物活性高于野生型TSH异二聚体的生物活性。
13.权利要求12的突变TSH异二聚体，其中22位的氨基酸取代为精氨酸。
14.权利要求12的突变TSH异二聚体，它是纯化的。
15.权利要求12的突变TSH异二聚体，其中β亚基是人β亚基。
16.权利要求12的突变TSH异二聚体，在如图1(SEQ ID NO1)所示的α亚基氨基酸序列的选自11-21位氨基酸残基中进一步含有一个或多个氨基酸取代。
17.权利要求12的突变TSH异二聚体，其中一个或多个氨基酸取代位于选自α亚基氨基酸序列的11、13、14、16、17和20位的氨基酸残基。
18.权利要求12的突变TSH异二聚体，在α亚基β发夹L1环中进一步含有一个或多个氨基酸取代。
19.权利要求16或18的突变TSH异二聚体，其中一个或多个取代为选自精氨酸和赖氨酸的氨基酸。
20.权利要求16的突变TSH异二聚体，其中一个或多个取代选自αT11K、αQ13K、αE14K、αP16K、αF17R、和αQ20K。
21.一种突变TSH异二聚体，其中唯一的突变是在如图1(SEQ IDNO1)所示的α亚基氨基酸序列22位上的一个氨基酸取代。
22.权利要求21的突变TSH异二聚体，其中22位取代为精氨酸。
23.权利要求21的突变异二聚体，它是纯化的。
24.一种突变TSH异二聚体，含有(a)一个TSHβ亚基，人绒毛膜促性腺激素的羧基末端延长肽的氨基末端经肽键连接到所述TSHβ亚基的羧基末端；和(b)一个α亚基，其中至少TSHβ亚基或TSHα亚基含有至少一个氨基酸取代，其中突变TSH异二聚体的生物活性高于野生型TSH异二聚体的生物活性。
25.权利要求24的突变TSH异二聚体，其中至少一个氨基酸取代位于选自如图1(SEQ ID NO1)所示的人α亚基氨基酸序列11-21位的氨基酸残基。
26.权利要求24的突变人TSH异二聚体，其中至少一个氨基酸取代位于选自如图2(SEQ ID NO2)所示的TSHβ亚基氨基酸序列58-69位的氨基酸残基。
27.权利要求26的突变人TSH异二聚体，其中至少一个氨基酸取代选自β158R、βE63R和βL69R。
28.权利要求24的突变TSH异二聚体，其含有一个突变人α亚基和一个突变人TSH β突变亚基，其中突变人α亚基在如图1(SEQ IDNO1)所示的人α亚基氨基酸序列的选自11-21位的氨基酸残基中含有至少一个氨基酸取代，其中突变人TSHβ亚基在如图2(SEQ ID NO2)所示的人TSHβ亚基氨基酸序列的选自58-69位的氨基酸残基中含有至少一个氨基酸取代。
29.权利要求24的突变TSH异二聚体，它是一种人TSH异二聚体的突变体。
30.一种TSH类似物，其含有一个与TSHβ亚基共价结合的α亚基，其中至少一个亚基在其氨基酸序列中含有至少一个氨基酸取代，其中所述TSH类似物的生物活性高于野生型α亚基与野生型β亚基共价结合形成的TSH类似物的生物活性。
31.权利要求30的TSH类似物，其中至少一个氨基酸取代位于如图1(SEQ ID NO1)所示的α亚基氨基酸序列的选自11-21位中的氨基酸残基。
32.权利要求30的TSH类似物，其中至少一个氨基酸取代位于如图2(SEQ ID NO2)所示的人TSHβ亚基氨基酸序列的选自58-69位中的氨基酸残基。
33.权利要求30的TSH类似物，其中α亚基和βTSH亚基均含有一个或多个氨基酸取代。
34.权利要求33的TSH类似物，其中α亚基在如图1(SEQ ID NO1)所示的α亚基氨基酸序列和选自11-21位中的氨基酸残基中至少含有一个氨基酸取代，TSHβ亚基在如图2(SEQ ID NO2)所示的人TSHβ亚基氨基酸序列的选自58-69位的氨基酸残基中至少含有一个氨基酸取代。
35.权利要求30的TSH类似物，其中人绒毛膜促性腺激素的羧基末端延长肽的氨基末端经肽键连接到TSHβ亚基的羧基末端，羧基末端延长肽的羧基末端经肽键与α亚基的氨基末端相连。
36.权利要求30的TSH类似物，其中TSHβ亚基的羧基末端经肽键与α亚基的氨基末端相连。
37.权利要求24的突变TSH异二聚体，其中突变TSH异二聚体在体内循环系统中的激素半衰期高于野生型TSH。
38.权利要求30的突变TSH类似物，其中突变TSH类似物在体内循环系统中的激素半衰期高于野生型TSH。
39.一种含有编码权利要求1突变α亚基的核苷酸序列的核酸。
40.一种含有编码权利要求30TSH类似物的核苷酸序列的核酸，其中α亚基经肽键与β亚基相连。
41.治疗或预防甲状腺机能减退的方法，包括给需要接受该治疗或预防的受试者给药一定量的足以治疗或预防甲状腺机能减退的权利要求24的TSH异二聚体。
42.治疗或预防甲状腺机能减退的方法，包括给需要接受该治疗或预防的受试者给药一定量的足以治疗或预防甲状腺机能减退的权利要求30的TSH异二聚体。
43.治疗甲状腺癌的方法，包括给需要接受该治疗或预防的受试者给药一定量的足以刺激碘摄取的权利要求24的突变TSH异二聚体，然后给所述受试者给药一定量的足以治疗甲状腺癌的放射性标记碘。
44.治疗甲状腺癌的方法，包括给需要接受该治疗或预防的受试者给药一定量的足以刺激碘摄取的权利要求30的TSH类似物，然后给所述受试者给药一定量的足以治疗甲状腺癌的放射性标记碘。
45.诊断甲状腺癌的方法，包括给受试者给药一定量的足以刺激甲状腺癌细胞摄取碘的权利要求24的突变TSH异二聚体，然后给药一定量的足以诊断甲状腺癌的放射性标记碘。
46.诊断甲状腺癌的方法，包括给缺乏非癌性甲状腺细胞的受试者给药一定量的足以刺激甲状腺癌细胞摄取碘的权利要求24的突变TSH异二聚体和一定量的足以诊断甲状腺癌的放射性标记碘；然后检测所述放射性标记碘，其中放射性标记碘摄取增加表明受试者患有甲状腺癌。
47.诊断甲状腺癌的方法，包括给第一受试者给药一定量的足以刺激甲状腺球蛋白体内释放的权利要求24的突变TSH异二聚体，然后测定所述第一受试者体内的甲状腺球蛋白水平，其中甲状腺球蛋白水平相对于未患甲状腺癌的第二受试者样品中的甲状腺球蛋白水平有所增加表明所述第一受试者患有甲状腺癌。
48.诊断甲状腺癌的方法，包括给受试者给药一定量的足以刺激甲状腺癌细胞摄取碘的权利要求30的TSH类似物和一定量的足以诊断甲状腺癌的放射性标记碘；然后检测所述放射性标记碘，其中相对于未患甲状腺疾病的受试者放射性标记碘摄取的增加表明该受试者患有甲状腺癌。
49.诊断甲状腺癌的方法，包括给缺乏非癌性甲状腺细胞的受试者给药一定量的足以刺激甲状腺癌细胞摄取碘的权利要求30的突变TSH异二聚体和一定量的足以诊断甲状腺癌的放射性标记碘；然后检测所述放射性标记碘，其中放射性标记碘摄取的增加表明受试者患有甲状腺癌。
50.诊断甲状腺癌的方法，包括第一受试者给药一定量的足以刺激甲状腺球蛋白体内释放的权利要求30的TSH类似物，然后测定所述第一受试者体内的甲状腺球蛋白水平，其中甲状腺球蛋白水平相对于未患甲状腺癌的第二受试者样品中的甲状腺球蛋白水平有所增加表明所述第一受试者患有甲状腺癌。
51.诊断或筛选特征在于存在抗TSH受体的抗体的疾病或病症的方法，包括使含有TSH受体的培养细胞或分离膜与来源于第一受试者的推测含有抗体的样品和诊断有效量的权利要求24的放射性标记突变TSH异二聚体混合；然后测定放射性标记突变TSH与培养细胞或分离膜的结合，其中放射性标记TSH的结合相对于缺乏所述样品或样品为未患所述疾病或病症的第二受试者的样品时的结合有所降低，表明所述第一受试者患有所述疾病或病症。
52.权利要求51的方法，其中所述疾病或病症是格雷夫斯病。
53.诊断或筛选特征在于存在抗TSH受体的抗体的疾病或病症的方法，包括使含有TSH受体的培养细胞或分离膜与来源于第一受试者的推测含有抗体的样品和诊断有效量的权利要求30的放射性标记TSH类似物混合；然后测定放射性标记突变TSH与培养细胞或分离膜的结合，其中放射性标记TSH的结合相对于缺乏所述样品或样品为未患所述疾病或病症的第二受试者的样品时的结合有所降低，表明所述第一受试者患有所述疾病或病症。
54.权利要求53的方法，其中所述疾病或病症是格雷夫斯病。
55.一种药物组合物，含有治疗有效量的权利要求12的突变TSH异二聚体；和药剂可接受的载体。
56.一种药物组合物，含有治疗有效量的权利要求24的突变TSH异二聚体；和药剂可接受的载体。
57.一种药物组合物，含有治疗有效量的权利要求30的TSH类似物；和药剂可接受的载体。
58.一种诊断组合物，含有一定量的足以刺激甲状腺癌细胞摄取碘的权利要求12的突变TSH异二聚体；和药剂可接受的载体。
59.一种诊断组合物，含有一定量的足以刺激甲状腺癌细胞摄取碘的权利要求24的突变TSH异二聚体；和药剂可接受的载体。
60.一种诊断组合物，含有一定量的足以刺激甲状腺癌细胞摄取碘的权利要求30的TSH类似物；和药剂可接受的载体。
61.一种试剂盒，在一个或多个容器中含有治疗有效量的权利要求12或24的突变TSH异二聚体或权利要求30的TSH类似物。
62.一种试剂盒，在一个或多个容器中含有诊断有效量的权利要求12或24的突变TSH异二聚体或权利要求30的TSH类似物。
63.权利要求38或40的核酸，它是分离的。
64.权利要求55、56、58或59的组合物，其中突变TSH异二聚体是纯化的。
全文摘要
本发明依据如下发现,即可以制备相对于野生型亚基含有氨基酸取代的突变α亚基和突变β亚基,并组合它们形成拥有较高体外生物活性和较长体内半衰期的突变TSH异二聚体或TSH类似物。因此,本发明提供了应用突变TSH异二聚体、TSH类似物、其片段和衍生物治疗或预防甲状腺疾病,特别是甲状腺癌的方法。本发明还涉及甲状腺相关功能的诊断、预后和监测方法。还提供了用于治疗和预防代谢性和生殖疾病的药物组合物和诊断组合物,应用突变TSH异二聚体和TSH类似物的方法。
文档编号A61P35/00GK1277633SQ98810542
公开日2000年12月20日 申请日期1998年9月22日 优先权日1997年9月22日
发明者布鲁斯·D·温特劳布, 马里乌什·W·斯库德林斯基 申请人:马里兰大学巴尔的摩分校