新型的组织特异钙蛋白酶,其制备方法和用途的制作方法

专利名称：：新型的组织特异钙蛋白酶,其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新型的组织特异钙蛋白酶和其制备方法。此外，本发明涉及筛选新型的钙蛋白酶抑制剂的方法和其用途。钙蛋白酶是属于半胱氨酸蛋白酶组的细胞内非溶酶体的酶类。它们在真核细胞中与Ca2+依赖的信号转导有关，即它们以依赖Ca2+浓度的方式控制细胞功能。钙蛋白酶在动物组织以及如人、鸡、兔子和大鼠的细胞中广泛存在。钙蛋白酶也在较低等的动物如黑腹果蝇、血吸虫属或秀丽隐杆线虫中发现。迄今为止，未在酵母、真菌或细菌中检测到钙蛋白酶。迄今为止，已知这些广泛存在钙蛋白酶的三种主要同I型，并且在体外它们的钙依赖活性不同。I型钙蛋白酶(＝μ钙蛋白酶)被微摩尔浓度的钙离子活化，而II型钙蛋白酶(＝m钙蛋白酶)仅被毫摩尔浓度的钙离子活化。该两种钙蛋白酶由1个大约80kDa的大亚单位和1个大约30kDa的小单位的2个亚单位组成。活化的异二聚体的2个亚单位具有钙结合位点。大亚单位包括下列4个蛋白结构域(＝I-IV)1个蛋白酶结构域(结构域II)、1个钙结合结构域(＝结构域IV)和2个其功能不清楚的其他结构域(＝结构域I和III)。30K小亚单位由1个钙结合亚单位(＝IV′)和另1个其功能不清楚的亚单位(＝V)组成。除了这些2种类型的钙蛋白酶外，在钙活化方面处于中间的第三种类型(＝μ/m80K)已在鸡中发现(WangK.K.W.等，TiPS，15卷，1994412-419，Suzuki，K等，生物化学Hoppe-Seyler，376卷，1995523-529)。除了这些广泛分布的钙蛋白酶外，最近鉴定出了2种新型的组织特异表达的钙蛋白酶。nCL-1(＝p94)是肌肉特异的钙蛋白酶，存在于鸡、大鼠和人类中，推测其作为单体活化并且仅由80kd的亚单位组成。除了nCL-1外，还存在可能以2种剪切变异体nCL-2和nCL-2′出现的胃特异钙蛋白酶。nCL-2′与nCL-2不同在于缺乏钙结合区(Sorimachi，H.S.等，生物化学杂志268卷，26期，199319476-19482，Sorimachi，HS等，FEBS通讯，343，19941-5)。在果蝇中发现的钙蛋白酶的同源蛋白(＝CalpA)，能和肌动蛋白相互作用，可能在胚胎发育中起重要的作用，它具有2种不同的剪接变异体。在该情况中，较短的变异体也缺乏钙结合位点。推测钙蛋白酶在各种生理过程中起重要的作用，许多细胞骨架、膜结合或调节蛋白如蛋白激酶C、磷脂酶C、血影蛋白、细胞骨架蛋白如MAP2、肌肉蛋白、神经微丝和神经肽、血小板蛋白、表皮生长因子、NMDA受体和涉及有丝分裂的蛋白及其他蛋白，均是钙蛋白酶的底物(BarrettM.J.等，生命科学，48，19911659-69，WangK.K.等，药理科学进展，15，1994412-49)。然而，钙蛋白酶的正常生理功能仍未清楚地了解。它们与诸如凋亡、细胞分裂和分化或胚胎发育的许多生理过程有关。在各种病理生理过程和失调中，例如在心脏缺血(如心肌梗塞)、肾缺血或中枢神经系统缺血(如中风)、炎症、肌营养不良、眼内白内障(灰色白内障)、对中枢神经系统损伤(如外伤)、阿尔茨海默病、HIV诱导的神经病、帕金森病和享廷顿舞蹈病等(见上WangK.K.)中，检测到了提高的钙蛋白酶的水平。推测这些失调与提高并维持的胞内钙水平之间有联系。这导致钙依赖的过程过度活化并且不再受生理学控制。相应地，钙蛋白酶的过度活化也可能启动病理生理过程。这是为什么假定钙蛋白酶的抑制剂可用于治疗这些失调的原因。各种研究材料也证实了这一点。因此，Seung-ChyulHong等(中风1994，25(3)，663-669)和BartusR.T.等(神经学研究1995，17，249-258)显示钙蛋白酶抑制剂在中风后出现的急性神经退行性失调中具有神经保护作用。同样地，实验性脑损伤后，钙蛋白酶抑制剂改善记忆丧失和出现的神经运动失调的恢复(SaatmanK.E.等，美国国家科学院院报93，19963428-3433)。EdalsteinC.L.等(美国国家科学院院报，92，1995，7662-7666)发现钙蛋白酶抑制剂对由低氧引起的肾的损伤有保护作用。YoshidaK.I.等(日本循环杂志，59(1)，1995，40-48)显示钙蛋白酶抑制剂对缺血或再灌注引起的心脏损伤后具有有益的作用。由于钙蛋白酶抑制剂抑制β-AP4蛋白的释放，已建议对阿尔茨海默病的治疗有潜在的用途(HigakiJ.等，神经元，14，1995651-659)。白介素-1α的释放同样被钙蛋白酶抑制剂所抑制(WatanabeN.等，细胞因子，6(6)，1994597-601)。而且发现钙蛋白酶抑制剂对肿瘤细胞有细胞毒作用(ShibaE.等，第20届国际乳腺癌研究协会会议，Sendai日本，1994，25-28，9月，国际肿瘤杂志5(增刊)，1994，381)。钙蛋白酶也在再狭窄和关节炎中起重要的作用，因而钙蛋白酶抑制剂对这些病的病理学具有有益的作用(MarchKL等，循环研究，72，1993413-423，SuzukiK.等，生物化学杂志，285，1992857-862)。在WangK.K.的文章中(药理科学进展15，1994412-419)找到了钙蛋白酶抑制剂的进一步可能用途。最有效和选择性的钙蛋白酶抑制剂是天然产生的细胞内蛋白钙蛋白酶抑制蛋白。它能抑制I型钙蛋白酶和II型钙蛋白酶，但不抑制诸如组织蛋白酶B、L或番木瓜酶等其他半胱氨酸和硫醇基蛋白酶。然而，钙蛋白酶抑制蛋白有不适用于可能的治疗的不利特点，因为其大小由大约700个氨基酸组成，不能跨过细胞膜。除了低分子量的钙蛋白酶抑制肽外，已鉴定出了许多非肽的抑制剂。这些抑制剂的不利特点是它们不能稳定，迅速地被代谢分解，并且其中的一些具有毒性。另外，许多钙蛋白酶抑制剂选择性不够，即，它们不仅抑制I和II型钙蛋白酶，也抑制其他的半胱氨酸蛋白酶如番木瓜酶、胰凝乳蛋白酶、弹性酶或组织蛋白酶B和L。因此，继续需要选择性和高度有效的钙蛋白酶抑制剂。也需要高度特异的测定系统，筛选这些选择性和非常有效的钙蛋白酶抑制剂，以便鉴定出选择性的抑制剂。通常用广泛存在的I型钙蛋白酶和II型钙蛋白酶进行筛选测定。为发现选择性抑制剂，进一步提供可能用于测定组织特异表达的钙蛋白酶，是有必要并且合乎要求的，这样能对所述的抑制剂在各种钙蛋白酶中测定其选择性。此外，进一步寻找新型的钙蛋白酶，因为它们非常有可能是在各种病理学和失调中差异表达的蛋白，而且在这些失调中起重要的作用。本发明的一个目的是提供区别和鉴定钙蛋白酶抑制剂的方法和提供这些抑制剂用作治疗的靶物，这些方法有可能鉴定一方面仅对1种钙蛋白酶有抑制作用和/或，另一方面对多种钙蛋白酶有抑制作用的钙蛋白酶抑制剂。我们发现本发明的目的通过一种新型的组织特异的具有序列SEQIDNO.1或SEQIDNO.3名称为CAPN6的钙蛋白酶基因，其等位变异体、类似物或衍生物而达到，在衍生的氨基酸水平，这些类似物或衍生物的同源性从60～100％，其中该钙蛋白酶基因、它们的等位变异体、类似物或衍生物含有下列序列(a)Leu-Gly-Asn-Lys-Ala，其中本序列与人I型钙蛋白酶中相应的序列不同，因为人I型钙蛋白酶中位于115位的氨基酸半胱氨酸已改变为在序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.3中81位的赖氨酸；(b)Ala-X-Ser-Cys-Leu-Ala，其中，与人I型钙蛋白酶中相应的序列相比较，在122和125位的氨基酸丙氨酸和苏氨酸已改变为序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.3中88位和91位的丝氨酸和丙氨酸；(c)Gly-Tyr-Thr-(HisoderTyr)-Thr-X-Thr，其中，与人I型钙蛋白酶中相应的序列相比较，在272、273和275位的氨基酸组氨酸、丙氨酸和丝氨酸已改变为在序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.3中252、253和255位的酪氨酸、苏氨酸和苏氨酸，此外，在SEQIDNO.3中，在I型钙蛋白酶274位的酪氨酸残基改变为SEQIDNO.3中254位的组氨酸；(d)Alg-X-Arg-Asn-Pro-Leu-Gly其中该序列与人I型钙蛋白酶的相应序列不同，因为在人I型蛋白酶中位于298位的氨基酸色氨酸已改变为序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.3中的286位的亮氨酸，并且在所述序列中X是任何天然氨基酸。本发明也涉及一种鉴别钙蛋白酶抑制剂的方法，其中由在权利要求1所公开的序列编码的钙蛋白酶、其等位变异体或类似物从组织或细胞分离，并且测定了由测试物质抑制酶CAPN6底物的裂解，而至少在一个其他的测定中，测定了由测试物质抑制I和/或II型钙蛋白酶底物的裂解，然后选出了能抑制酶CAPN6和至少一种其他的钙蛋白酶的测试物质。本发明进一步涉及一种鉴别钙蛋白酶抑制剂的方法，其中确定了在细胞系统中通过测试物质抑制酶CAPN6底物的裂解或I和/或II型钙蛋白酶底物的裂解，并且选出了穿过细胞膜和抑制酶CAPN6细胞内活性和/或I和/或II钙蛋白酶细胞内活性的物质，选出了不抑制酶CAPN6但抑制I和/或II型钙蛋白酶的物质，或者选出了抑制酶CAPN6但不抑制I和/或II钙蛋白酶的物质。也有利地选择出体外对钙蛋白酶有活性但不能进入所检测的细胞的物质。如果后续的测定显示这些物质不能或仅微弱地进入细胞，它们的细胞渗透性可通过衍生方法改善。用BLAST方法程序在国家生物技术信心中心的EST数据库中(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)，用人μ和m钙蛋白酶基因序列寻找其同源性。找到了一条具有钙蛋白酶典型序列的，被称为ESTAA050030的序列。用该序列可能制备一个小鼠的克隆，其克隆编码的基因，其基因产物为新型的钙蛋白酶，称为CAPN6(＝nCL-4)。该克隆nCL-4的核酸序列在SEQIDNO1中可找到。其推知的钙蛋白酶CAPN6的氨基酸序列在SEQIDNO2中可找到。考虑内含子之存在，推导的氨基酸序列，显示为典型的钙蛋白酶特征，尽管因为低同源性，不可能将其归类到已知的μ钙蛋白酶、m钙蛋白酶、nCL-1或nCL-2的钙蛋白酶亚族中。钙蛋白酶CAPN6是一种新型的以前未知的钙蛋白酶。在EST数据库中用来自小鼠的该序列进一步研究，提供了与小鼠CAPN6序列具有同源性的另外4个人部分序列(AA169715、C17337、C16980和T39424)。这些部分序列能组装成一个连续的序列，编码长为374个氨基酸的蛋白。该序列缺乏典型的甲硫氨酸起始密码子和终止密码子。因此该序列可能仅是与克隆的小鼠序列的人定向进化同源基因的部分序列2条序列374个氨基酸的同源性为94.9％(图1)。来源于基因序列SEQIDNO1的蛋白序列显示为与秀丽隐杆线虫基因tra-3的整个氨基酸序列30％的同源性，这是最大的同源性。与其他已知的钙蛋白酶的同源性从20.9％(大鼠nCL-2)至25.4％(小鼠m钙蛋白酶)。用Lipman-Pearson法(Ktupl2，间隔分4、间隔长度分12)的序列比较中，在CAPN6和人CAPN1(＝CAN1-人，Aoki等，FEBS通讯205，1986313-317)、人CAPN2(＝CAN2-人，Aoki等，生物化学27，19888122-8128)、大鼠CAPN2(＝CAN2-大鼠，Deluca等，生物化学生物物理学报1216，199381-93)、人CAPN3(＝CAN3-人，Richard等，细胞81，〔lacuna〕27-40)、大鼠CAPN3(＝CAN3-大鼠，Sorimachi等，生物化学杂志264，198920106-20111)和果蝇钙蛋白酶(＝DMCLPNOCM-1)之间，就230～520氨基酸的部分序列来说，发现稍较大的同源性，为32.8～39.5％，但就其全部比较的序列来说，比tra-3的同源性更低(图1，用PAM25残基重量表的匹配成组法)。除了tra-3外，CAPN6显示与最近披露的CAPN5钙蛋白酶明显的同源性(44.2％同源性，文献号p19718248.8)。在广泛的各种数据库中，小鼠和人CAPN6序列之间的序列比较显示与CalpA、Tra-3和未提供其功能信息的称为C16980、T39424、AA16971、R93331和G17331的人序列的同源性。用位于国家生物技术信息中心的基因库EST和数据库(httpHwww.Ncbi.nlm.nih.yor)及Wash-U数据库(HomoSapiens)，进行序列比较。在数据库中也找到了名为AA050030的小鼠EST序列，并标示为钙蛋白酶。从数据库不能获得进一步的信息。AA16971T、R93331、C17331和AA050030的完整基因序列仍未知。2种钙蛋白酶(CAPN5和CAPN6)具有共同的特性，可与其他钙蛋白酶相区别。同其他钙蛋白酶相比较，CAPN5和CAPN6不仅具有一个截短的结构域I，而且具有与其他钙蛋白酶的结构域IV无明显同源性的修饰过的C-末端。钙蛋白酶的Ca2+结合位点的共有序列(称为EF手)位于结构域IV区。该Ca2+结合位点在CAPN5和CAPN6中缺失，这意味着可能没有Ca2+结合到结构域IV上，而这些蛋白以另一种方式活化。因此，它们是缺乏钙调蛋白样结构域IV的脊椎动物钙蛋白酶。衍生的CAPN6氨基酸序列以修饰过的催化中心为另一个特点。仅284位的Asn残基保守。在小鼠CAPN6序列中，81位的半胱氨酸残基和252位的组氨酸残基分别被赖氨酸和酪氨酸所取代。CAPN6序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.3和人I型钙蛋白酶(＝CAPN1，Aoki等，FEBS通讯205，1986313-317)相比较，在催化中心区鉴别出进一步取代的氨基酸。因此，在CAPN1中122和125位的氨基酸丙氨酸和苏氨酸改变为CAPN6中88和91位的丝氨酸和丙氨酸。同样地，CAPN1中272、273、275和298位的氨基酸组氨酸、丙氨酸、丝氨酸和色氨酸改变为CAPN6中252、253、255和286位的酪氨酸、苏氨酸、苏氨酸和亮氨酸。比较序列和匹配蛋白的保守区，进行把氨基酸匹配到蛋白CAPN1和CAPN6的各个位点，因此在氨基酸水平上，使蛋白质之间达到最大一致。因而有可能，例如在蛋白家族中，相同的序列在不同的蛋白中位于非常不同的位点或位置。除了半胱氨酸残基取代外，人CAPN6序列254位的酪氨酸被组氨酸取代(表1)。可能的解释也许是，例如CAPN6具有和其它钙蛋白酶不同的底物特异性，或者该活化中心对CAPN6的功能不重要，它是一种其他钙蛋白酶的抑制剂，或者CAPN6是一种假基因。最后一种可能性似乎不可能，因为有大量的保守氨基酸。有可能89位的半胱氨酸残基能替代在催化反应中81位缺失的半胱氨酸残基的功能。甚至CAPN6没有蛋白酶活性，这是非常不可能的，CAPN6可能和其他钙蛋白酶竞争辅因子和底物上的结合位点而参与调节过程。表1CAPN6基因组序列</tables>*活性中心的氨基酸(Arthur等，FEBS通讯368，1995397-400)1在m钙蛋白酶中没有亮氨酸而活性很低(Arthur等，FEBS通讯368，1995397-400)Tra-3在秀丽隐杆线虫中涉及性别决定。与tra-3有关的几种基因和它们的基因产物的级联决定是否秀丽隐杆线虫雄性或雌雄同体发育(KuwabaraP.E.等，TIG8卷，5期，1992164-168)。Tra-3似乎涉及精子发生。在小鼠CAPN6和tra3的各种结构域中，相应于结构域I、II、III和T的氨基酸保守性分别是39.2％、42.0％、30.9％和22％。从来源于(Ia)17小鼠胚胎mRNA的cDNA开始，用Frohman等(美国国家科学院院报25，1988，8998-9002)和Edwards等(核酸研究19，1991，5227-5232)描述的修改过的RACE(＝快速扩增cDNA末端)方法，并用上述提到的引物(Cal6和Cal9)和来源于ESTAA050030的序列，可能克隆出被克隆的CAPN6的完整序列。SEQIDNO.1编码具有641个氨基酸，分子量为74.6kDa的蛋白。由一条经典序列位于甲硫氨酸起始密码子之前开始翻译。该序列的正确性通过具有所述序列的几种cDNA克隆的测序证实。图2显示小鼠CAPN5(＝nCL-3)、人CAPN5(＝nCL-3)、小鼠CAPN6(＝nCL-4)和人CAPN6(＝nCL-4)之间的同源性。图2也显示秀丽隐杆线虫tra-3、人p94、小鼠m钙蛋白酶、人μ钙蛋白酶和大鼠nCL-2的序列。各种钙蛋白酶和CAPN6之间一致的氨基酸用黑框表示。点线表示在其上获得最大的序列一致性的间隙。为简洁起见，从人p94序列中缺失了2条序列。这些区域用＝标示。催化中心的保守氨基酸用箭头表示。相当于CAL6和CAL9的氨基酸序列加下划线。结构域的名称表示为上述有关序列的片段。图3显示各种钙蛋白酶的系统发育谱系。用排除间隔的最近邻法(Saitou等，分子生物学进化4，1987，406-425)，进行系统发育分析以构建该谱系。用这些系统发育分析的结果协助下，有可能将脊椎动物钙蛋白酶分成6个不同的组(图3，右手边)。无脊椎动物钙蛋白酶作为最近邻蛋白归类到CAPN5-(＝nCL-3-)和CAPN6-(＝nCL-4-)组并形成它们自己的组。因此每种CAPN5和CAPN6基因形成它们自己的钙蛋白酶组，该组与无脊椎动物钙蛋白酶的相似性比脊椎动物钙蛋白酶更大。水平线的长度与各种钙蛋白酶之间系统发育的距离成比例。垂直线的长度没有意义。用于构建系统发育谱系的序列具有下列SWISSPROT和EMBL序号(登记号)人m(p17655)、μ(p07384)、p94(p20807)；大鼠m(Q07009)、nCL-2(D14480)、p94(p16259)；小鼠p94(X92523)；鸡m(D38026)、μ(D38027)、μ/m(p00789)、p94(D38028)；线虫tra-3(U12921)；果蝇CalpA(Q11002)和Dm(X78555)，血吸虫(p27730)。人nCL-2的部分序列相当于EST克隆AA026030的翻译物(Hellier等，1995，WashU-MerckEST规划)。根据本分析，EST克隆AA026030衍生的氨基酸序列比大鼠nCL-2序列的一般同源性更大。由于仅部分序列用于本分析，对nCL-2获得的系统发育谱系的不准确性也更大。线虫CPL1序列是Barnes和Hodjkin用的校正序列(EMBOJ1996，154477-4484)。用第一部分7个外显子，因为它们能从EMBL数据库(登记号L25598)得到，尽管最后的5个外显子可通过连接核苷酸8028-8133、8182-8239、8729-8818、8865-8963和9083直至末端得到。所衍生的N-末端序列，由于其长度和有许多甘氨酸残基，就钙蛋白酶而言并不常见。新型的组织特异的钙蛋白酶CAPN6仅在胎盘组织表达(图4)。人的胎盘表现为快速生长和快速分化的器官。因而也被认为作“前恶性组织，因为它是高度侵袭性组织，与恶性肿瘤的侵袭性相似。蛋白酶在发育和细胞分化中起中心作用，因此也在胎盘中起作用，胎盘富含蛋白酶和蛋白酶抑制剂，二者处平衡态，使胎盘有可能发育。CAPN6似乎在此过程中作为蛋白酶起重要的作用，和/或可能与其他半胱氨酸钙蛋白酶的调控有关。有可能该蛋白与诸如妊娠中毒(＝子痫前期)的胎盘病理过程有关，妊娠中毒发生率占全部怀孕妇女的5～7％。子痫前期(＝由怀孕所诱导的高血压)是孕期最普遍的并发症之一，其特征为高度紧张和蛋白尿，通常伴有过度的浮肿，在某些情况下，伴有惊厥。怀孕期间的子痫前期是母亲和孩子死亡的重要原因，早产的重要原因，或者在较轻微的情况下为胚胎营养不良或生长失调的重要原因。这是多因素事件，其中涉及例如遗传因素(隐性或显性基因)、母亲免疫耐受、血管舒张因子/血管收缩因子失去平衡，以及可能也包括CAPN6。患有子痫前期的妇女改变血管加压肽和血管紧张肽酶的水平，该两种酶可能以调节方式受CAPN6的影响。CAPN6的另一个可能的功能可能在胎盘中调节促生长素抑制素、高血糖素和生长激素的降解，而因此影响胎儿的生长。同样刺激胎儿生长的母亲血清蛋白的降解也可能受CAPN6影响。有可能CAPN6涉及胚胎发生中胎盘粘膜的复杂事件，并因此例如调节其他钙蛋白酶控制由TNFα和IFNγ诱导的滋养层细胞凋亡。因此，CAPN6似乎与胚胎发育有关。为了鉴别选择性的钙蛋白酶抑制剂，需要尽可能特异地鉴别抑制剂的方法。在此方面重要的是所选出的抑制剂仅抑制所要求的钙蛋白酶，但不抑制其他半胱氨酸蛋白酶，因而干扰生理过程。待研究其抑制活性的测试物质例如可能是化学物质、微生物或植物提取物。除了测定对其抑制CAPN6、I型和/或II型钙蛋白酶的活性外，一般也测定它们对组织蛋白酶B或其他硫醇蛋白酶的抑制活性。理想地，良好的抑制剂应该显示对组织蛋白酶B、L、弹性酶、番木瓜酶、胰凝乳蛋白酶或其他半胱氨酸蛋白酶微弱或没有活性，但显示对I和II型钙蛋白酶有良好的活性。根据本发明，有可能把新型的组织特异的钙蛋白酶CAPN6用于鉴别抑制剂的方法，该方法能在包括钙蛋白酶I、II、nCL-1、nCL-2和/或nCL-4的各种钙蛋白酶之间区别其抑制作用。为此目的，按下列方法进行各种抑制剂测定组织蛋白酶B测定通过与S.Hasnain等，生物化学杂志268，1993，235-240描述相似的方法，测定组织蛋白酶B的抑制作用。制备待检测的化学物质、微生物或植物抽提物的抑制剂溶液2μl和DMSO(终浓度100μM-0.01μM)，加到88μl组织蛋白酶B液中(由Calbiochem公司提供来源于人肝脏的组织蛋白酶B，用500μM缓冲液稀释至5单位)。该混合液在室温下(＝25℃)预先温育60分钟，然后加10μl10mMZ-Arg-Arg-pNA(用10％DMSO溶在缓冲液中)开始反应。在微滴定板读数仪上405nM进行该反应30分钟。然后根据最大的斜率确定IC50值。I和II型钙蛋白酶测定在用Hammarsten酪蛋白(Merck，Darmstadt)作为底物的比色测定中，研究钙蛋白酶抑制剂的活性。按照Buroker-kilgore和Wang在分析生物化学208，1993，387-392中发表的方法，在微滴定板中进行本测定。所用的酶是来自红细胞的I型钙蛋白酶(0.04U/测定)和来自肾脏的II型钙蛋白酶(0.2U/测定)，两种酶均从猪中制取，由Calbiochem公司提供。待测定的物质和所述的酶在室温下温育60分钟，溶剂DMSO的浓度不超过1％。加入Bio-Rad显色剂后，在SLTEas/读数仪EAR400中595nm测定光密度。所述酶的50％活性根据没有抑制剂时该酶的最大活性和没有加钙时该酶活性所测定的光密度值确定。此外，用底物Suc-Leu-Tyr-AMC测钙蛋白酶抑制剂的活性。该荧光比色法由ZhaozhaoLi等，医学化学杂志36，1993，3472-3480中描述。由于钙蛋白酶是细胞内半胱氨酸蛋白酶，对于蛋白酶抑制剂必需能穿过细胞膜，以便防止由钙蛋白酶引起的细胞内蛋白的降解。某些已知的钙蛋白酶抑制剂如E64和亮抑蛋白酶仅较少透过细胞膜，因此，尽管它们是良好的钙蛋白酶抑制剂，对细胞仅有微弱的影响。因此，进行另外的测定检测潜在的钙蛋白酶抑制剂透过细胞膜的能力，如人血小板测定是有利的。血小板测定确定钙蛋白酶抑制剂的细胞内活性。在血小板中钙蛋白酶介导的蛋白降解按ZhaozhaoLi等，医学化学杂志，36，1993，3472-3480所述的方法进行。人血小板分离自由供体提供的新鲜柠檬酸钠血液，然后用缓冲液(5mMhepes，140mMNaCl和1mg/mlBSA，pH7.3)调整至107细胞/ml。血小板(O.1ml)在1μl各种浓度的潜在抑制剂(溶在DMSO中)预温育5分钟。然后加钙离子载体A23187(测定中1μM)和钙(测定中5mM)，然后37℃进一步温育5分钟。经离心步骤后，血小板分散在SDS-PAGE样品缓冲液中，然后95℃煮5分钟，所述的蛋白在8％凝胶中分离。2种蛋白肌动蛋白结合蛋白(＝ABP)和踝蛋白的降解情况用数量密度测定法进行。加入钙和离子载体后，这些蛋白不见了，却出现分子量低于200kd的新泳带。由此确定加抑制剂或作为对照未加抑制剂的最大酶活性的一半值。同样适于测定透过细胞膜能力的材料是如脑切片的部分组织或细胞培养物。对抑制CAPN6的测定在表达该蛋白的细胞中进行，从允许用特异的抗体检测该蛋白。如果细胞被例如钙和合适的离子载体刺激，这导致CAPN6的活化。TakaomiSaido在生物化学杂志11，1992，81-86中描述活化后μ钙蛋白酶的自我裂解转换并用抗体检测的结果。已生产了检测CAPN6的合适抗体。钙蛋白酶抑制剂阻止自我裂解转换并且相应的定性用抗体是可能的。除了描述过的体外测定和细胞血小板测定外，所有对技术人员熟知的其他钙蛋白酶测定都是合适的，例如在皮质神经元中抑制谷氨酰胺诱导的细胞死亡测定(Maulucci-GeddeM.A.等神经科学杂志，7，1987357-368)，在NT2细胞中钙介导的细胞死亡测定(SquierM.K.T.等，细胞生理学杂志159，1994229-237，PatelT.等，Faseb杂志，590，1996587-597)、或对组织样品诸如血影蛋白、MAPZ或tau等蛋白降解产物的分析(AmiArai等，脑研究，1991，555，276-280，JamesBrorson等，中风，1995，26，1259-1267)。对于体外CAPN6测定，钙蛋白酶或其动物或人类同源物从该酶正常或人工(如通过重组表达技术)的组织或组织中纯化，例如有利地是胎盘，或者从至少含1个基因拷贝和/或具有至少1个拷贝的CAPN6基因、其等位变异体或类似物的细胞或微生物中纯化，并将纯化物用作粗提取物或用作纯酶。根据本发明的方法，种种钙蛋白酶抑制剂测定和由潜在抑制剂抑制CAPN6酶活性的测定结合进行是有利的。这有必要选择仅抑制酶CAPN6并不抑制其他钙蛋白酶的抑制剂，或反之，仅抑制其他钙蛋白酶但不抑制酶CAPN6或抑制CAPN6或至少一种其他钙蛋白酶的抑制剂。CAPN6抑制剂用在妊娠中毒的疾病中是有利的。再者，各种抑制剂测定按这样的方式进行，除了测定所测试物质对CAPN6、I和/或II钙蛋白酶的抑制作用外，作为对照，测定在没有测试物质时进行。这种测定安排容易检测所测试物质的抑制作用。另一种根据本发明的方法，优选地用CAPN6或其等位变体、类似物或合成衍生物，以保护其他钙蛋白酶的酶解作用。另一种根据本发明的方法是使用酶CAPN6筛选新型的钙蛋白酶抑制剂，这些抑制剂一般明显地能抑制所有钙蛋白酶或抑制诸如钙蛋白酶I、II、nCL-1、nCL-2或CAPN6等单种钙蛋白酶。再者，各种测试物质能在检测系统中单独或平行测定。优选地在平行自动检测系统中从它们的抑制作用筛选这些测试物质。一般来说，所有物质适用于抑制剂测定。因此，所述的物质来源于例如经典的化学合成、来源于组合化学、或者来源于微生物、动物或植物抽提物。微生物抽提物指的是，例如发酵液、微生物的破碎细胞或生物转化的物质。细胞各部分分离物也适于测定。适用于克隆CAPN6基因或其动物同源物或其人同源物、其等位变体或类似物是所有适用于分离酶解活性基因产物的原核或真核表达系统。优选的表达系统是那些允许CAPN6基因序列在细菌、真菌或动物细胞中表达的那些系统，非常特别优选地在昆虫细胞中表达。酶解活性基因产物意味着从表达生物例如原核或真核细胞分离后或重新复性后直接提供为CAPN6蛋白，活性蛋白能至少裂解一种如上面提到的那些已知的钙蛋白酶底物，或自体催化作用自身。适用于确定钙蛋白酶的酶活性的测定是所对技术人员熟知的那些方法，例如上面描述的对I和II型钙蛋白酶测定的体外测定法，或如血小板测定的细胞测定法。可能用于检测的是根据比色法(Buroker-KilgoreM.等，分析生物化学，208，1993387-392)或荧光法的测定法。此外，CAPN6的酶解活性基因产物也意味着含有CAPN6基因和/或CAPN6基因的其他序列和/或其他钙蛋白酶基因序列和/或其他序列的催化中心的所有部分序列，并且显示为酶解活性。至于宿主生物意指适于作为宿主生物的所有原核或真核生物，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、浅青紫链霉菌、Streptococcuscarnosus等细菌，如酿酒酵母、裂殖酵母等酵母菌、如黑曲霉等真菌，如草地夜蛾、粉纹夜蛾细胞等昆虫细胞或所有适于病毒性表达的其他昆虫细胞，或者如CV1、COS、C127、3T3或CHO等的动物细胞，或人细胞。至于表达系统意味着上述按实施例形式提到的生物和对所述的生物合适的载体的组合，这些载体诸如质粒、病毒或如T7RNA聚合酶/启动子系统的噬菌体或具有对λ噬菌体调节序列的载体。术语表达系统优选地指大肠杆菌和其质粒和噬菌体或杆状病毒系统与相应地诸如草地夜娥的昆虫细胞的组合物。此外，其他的3′和/或5′末端序列用于根据本发明CAPN6基因的更好表达。使用这些调节序列的目的使CAPN6基因的特异表达成为可能。这意味着例如根据宿主生物所述的基因仅导入后表达或过表达，或者它立即表达和/或过表达。再者，调节序列和因子可能优选地对CAPN6基因表达有有利的影响，并因而增加CAPN6基因的表达。因此，通过使用诸如启动子和/或增强子的强转录信号，调节元件在转录水平有益地被增强。然而，除此之外，例如通过改善mRNA的稳定性也可能增强翻译作用。增强子指的是，例如通过RNA聚合酶和DNA之间改善的相互作用，导致增加CAPN6基因表达的DNA序列。一条或多条DNA序列可能位于CAPN6基因之前和/或后面，该CAPN6基因之前具有或没有启动子，和具有或没有调节基因，这样该基因存在在一基因结构中。此外，通过增加CAPN6基因的拷贝数能增加CAPN6基因的表达。CAPN6基因的拷贝数例如由在CHO表达载体中扩增而增加。合适的载体也是pED系列载体-双顺反子载体-该载体也含有能扩增的二氢叶酸脱氢酶标志基因。详细介绍能在分子生物学当代方法第2卷，1994，一书中找到。与起始酶相比较增加CAPN6酶活性能通过例如修饰CAPN6基因或其动物同源物而获得，这些修饰方法为经典诱变如紫外辐射或用化学诱变剂处理，和/或特异诱变如定点诱变、缺失、插入和/或替换。酶活性例如能通过修饰催化中心而增加，因此获得待裂解底物的更快转换率。除了所述的基因扩增法外，增加酶活性也能通过消除抑制酶生物合成的因素和/或在非活性CAPN6蛋白部位合成活性部分而获得。用这种方法，可能提供用于体外测定增加的酶量。CNPA6或其动物同源物或其人同源物能优选地从基因DNA或cDNA开始，例如用PCR技术克隆(见分子克隆，Sambrook，Fritsch和Maniatis，冷泉港，实验室出版社，第二版1989，14章1-35，ISBN0-87969-309-6和Saili等，科学239，1988，487和以下)，CAPN6能优选地用基因组DNA克隆，特别优选地用来自小鼠细胞或人细胞的基因组DNA克隆。适于用作克隆的宿主生物，例如是全部大肠杆菌菌株，优选的大肠杆菌菌株DH10B。用于克隆的合适载体是所有适于在大肠杆菌中表达的载体(见分子克隆，Sambrook，Fritsch和Maniatis，冷泉港，实验室出版社，第二版，1989，ISBN0-87969-309-6)。特别合适的实施例是来源于pBR或pUC的载体，或穿梭载体，而pBlubecripf是非常特别合适的。分离和测序后获得的是具有编码在SEQIDNO2中显示的氨基酸序列的核苷酸序列的CAPN6基因，或其等位变体。至于等位变体意味着CAPN6变体具有在氨基酸水平从60-100％的同源性，优选地70-100％，非常特别优选地80-100％。等位变体包括尤其是可从在SEQIDNO1或SEQIDNO3中表示的序列，通过核苷酸的缺失、插入或替换但仍保留CAPN6活性而获得的功能变体，序列(a)Leu-Gly-Asn-Lys-Ala，(b)Ala-X-Ser-Cys-Leu-Ala，(c)Gly-Tyr-Thr(His或Tyr)-Thr-X-Thr和(d)Arg-X-Arg-Asn-Pro-Leu-Gly也存在于CAPN6基因、类似物或衍生物中。至于CAPN6类似物指的是，例如其动物同源物、截短的序列、单链DNA或编码的RNA和非编码的DNA序列，尤其是反义RNA。CAPN6衍生物的实例是难以酶裂解或仅轻微酶解的那些衍生物，例如核酸磷酸酯或核酸硫代磷酸酯，其中核酸的磷酸盐基团已被膦酸酯或硫酯基团所取代。在所述的核苷酸序列前存在的启动子也能通过1个或多个核苷酸交换、插入和/或缺失，但不损害启动子的功能性或活性的方法修饰。此外，该启动子所具有的活性可通过修饰其序列，或完全被甚至来源于异源生物或合成起源的更活跃的启动子而增加。根据本发明的方法所鉴别的钙蛋白酶抑制剂适用于生产药物以治疗与钙蛋白酶功能紊乱有关的失调，例如治疗选自心血管病、免疫学病、炎症、过敏性病、神经性疾病、神经退行性疾病或肿瘤，这些疾病如再狭窄、关节炎、心脏缺血、肾缺血或中枢神经系统缺血(如中风)、炎症、肌肉萎缩、眼内白内障(如灰色白内障)、对中枢神经系统的损伤(如创伤)、阿尔茨海默病、HIV诱导的神经病、帕金森病和享延顿舞蹈病，优选地生产药物用于治疗诸如妊娠中毒等胎盘失调或胚胎发生失调。根据本发明，CAPN6基因序列也优选地适用于诊断各种失调或用于基因治疗。实施例实施例1CAPN6基因的克隆小鼠CAPN6序列(EMBL登记号Y12583)通过使用标记17小鼠胚胎和来源于ESTAA050030序列的引物序列，经RACE方法克隆得到。含有相当于EST序列的质粒克隆从I.M.A.G.E联盟(遗传研究国际公司)获得。用小鼠蛋白序列和tblastn算法在EST数据库中搜索同源性，获得人CAPN6同源物。把找到的部分序列结合起来可能得到具有1083个核苷酸长度的不完整的人CAPN6序列(SEQIDNO3)。实施例2在各种组织中CAPN6基因的表达用32P标记的人cDNA片段及Clontech公司提供的含有来自50个不同组织RNA的人RNA主印迹膜，检测在各种组织中CAPN6基因的表达。杂交和高度严格的清洗条件按照厂家的说明进行。用于表达实验的CAPN6cDNA片段为包括ESTAA050030的2.2kbEcoRI/XhoI片段。CAPN6仅在胎盘组织中表达(见图4)。作为对照，为了确定RNA的上样量，该印迹膜用人遍在蛋白DNA样品进行杂交。实施例3CAPN6基因在染色体上的定位。用NIGMS人/啮齿类体细胞杂交“作图组”(Coriell细胞贮藏所)体系定位人基因。用于PCR的引物序列如下5′gttgaaactgattggggtctg-3′和5′-ctgtcttcccaaggggtttctc-3′。PCR扩增用退火温度58℃进行，并产生一条200bp的片段。结果由人染色体存在片段和PCR产物之间的一致性校验。用斯坦福G3RH组(遗传研究公司)并把PCR结果传递给斯坦福人基因组中心定位服务机构(http//www-shgc.stanford.edu)，找到该基因在人染色体中的准确定位。人CAPN6基因在X染色体上找到，并与DXS7356标记耦联。实施例4组织蛋白酶B测定用与S.Hasnain等，生物化学杂志，268，1993，235-240描述的相似方法，确定组织蛋白酶B的抑制作用。制备来自抑制剂和DMSO的2μl抑制剂溶液(终浓度100μM～0.01μM)加到88μl组织蛋白酶B液中(组织蛋白酶B来自人肝脏，由Calbiochem公司提供，在500μM缓冲液中稀释至5单位)。该混合液在室温下(＝25℃)预先温育60分钟，然后加10μl10mMZ-Arg-Arg-pNA(用10％DMSO溶在缓冲液中)开始反应。在微滴定板读数仪上405nm进行反应30分钟。然后根据最大的斜率值确定IC50值。实施例5钙蛋白酶测定用比色测定法和Hammarsten酪蛋白(Merck，Darmstadf)作为底物，研究钙蛋白酶抑制剂的活性。按照Buroker-Kilgore和Wang在分析生物化学208，1993，387-392中发表的方法，在微滴定板中进行本测定。所用的酶是上面描述的系统之一中表达然后纯化的CAPN6。所述的物质与该酶在室温下温育60分钟，溶剂DMSO的浓度不超过1％。加入Bio-Rad显色剂后，在SLTEasyReaderEAR400中以595nM测定光密度。根据未加抑制剂时该酶的最大活性和未加钙时该酶的活性所测定的光密度值，确定该酶的50％活性。实施例6血小板测定以确定钙蛋白酶抑制剂的细胞活性。按zhaozhaoLi等医学化学杂志36，1993，3472-3480中描述的方法，进行钙蛋白酶介导的血小板中的蛋白降解实验。人血小板从来自供体的新鲜柠檬酸钠血液中分离，然后用缓冲液(5mMHepes，140mMNaCl和1mg/mlBSA，pH7.3)调整至107细胞/ml。血小板(0.1ml)在1μl各种浓度的抑制剂(溶在DMSO中)〔SiC〕预先温育5分钟。然后加入钙离子载体A23187(在测定中1μM)和钙(在测定中5mM)，在37℃进一步温育5分钟。经离心步骤后，血小板溶在SDS-page样品缓冲液中，然后在95℃煮5分钟，在8％凝胶中分离蛋白。通过数量密度法检测到2种蛋白肌动蛋白结合蛋白(＝ABP)和踝蛋白降解，因为加钙和离子载体后，这些蛋白不见了。然后在200kd分子量区出现一条新带。根据此方法，确定最大酶活性的一半值。序列表(1)一般资料(i)申请者(A)名字BASFAktiengesellschaft(B)街道CarlBoschStrasse(C)城市Ludwigshafen(D)州Rheinland-Pfalz(E)国家德国(F)邮政编码D-67056(ii)申请题目新型的组织特异钙蛋白酶，这些蛋白的制备方法和用途(iii)序列数4(iv)计算机可读资料(A)介质类型Floppy软盘(B)计算机IBMPC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PateatInRelease#1.0Version#1.25(EPO)(2)SEQIDNO1的资料(i)序列特征(A)长度2069个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(iii)假拟结构无(iii)反义序列无(vi)生物来源(A)生物小家鼠(vii)直接来源(B)克隆CAPN6(ix)特征(A)名称/关键词5′UTR(B)定位1..129(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位130..2055(ix)特征(A)名称/关键词3′UTR(B)定位2.056..2069(xi)序列描述SEQIDNO1GGGGTTACCTGGCTAAGAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGTAGCAGCAGCA60GCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGGGTTCCTGAGCTAACTCAGACCTAGT120TTGATAGCAATGGGTCCTCCTCTGAAGCTCTTCAAAAACCAGAAGTAC168MetGlyProProLeuLysLeuPheLysAsnGlnLysTyr1510CAAGAACTGAAGCAGGAGTGCATGAAGGATGGCCGCCTTTTCTGTGAC216GlnGluLeuLysGlnGluCysMetLysAspGlyArgLeuPheCysAsp152025CCAACCTTCCTACCGGAGAATGATTCTCTGTTTTTCAACCGGCTGCTT264ProThrPheLeuProGluAsnAspSerLeuPhePheAsnArgLeuLeu30354045CCTGGGAAGGTGGTGTGGAAGCGTCCACAGGACATTTCTGATGACCCC312ProGlyLysValValTrpLysArgProGlnAspIleSerAspAspPro505560CACCTGATTGTGGGCAACATCAGCAACCACCAGCTGATCCAGGGCAGA360HisLeuIleValGlyAsnIleSerAsnHisGlnLeuIleGlnGlyArg657075TTGGGGAACAAGGCAATGATCTCTGCATTTTCCTGTTTGGCTGTTCAG408LeuGlyAsnLysAlaMetIleSerAlaPheSerCysLeuAlaValGln808590GAGTCACACTGGACAAAGGCAATTCCCAACCACAAGGATCAGGAATGG456GluSerHisTrpThrLysAlaIleProAsnHisLysAspGlnGluTrp95100105GATCCTCGAAAGCCAGAGAAATACGCTGGAATCTTTCACTTCCGCTTC504AspProArgLysProGluLysTyrAlaGlyIlePheHisPheArgPhe110115120125TGGCATTTTGGAGAATGGACCGAGGTGGTGATTGATGACTTGCTTCCC552TrpHisPheGlyGluTrpThrGluValValIleAspAspLeuLeuPro130135140ACCATCAACGGAGATCTGGTCTTCTCATTCTCCACCTCCATGAATGAG600ThrIleAsnGlyAspLeuValPheSerPheSerThrSerMetAsnGlu145150155TTTTGGAATGCTCTACTGGAAAAAGCGTATGCAAAGCTGCTGGGCTGT648PheTrpAsnAlaLeuLeuGluLysAlaTyrAlaLysLeuLeuGlyCys160165170TATGAGGCTTTGGATGGTCTGACCATCACTGATATCATCATGGACTTC696TyrGluAlaLeuAspGlyLeuThrIleThrAspIleIleMetAspPhe175180185ACTGGCACACTGGCTGAAATCATTGACATGCAGAAAGGACGATACACT744ThrGlyThrLeuAlaGluIleIleAspMetGlnLysGlyArgTyrThr190195200205GATCTTGTTGAGGAGAAGTACAAGCTGTTTGGAGAACTGTACAAAACG792AspLeuValGluGluLysTyrLysLeuPheGlyGluLeuTyrLysThr210215220TTCACCAAAGGAGGTCTAATTTGCTGCTCCATTGAGTCTCCCAGCCAG840PheThrLysGlyGlyLeuIleCysCysSerIleGluSerProSerGln225230235GAGGAACAAGAAGTTGAAACAGACTGGGGACTACTGAAGGGTTATACC888GluGluGlnGluValGluThrAspTrpGlyLeuLeuLysGlyTyrThr240245250TACACCATGACTGATATTCGCAAGCTCCGTCTCGGAGAAAGACTTGTG936TyrThrMatThrAspIleArgLysLeuArgLeuGlyGluArgLeuVal255260265GAAGTCTTCAGTACTGAGAAGCTGTATATGGTTCGCCTAAGGAACCCA984GluValPheSerThrGluLysLeuTyrMetValArgLeuArgAsnPro270275280285TTGGGAAGACAGGAATGGAGTGGCCCCTGGAGTGAAATTTCAGAGGAG1032LeuGlyArgGlnGluTrpSerGlyProTrpSerGluIleSerGluGlu290295300TGGCAGCAACTGACTGTAACAGATCGCAAGAACCTAGGACTTGTTATG1080TrpGlnGlnLeuThrValThrAspArgLysAsnLeuGlyLeuValMet305310315TCTGATGATGGAGAATTTTGGATGAGTCTGGAAGATTTTTGCCACAAC1128SerAspAspGlyGluPheTrpMetSerLeuGluAspPheCysHisAsn320325330TTTCACAAACTGAATGTCTGCCGCAATGTGAATAATCCTGTTTTTGGC1176PheHisLysLeuAsnValCysArgAsnValAsnAsnProValPheGly335340345CGCAAGGAGCTGGAATCAGTGGTGGGATGTTGGACTGTGGATGATGAC1224ArgLysGluLeuGluSerValValGlyCysTrpThrValAspAspAsp350355360365CCTCTGATGAACCGATCAGGAGGTTGCTATAACAACCGTGATACCTTC1272ProLeuMetAsnArgSerGlyGlyCysTyrAsnAsnArgAspThrPhe370375380TTGCAGAATCCTCAGTACATTTTCACTGTGCCCGAGGATGGCCATAAA1320LeuGlnAsnProGlnTyrIlePheThrValProGluAspGlyHisLys385390395GTCATCATGTCACTGCAACAGAAGGACCTACGCACTTACCGCCGAATG1368ValIleMetSerLeuGlnGlnLysAspLeuArgThrTyrArgArgMet400405410GGAAGACCTGATAATTACATCATTGGTTTTGAGCTCTTCAAGGTGGAG1416GlyArgProAspAsnTyrIleIleGlyPheGluLeuPheLysValGlu415420425ATGAACCGAAGGTTCCGTCTTCACCATCTGTATATTCAGGAGCGTGCT1464MetAsnArgArgPheArgLeuHisHisLeuTyrIleGlnGluArgAla430435440445GGGACTTCCACTTATATCGACACCCGTACTGTGTTTCTGAGCAAGTAT1512GlyThrSerThrTyrIleAspThrArgThrValPheLeuSerLysTyr450455460CTGAAGAAGGGCAGCTACGTGCTTGTTCCAACCATGTTCCAACATGGC1560LeuLysLysGlySerTyrValLeuValProThrMetPheGlnHisGly465470475CGTACCAGTGAATTTCTGCTGAGGATCTTCTCTGAAGTGCCCGTCCAG1608ArgThrSerGluPheLeuLeuArgIlePheSerGluValProValGln480485490CTCAGGGAACTGACCTTGGACATGCCCAAGATGTCTTGCTGGAACCTG1656LeuArgGluLeuThrLeuAspMetProLysMetSerCysTrpAsnLeu495500505GCACGTGGCTACCCAAAGGTGGTTACCCAGATCACTGTCCACAGTGCT1704AlaArgGlyTyrProLysValValThrGlnIleThrValHisSerAla510515520525GAGGGCCTGGAGAAGAAGTATGCCAATGAAACTGTCAATCCATATCTG1752GluGlyLeuGluLysLysTyrAlaAsnGluThrValAsnProTyrLeu530535540ATCATCAAATGTGGAAAGGAGGAAGTCCGTTCCCCTGTCCAGAAGAAT1800IleIleLysCysGlyLysGluGluValArgSerProValGlnLysAsn545550555ACTGTGCATGCCATTTTTGACACGCAGGCCGTTTTCTACAGAAGGACC1848ThrValHisAlaIlePheAspThrGlnAlaValPheTyrArgArgThr560565570ACTGACATTCCTATTATCATCCAGGTGTGGAACAGCAGAAAATTCTGT1896ThrAspIleProIleIleIleGlnValTrpAsnSerArgLysPheCys575580585GATCAGTTCCTGGGGCAGGTTACTCTCGATGCTGACCCCAGCGACTGC1944AspGlnPheLeuGlyGlnValThrLeuAspAlaAspProSerAspCys590595600605CGTGATCTGAAATCTCTGTACCTGCGTAAGAAGGGTGGTCCTACTGCC1992ArgAspLeuLysSerLeuTyrLeuArgLysLysGlyGlyProThrAla610615620AAAGTCAAGCAAGGTCACATCAGCTTCAAAGTTATCTCTAGCGATGAT2040LysValLysGlnGlyHisIleSerPheLysValIleSerSerAspAsp625630635CTCACTGAGCTCTAAGTAGTCATCATCAG2069LeuThrGluLeu640(2)SEQIDNO2的资料(i)序列特征(A)长度641个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQIDNO2MetGlyProProLeuLysLeuPheLysAsnGlnLysTyrGlnGluLeu151015LysGlnGluCysMetLysAspGlyArgLeuPheCysAspProThrPhe202530LeuProGluAsnAspSerLeuPhePheAsnArgLeuLeuProGlyLys354045ValValTrpLysArgProGlnAspIleSerAspAspProHisLeuIle505560ValGlyAsnIleSerAsnHisGlnLeuIleGlnGlyArgLeuGlyAsn65707580LysAlaMetIleSerAlaPheSerCysLeuAlaValGlnGluSerHis859095TrpThrLysAlaIleProAsnHisLysAspGlnGluTrpAspProArg100105110LysProGluLysTyrAlaGlyIlePheHisPheArgPheTrpHisPhe115120125GlyGluTrpThrGluValValIleAspAspLeuLeuProThrIleAsn130135140GlyAspLeuValPheSerPheSerThrSerMetAsnGluPheTrpAsn145150155160AlaLeuLeuGluLysAlaTyrAlaLysLeuLeuGlyCysTyrGluAla165170175LeuAspGlyLeuThrIleThrAspIleIleMetAspPheThrGlyThr180185190LeuAlaGluIleIleAspMetGlnLysGlyArgTyrThrAspLeuVal195200205GluGluLysTyrLysLeuPheGlyGluLeuTyrLysThrPheThrLys210215220GlyGlyLeuIleCysCysSerIleGluSerProSerGlnGluGluGln225230235240GluValGluThrAspTrpGlyLeuLeuLysGlyTyrThrTyrThrMet245250255ThrAspIleArgLysLeuArgLeuGlyGluArgLeuValGluValPhe260265270SerThrGluLysLeuTyrMetValArgLeuArgAsnProLeuGlyArg275280285GlnGluTrpSerGlyProTrpSerGluIleSerGluGluTrpGlnGln290295300LeuThrValThrAspArgLysAsnLeuGlyLeuValMetSerAspAsp305310315320GlyGluPheTrpMetSerLeuGluAspPheCysHisAsnPheHisLys325330335LeuAsnValCysArgAsnValAsnAsnProValPheGlyArgLysGlu340345350LeuGluSerValValGlyCysTrpThrValAspAspAspProLeuMet355360365AsnArgSerGlyGlyCysTyrAsnAsnArgAspThrPheLeuGlnAsn370375380ProGlnTyrIlePheThrValProGluAspGlyHisLysValIleMet385390395400SerLeuGlnGlnLysAspLeuArgThrTyrArgArgMetGlyArgPro405410415AspAsnTyrIleIleGlyPheGluLeuPheLysValGluMetAsnArg420425430ArgPheArgLeuHisHisLeuTyrIleGlnGluArgAlaGlyThrSer435440445ThrTyrIleAspThrArgThrValPheLeuSerLysTyrLeuLysLys450455460GlySerTyrValLeuValProThrMetPheGlnHisGlyArgThrSer465470475480GluPheLeuLeuArgIlePheSerGluValProValGlnLeuArgGlu485490495LeuThrLeuAspMetProLysMetSerCysTrpAsnLeuAlaArgGly500505510TyrProLysValValThrGlnIleThrValHisSerAlaGluGlyLeu515520525GluLysLysTyrAlaAsnGluThrValAsnProTyrLeuIleIleLys530535540CysGlyLysGluGluValArgSerProValGlnLysAsnThrValHis545550555560AlaIlePheAspThrGlnAlaValPheTyrArgArgThrThrAspIle565570575ProIleIleIleGlnValTrpAsnSerArgLysPheCysAspGlnPhe580585590LeuGlyGlnValThrLeuAspAlaAspProSerAspCysArgAspLeu595600605LysSerLeuTyrLeuArgLysLysGlyGlyProThrAlaLysValLys610615620GlnGlyHisIleSerPheLysValIleSerSerAspAspLeuThrGlu625630635640Leu(2)SEQIDNO3的资料(i)序列特征(A)长度1125个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(iii)假拟结构无(iii〔sic〕)反义序列无(vi)生物来源(A)生物人类(vii)直接来源(B)克隆CAPN6(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位2..1125(xi)序列描述SEQIDNO3GCTTGTTGAGGAGAAGTACAAGCTATTCGGAGAACTGTACAAAACA46LeuValGluGluLysTyrLysLeuPheGlyGluLeuTyrLysThr151015TTTACCAAAGGTGGTCTGATCTGCTGTTCCATTGAGTCTCCCAATCAG94PheThrLysGlyGlyLeuIleCysCysSerIleGluSerProAsnGln202530GAGGAGCAAGAAGTTGAAACTGATTGGGGTCTGCTGAAGGGCCATACC142GluGluGlnGluValGluThrAspTrpGlyLeuLeuLysGlyHisThr354045TATACCATGACTGATATTCGCAAAATTCGTCTTGGAGAGAGACTTGTG190TyrThrMetThrAspIleArgLysIleArgLeuGlyGluArgLeuVal505560GAAGTCTTCAGTGCTGAGAAGCTGTATATGGTTCGCCTGAGAAACCCC238GluValPheSerAlaGluLysLeuTyrMetValArgLeuArgAsnPro657075TTGGGAAGACAGGAATGGAGTGGCCCCTGGAGTGAAATTTCTGAAGAG286LeuGlyArgGlnGluTrpSerGlyProTrpSerGluIleSerGluGlu80859095TGGCAGCAACTGACTGCATCAGATCGCAAGAACCTGGGGCTTGTTATG334TrpGlnGlnLeuThrAlaSerAspArgLysAsnLeuGlyLeuValMet100105110TCTGATGATGGAGAGTTTTGGATGAGCTTGGAGGACTTTTGCCGCAAC382SerAspAspGlyGluPheTrpMetSerLeuGluAspPheCysArgAsn115120125TTTCACAAACTGAATGTCTGCCGCAATGTGAACAACCCTATTTTTGGC430PheHisLysLeuAsnValCysArgAsnValAsnAsnProIlePheGly130135140CGAAAGGAGCTGGAATCGGTGTTGGGATGCTGGACTGTGGATGATGAT478ArgLysGluLeuGluSerValLeuGlyCysTrpThrValAspAspAsp145150155CCCCTGATGAACCGCTCAGGAGGCTGCTATAACAACCGTGATACCTTC526ProLeuMetAsnArgSerGlyGlyCysTyrAsnAsnArgAspThrPhe160165170175CTGCAGAATCCCCAGTACATCTTCACTGTGCCTGAGGATGGGCACAAG574LeuGlnAsnProGlnTyrIlePheThrValProGluAspGlyHisLys180185190GTCATTATGTCACTGCAGCAGAAGGACCTGCGCACTTACCGCCGAATG622ValIleMetSerLeuGlnGlnLysAspLeuArgThrTyrArgArgMet195200205GGAAGACCTGACAATTACATCATTGGCTTTGAGCTCTTCAAGGTGGAG670GlyArgProAspAsnTyrIleIleGlyPheGluLeuPheLysValGlu210215220ATGAACCGCAAATTCCGCCTCCACCACCTCTACATCCAGGAGCGTGCT718MetAsnArgLysPheArgLeuHisHisLeuTyrIleGlnGluArgAla225230235GGGACTTCCACCTATATTGACACCCGCACAGTGTTTCTGAGCAAGTAC766GlyThrSerThrTyrIleAspThrArgThrValPheLeuSerLysTyr240245250255CTGAAGAAGGGCAACTATGTGCTTGTCCCAACCATGTTCCAGCATGGT814LeuLysLysGlyAsnTyrValLeuValProThrMetPheGlnHisGly260265270CGCACCAGCGAGTTTCTCCTGAGAATCTTCTCTGAAGTGCCTGTCCAG862ArgThrSerGluPheLeuLeuArgIlePheSerGluValProValGln275280285CTCAGGGAACTGACTCTGGACATGCCCAAAATGTCCTGCTGGAACCTG910LeuArgGluLeuThrLeuAspMetProLysMetSerCysTrpAsnLeu290295300GCTCGTGGCTACCCGAAAGTAGTTACTCAGATCACTGTTCACAGTGCT958AlaArgGlyTyrProLysValValThrGlnIleThrValHisSerAla305310315GAGGACCTGGAGAGGAGGTATGCCAATGGAACTGTAAACCCATATTTG1006GluAspLeuGluArgArgTyrAlaAsnGlyThrValAsnProTyrLeu320325330335GTCATCAAATGTGGAAAGGAGGAAGTCCGTTCTCCTGTCCAGAAAAAT1054ValIleLysCysGlyLysGluGluValArgSerProValGlnLysAsn340345350ACAGTTCATGCCATTTTTGACACCCATGCCATTTTCTACAGAAGGACC1102ThrValHisAlaIlePheAspThrHisAlaIlePheTyrArgArgThr355360365ACGGACATTCCTATTATAGTACA1125ThrAspIleProIleIleVal370(2)SEQIDNO4的资料(i)序列特征(A)长度374个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQIDNO4LeuValGluGluLysTyrLysLeuPheGlyGluLeuTyrLysThrPhe151015ThrLysGlyGlyLeuIleCysCysSerIleGluSerProAsnGlnGlu202530GluGlnGluValGluThrAspTrpGlyLeuLeuLysGlyHisThrTyr354045ThrMetThrAspIleArgLysIleArgLeuGlyGluArgLeuValGlu505560ValPheSerAlaGluLysLeuTyrMetValArgLeuArgAsnProLeu65707580GlyArgGlnGluTrpSerGlyProTrpSerGluIleSerGluGluTrp859095GlnGlnLeuThrAlaSerAspArgLysAsnLeuGlyLeuValMetSer100105110AspAspGlyGluPheTrpMetSerLeuGluAspPheCysArgAsnPhe115120125HisLysLeuAsnValCysArgAsnValAsnAsnProIlePheGlyArg130135140LysGluLeuGluSerValLeuGlyCysTrpThrValAspAspAspPro145150155160LeuMetAsnArgSerGlyGlyCysTyrAsnAsnArgAspThrPheLeu165170175GlnAsnProGlnTyrIlePheThrValProGluAspGlyHisLysVal180185190IleMetSerLeuGlnGlnLysAspLeuArgThrTyrArgArgMetGly195200205ArgProAspAsnTyrIleIleGlyPheGluLeuPheLysValGluMet210215220AsnArgLysPheArgLeuHisHisLeuTyrIleGlnGluArgAlaGly225230235240ThrSerThrTyrIleAspThrArgThrValPheLeuSerLysTyrLeu245250255LysLysGlyAsnTyrValLeuValProThrMetPheGlnHisGlyArg260265270ThrSerGluPheLeuLeuArgIlePheSerGluValProValGlnLeu275280285ArgGluLeuThrLeuAspMetProLysMetSerCysTrpAsnLeuAla290295300ArgGlyTyrProLysValValThrGlnIleThrValHisSerAlaGlu305310315320AspLeuGluArgArgTyrAlaAsnGlyThrValAsnProTyrLeuVal325330335IleLysCysGlyLysGluGluValArgSerProValGlnLysAsnThr340345350ValHisAlaIlePheAspThrHisAlaIlePheTyrArgArgThrThr355360365AspIleProIleIleVal370权利要求1.具有序列SEQIDNO.1或SEQIDNO.3的CAPN6钙蛋白酶基因，其等位变体、类似物或衍生物，在推知的氨基酸水平上它们具有60-100％的同源性，其中该钙蛋白酶基因、它们的等位变体、类似物或衍生物含有下列序列(a)Leu-Gly-Asn-Lys-Ala，其中，该序列与人I型钙蛋白酶相应的序列不同，因为在人I型钙蛋白酶中占据115位的氨基酸半胱氨酸已改变为在序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.3中81位的赖氨酸；(b)Ala-X-Ser-Cys-Leu-Ala，其中，与人I型钙蛋白酶相应的序列相比较，在122位和125位的氨基酸丙氨酸和苏氨酸已改变为在序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.3中88位和91位的丝氨酸和丙氨酸；(c)Gly-Tyr-Thr-(His或Tyr)-Thr-X-Thr，其中，与人I型钙蛋白酶相应的序列相比较，272、273和275位中的氨基酸组氨酸、丙氨酸和丝氨酸已改变为在序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.3中252、253和255位的酪氨酸、苏氨酸和苏氨酸，此外在SEQIDNO.3中，I型钙蛋白酶中274位的酪氨酸残基已改变为SEQIDNO.3中254位的组氨酸；(d)Arg-X-Arg-Asn-Pro-Leu-Gly其中，该序列与人I型钙蛋白酶相应的序列不同，因为在人I型钙蛋白酶中占据298位的氨基酸色氨酸已改变在序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.3中286位的亮氨酸，以及在所述的序列中X是任何天然的氨基酸。2.一种按在权利要求1中所要求的包括CAPN6钙蛋白酶基因、其等位变体或类似物的基因构建体，并且它与一种或多种调节信号功能性连接以增加基因表达。3.由权利要求1的CAPN6基因、等位变体或类似物编码的氨基酸序列。4.权利要求3的氨基酸序列，它是具有酶活性的蛋白序列。5.一种鉴别钙蛋白酶抑制剂的方法，其中从组织或细胞中分离由权利要求1的序列编码的钙蛋白酶、其等位变体或类似物，并且测定由测试物质对酶CAPN6底物裂解的抑制作用，及至少在一项其他测验中，对I和/或II型钙蛋白酶底物裂解的抑制作用，然后选出了抑制酶CAPN6和至少一种其他钙蛋白酶的测试物质。6.权利要求5的方法，其中选出了不抑制酶CAPN6但抑制I和/或II型钙蛋白酶的测试物质。7.权利要求5的方法，其中选出了抑制酶CAPN6但不抑制I和/或II型钙蛋白酶的测试物质。8.权利要求5-7中任一项的方法，其中选出了在细胞系统中能穿过细胞膜的测试物质。9.一种制备酶CAPN6和其等位变体或类似物的方法，该方法包括将权利要求1的至少1个拷贝的编码CAPN6、其等位变体或类似物的基因序列克隆到一种载体中，然后在对载体适合的宿主生物中表达编码酶CAPN6、其等位变体或类似物的基因，接着从该宿主生物中分离所述的酶。10.权利要求9的方法，其中所用的载体使所述的基因、其等位变体或类似物可能在原核或真核细胞中表达。11.一种按权利要求9所要求的方法，其中用作宿主生物的细菌，真菌或动物细胞。12.一种按权利要求9所要求的方法，其中用作载体的是杆状病毒而用作宿主生物的是昆虫细胞。13.按权利要求5-8中任一项所能够鉴别的蛋白酶抑制剂的用于生产药物以治疗存在钙蛋白酶功能不良的失调中的用途。14.权利要求13的钙蛋白酶抑制剂，用于生产药物，以治疗选自心血管病、免疫病、炎症、过敏性疾病、神经性疾病、神经退行性病或肿瘤等失调的用途。15.权利要求3的氨基酸序列在测定系统中的用途。16.权利要求3的氨基酸序列在生产抗体方面的用途。17.权利要求1的基因序列、其等位变体或类似物在生产反义mRNA方面的用途。18.权利要求17的反义mRNA，在用于生产药物，以治疗存在钙蛋白酶功能不良的失调的用途。19.按权利要求1中所要求的钙蛋白酶基因和其等位变体或类似物在诊断各种失调或在基因治疗方面的用途。全文摘要本发明涉及新型的组织特异钙蛋白酶和这些蛋白的生产方法。本发明也涉及一种筛选新的钙蛋白酶抑制剂的方法和这些抑制剂的用途。文档编号A61P25/28GK1277634SQ98810562公开日2000年12月20日申请日期1998年8月19日优先权日1997年8月26日发明者T·贝姆,N·T·德尔申请人:Basf公司