专利名称：一种治疗老年性痴呆症、帕金森症、心脑血管病的药物的制作方法
技术领域：
本发明治疗老年性痴呆症、帕金森症、心脑血管病的疗效来自其原料所含的各种有效成分，这些有效成分已为西方尖端医学、生理学的实验研究所证实，下面就本药物中的各种有效成分作详细说明。
1神经生长因子(nerve growth factor,NGF)的生理和保健作用神经细胞的生长、分化过程有三个阶段，先是由特定神经母细胞分裂增殖，然后向特定部移行、伸展，最后形成互相联系的网络。NGF在促进神经细胞分裂增殖，诱导轴突生长，形成突触网络这三个阶段中都发挥着重要作用。NGF对交感神经和感觉神经元的生存和生长是不可缺少的。给发育期动物注射抗NGF血清，除去体内天然的NGF后，动物的交感神经链便不发育。实验证明，NGF能促进多胺合成酶和鸟氨酸脱羧酶(ODC)活性增强，交感神经节细胞在发生期对这类酶的依赖性很强，越是幼稚期对酶的促进作用越强。摄入神经细胞内的NGF能加速神经递质的合成。在交感神经细胞内能增加酪氨酸羟化酶活性，使儿茶酚胺类递质合成加快。这一过程并非通过第二信使cAMP起作用，而是酶蛋白合成增加。NGF也能促进感觉神经元P物质的合成。
2脑源神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)可从猪等哺乳动物脑中分离出来，是一种碱性蛋白，等电点10，分子量12.3kD。脑内主要分布在海马部位，每克猪脑能提取BDNF5ng。BDNF的生理和保健作用；能促进胚胎视网膜神经节细胞和中脑黑质多巴胺能神经元的生长和存活，对脊髓背根节细胞和颅神经感觉神经元也有营养作用，促进其轴突生长，延长体外培养的存活时间。
3神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)是NGF家族中的第三成员，又称NGF-2或海马衍生NTF。成熟NT-3是119个氨基酸组成的多肽，等电点9.5。NT-3能促进背根神经节感觉神经元的轴突生长和延长存活时间，能加速结状节和交感神经节细胞轴突的生长。
4成纤维细胞生长在子(fibroblast growth factor,FGF).FGF是一种蛋白分裂原，在这一家族中已先后发现有7种结构相似的生长因子，其中FGF-1和FGF-2(或称aFGF和bFGF)这两种因子的受体，与神经系统生长发育关系密切。FGF能刺激大多数来源于中胚层和神经外胚层细胞的分裂增殖，如血管内皮细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、成骨骼肌细胞、晶体上皮细胞、虹膜细胞等。在早期胚胎发育期，FGF能诱导中胚层的形成，使一些胚胎细胞向着中胚层细胞模式分化。研究发现，FGF是具有明显神经营养活性的细胞生长因子。小量FGF-2就能使培养中的海马神经细胞存活时间延长，突起增多。FGF-2对许多中枢神经元都有这种类似的作用。FGF-1对维持视网膜节细胞的生存明显高于FGF-2。FGF-2可增加胆碱能中隔神经细胞的存活，挽救受到损伤的神经元。FGF-2对星形胶质细胞也具有营养活性；能促进肉芽组织(主要是小血管和纤维细胞)新生，加速创口的愈合。
5上皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)是由53个氨基酸构成的单链多肽。分子量6045，等电点4.6，耐热，100℃水中30分钟仍不失活。人EGF(hEGF)与小鼠EGF(mEGF)结构很相似，在53个氨基酸中37个相同，双硫键的位置也相同。EGF的作用主要是刺激皮肤和中胚层细胞生长。对乳腺上皮细胞、皮纤维细胞、呼吸道与胃肠道上皮细胞、平滑肌细胞、肝细胞、血管内皮细胞以及卵巢颗粒细胞等均有促生长和增殖活性。EGF能增加神经细胞的存活时间，促进轴突生长，加速胶质细胞的增殖。在EGF的作用下，K+和葡萄糖等小分子物质进入细胞内速度加快，并加速糖的分解，使乳酸增加。EGF还能促进RNA、DNA和蛋白质的合成。
6、乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)。Ach对神经组织的生物效应相当广泛，包括对神经——肌肉的接头处、自主神经节、胆碱能神经元和神经元通路(外围及中枢)都有广泛的生物效应。由于胆碱能神经元在中枢分布很广，有证实的是上行网状系统、边缘系统、运动系统、感觉系统等，Ach效应有的是兴奋性，有的是抑制性，一般说以兴奋性为主，此外Ach对摄食、饮水、体温、血压等调节中枢都有特定的效应，具体的生物效应，有以下几方面①促进磷酯酸及磷脂酰肌醇类的合成。②促进生物胺的释放；Ach促进嗜铬细胞释放儿茶酚胺，促使肥大细胞释放组胺。③促进神经组织释放硫胺近年发现，Ach灌注神经组织试验中，发现促进硫胺类物质的释放。临床上已证实Ach对治疗老年性痴呆症有疗效，能改善患者的记忆力和认知能力。
7、组胺(histamine,HA)，它的疗效除了具有扩张血管增加毛细血管通透性外，还有①边缘系统的功能组胺能神经元投射至许多边缘系统结构如海马、杏仁核、伏隔核等结构，因而以为其与情感的控制，记忆功能和植物性功能的调节有关。②对神经系统的作用可引起逆向性的血管扩张和轴索反射，与周围神经感觉的起始和传递有关。
8、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide-,CGRP)、CGRP前体由128个氨基酸残基组成，分子量为16KD，含有一个与CT前体相同的76个氨基酸的N端序列。CGRP有强大的扩血管作用，使脑血流量明显增加。
9、神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)。NPY可增加交感神经支配的平滑肌对去甲肾上腺素的敏感性，可降低血压、减慢心率。
11环核苷酸。它是重要的细胞内信使；在许多细胞系统中，细胞对各种调节讯号的应答是由3＇,5＇一环腺苷酸(cAMP)介导的。在神经系统中，神经递质、激素和神经调节剂对细胞cAMP含量或(和)3＇,5＇一环鸟苷酸(cGMP)有重要的调节作用，cAMP和cGMP是介导一些神经活动的细胞重要的调节作用，cAMP和cGMP是介导一些神经活动的细胞内信使。鸟苷酸调节蛋白(G蛋白)在受体信号的跨膜传递中起重要作用。在神经系统中，许多效应蛋白质，如腺苷酸环化酶、磷脂酶C、磷脂酶A2和磷酸二酯酶等的活性受G蛋白的调节。在信息的跨膜传递中，G蛋白是联系受体和效应蛋白质的“中继站”。
12、神经节苷脂(ganglioside)在神经系统中，神经节苷脂具有许多重要的功能。它是膜相关活性物质，特别浓集于神经元的突触部位。在神经系统发育的各个阶段，随着细胞分化，突触建立和髓鞘形成，神经节苷脂的含量和成分往往发生特殊的变化。神经节苷脂参与神经系统与环境的相互作用和信息传递过程，也与神经的可塑性以及学习记忆等高级活动有关。此外，神经节苷脂还具有促进神经元损伤后的再生作用。
13、利钠多肽家族包括心钠素、脑钠素、C型利钠肽，具有利钠、利尿、舒张血管、降低血压的作用。
上述多肽类神经营养因子在制备中经控制性酶解，如用CNBr处理后的蛋白酶消化NGF，在得到的11个多肽中，由双硫键结合的10-25肽和75-88肽具有100倍的NGF活性，这些小肽链能通过血脑屏障，作用于大脑。或者用胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶(thermoly-sin)消化得到三个小肽链。以上为注射用冻干粉剂和注射剂，至于口服制剂如胶囊剂，片剂、滴丸剂等，无需经基因工程蛋白酶控制性酶解，而是空腹服用，同时喝入300-500毫升白开水，使药物在胃内酶解的时间较短，是一种自然控制性酶解，使进入小肠的药物中多肽类成分，分解成有活性的小肽链，这些小肽链能通过血脑屏障。
试验中选择89例老年性痴呆症患者，每天注射本药物5μg，对照组55例，每天服用安慰剂。经4个月试验，结果本药物有效率81％。试验组患者病情转好，表现为记忆增强，定向力障碍减轻，CT检查大脑皮层停止萎缩。
试验中选择50例帕金森病患者，每天注射本药物5μg；对照组50例每天服用安慰剂。经4个月试验，结果本药物有效率74％，试验组患者的病情减轻，如震颤减少，或从packinson痴呆渐具语言、思维能力。
本药物用于脑血管病的预防和治疗。
试验中在脑血管病高危人群中选择100人，其中50人列为试验组，每天注射本药物3μg；对照组50人每天服用安慰剂，经4个月试验，试验组无1例发生出血性或缺血性脑血管病，对照组中有2例发病；试验后一年内，试验组无1例发病，对照组有7例发病。
试验中选择64例脑血管病患者，其中试验Ⅰ组30例为出血性脑血管病患者，试验Ⅱ组34例为缺血性脑血管病患者，Ⅰ组患者每天注射本药物5μg和需时用高渗性脱水剂(20％甘露醇、甘油盐水)或利尿药。Ⅱ组患者每天注射本药物4μg和需时用脑嗌嗪。对照组50例脑血管病患者，其中对照Ⅰ组25例为出血性脑血管病患者，每天服用安慰剂和需时用高渗性脱水剂和利尿剂，对照Ⅱ组25例为缺血性脑血管病患者，每天服用安慰剂和脑嗌嗪。经6个月试验，结果显示本药物对出血性脑血管病有效率为68％，对缺血性脑血管病有效率为76％。
试验中选择100例冠心病患者，每天注射本药物5μg和需时用硝酸甘油；对照组80例，每天服用安慰剂和需时用硝酸甘油；经5个月试验，试验组患者心绞痛或心肌梗塞发生次数比试验前减少85％，对照组未见减少。
试验中选择90例高血压患者，每天注射本药物4μg和服用异搏定(维拉帕米verapamil)，试验前试验组患者平均血压SBP179mmHg和DBP109mmHg；对照组90例，每天服用安慰剂和异搏定。经6个月试验，结果显示本药物有效率92％，试验组患者平均血压SBP136mmHg,DBP93mmHg。对照组平均血压比试验前只降低3-5mmHg。
试验中选择70例动脉粥样硬化患者，每天注射本药物3μg，对照组70例，每天服用安慰剂，经6个月试验，结果显示本药物有效率87％。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明是以神经生长因子(NGF)，脑源神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3(NT-3)，神经营养因子-4(NT-4)，神经营养因子-5(NT-5)，睫状神经营养因子(CNTF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，表皮生长因子(EGF)，神经节苷脂(ganglioside)，乙酰胆碱(Ach)，组胺(HA)，降钙素基因相关肽(CGRP)，神经肽Y(NPY)，环核苷酸(cAMP)，心钠素(atrialnatriuretic peptide.ANP)，脑钠素(brain natriuretic peptide-.BNP),C型利钠肽(c-type Natriuetic peptide.CNP)，前列环素(PGI2)，内皮细胞舒张因子(EDRF)为原料，上述原料可单独或混合制成治疗老年性痴呆症、帕金森症、脑血管病、冠心病、高血压、动脉粥样硬化的药剂。上述原料都可从动物器官中提取，或用基因工程技术大量生产，原料的制取为现有技术，以下是用基因工程技术制取原料的几个实例A、表皮生长因子(EGF)。
一、结构和性质hEGF的基因定位于人第4号染色体的q24～q26带。hEGF是53个氨基酸组成的单链多肽，分子量约6200；等电点为4.7；分子内不带糖基，N端为天冬酰胺，C端为精氨酸；有三个链内二硫键，分布在Cys6-Cys20,Cys14-Cys31以及Cys33-Cys12之间，在分子的二级结构中形成三个二硫化物环，对维持其生物活性所需的稳定空间构型十分重要。
hEGF具有热隐定性；容易放蛋白酶水解；它的三个二硫键难以正确配对，错配后，造成蛋白质分子重折叠而使生物活性降低或消失。因此，利用工程菌表达hEGF，保持这三个二硫键的正确性至关重要。通常采用分泌型表达有利于形成正确的空间结构。
二、生产工艺hEGF的成熟肽不含糖基化位点，活性与糖基无关，故适于在E.coli中表达。国内外已有多家实验室和公司在E.coli中成功表达了hEGF，所采用的启动子包括Ecoli碱性磷酸酯酶启动子(phoA)，外膜蛋白启动子(omp),Trp启动子和pk启动子等。由于hEGF是小分子多肽，在细菌细胞中不易形成包涵体，且在胞内聚集会招致蛋白酶攻击而降解。因此，表达的最佳策略是采用分泌型表达。目前最成功的是采用E.coli碱性磷酸酯酶基因(phoA)启动子和信号肽的分泌型表达。E.coli phoA启动子受phoA,phoM和phoR基因产物的调节，在低磷酸盐条件下被诱导合成大量碱性磷酸酯酶(APase)。在细菌细胞内，Apase是以带有信号肽的前体合成，然后由信号肽介导成熟的APase穿过细胞膜进入周质。如果将真核蛋白基因与phoA信号肽基因连接，二者之间不保留任何多余氨基酸，phoA信号肽就会得到加工，并将真核成熟肽转运到细菌膜外周质中。表达的外源蛋白可用渗透休克的方法纯化而无需破裂细菌。
首次构建了编码phoA启动子和信号肽的分泌型载体。其中之一是pTA1529。这个载体在phoA信号肽的3＇端有单一HindⅢ限制酶切点，可以容易地在这个位置插入外源结构基因，phoA信号肽和插入体之间无任何碱基插入或缺失。用HindⅢ切开pTA1529 DNA，用T4DNA聚合酶修复粘性末端，并用SalⅠ限制酶消化，回收SalⅠ-HindⅢ大片段。以同样方式从克隆质粒载体pTA1002中切出人工合成的hEGF结构基因，用T4DNA连接酶使之与pTA1529的SalⅠ-HindⅢ片段连接，构建成hEGF分泌型表达载体pTA1522。用pTA1522转化E.coli APase缺失突变株YK537，转化菌株于低磷酸盐条件下，30℃诱导培养9h，收集菌体，渗透休克处理，冻干。产物经SephadexG-50柱凝胶过滤，收集hEGF洗脱峰，冻干，干物质溶于水中，再经μbond pakc18柱层析，可得高纯度的重组hEGF，产量为2413μg/L培养物，或每个细胞1.8×105分子。
由于Apase和表达的hEGF的分泌使用相同的信号肽，所以E.coli内源APase可能会与hEGF的分泌发生竞争，抑制hEGF的分泌。使用Apase缺陷株YK537可避免这个问题的出现，使重组hEGF的回收量比在非APase缺陷株(如C600等)中提高5倍。另外试验结果表明，在30℃诱导9h比在37℃诱导6h产量提高2倍。
国内重组hEGF的生产亦采用类似的工艺路线。人工合成的hEGF结构基因由6个合成片段组成，共159个碱基对，在基因5＇端添加EcoRⅠ切点，3＇端添加。HindⅢ切点。将合成的hEGF基因与多拷贝质粒pI218R同样用EcoRⅠ-HindⅢ双酶切，并重组连接，用连接产物转化E.coli JM103菌株，分析筛选出重组质粒pEG14。利用合成的E.coli phoA基因启动子、信号肽编码序列和上述hEGF基因构建表达质粒p-AE-8。用此质粒转化YK537，筛选出hEGF表达最高的菌株EE-86做为工程菌株。将工程菌株37℃发酵培养，使细菌生长至A660nm=1以上，在含低浓度磷酸盐培养基中开始诱导其高效表达。诱导10h后，表达的hEGF90％以上分泌到培养基中，最高可达30mg/L培养基。取发酵液上清，经硫酸铵沉淀、透析、凝胶过滤层析、离子交换层析和反相HPLC，纯度可达98％以上。
利用补料分批培养(Fed-Batch culture)，在E.coli中大量生产了hEGF。他们构建的表达质粒载体是pTRLBT1，这个质粒含有trp启动子、trpL基因N-末端6个氨基酸的编码序列及融接在其下游的合成hEGF结构基因。用此质粒转比E.coliHB101，筛选出工程菌株。因为hEGF生产抑制细菌生长和细菌的乙酸盐同化作用，所以工程菌发酵采用补料分批培养方式，将细胞培养分为两个步骤。第一步，加色氨酸抑制trp启动子表达hEGF基因，使细胞生长；第二步，从培养基中撤除色氨酸，诱导trp启动子表达hEGF基因，生产hEGF。工程菌在5升发酵罐中培养，起始工作体积为2L，包括0.2L过夜菌种，1g/L葡萄糖和0.2ml抗泡沫剂。pH保持7，温度37℃，气体流速2L/min，搅拌速度400～1000r/min。用氨水(6mol/L)调pH。通过改变搅拌速度将溶解氧水平控制在1～3ppm。当搅拌速度达到最高1000r/min时，向发酵罐补充50％氧气以代替空气。通过检测乙酸盐浓度控制进料速度，以便使乙酸盐浓度维持在33mmol/L以下。饲养培养基(feeding medium)由200g/L葡萄糖，1000g/L酪蛋白水解物，60g/L酵母提取物，0.8g/L色氨酸和0.1g/L氨苄青霉素组成，pH7.0。在诱导hEGF基因表达时，从饲养培养基中排除酵母提取物和色氨酸。细菌培养8h改变培养基。培养基一改变hEGF即刻开始产生，培养结束时，产量达到60mg/L。重组hEGF以N-末端融接TrpL蛋白的6个氨基酸残基的融合蛋白形式产生，并以包涵体的形式存在于细胞内。
三、检验方法1．质量检测重组hEGF产品为透明澄清液体；SDS-PAGE测定分子量6045；等电聚焦电泳测定等电点为4.55～5.20；反相HPLC分析肽图与标准品一致；氨基酸序列分析仪测定N-端氨基酸序列与文献一致；HPLC测定纯度＞95％。
2．生物活性测定用MTT A431细胞抑制法测定生物效价为标示量80％～120％。
B、成纤维细胞生长因子(FGF)。
一、bFGF的基因人bFGF基因位于第4号染色体，是单拷贝基因，由3个外显子和2个内含子组成，长度大于38kb。第一个内含子位于第60和61位密码子之间，第2个内含子位于第94和95位密码子之间。bFGF mRNA有两种形式，分别为4.6kb和2.2kb。由mRNA逆转录的cDNA序列分析表明，在bFGF cDNA的可读框架中，有一个常见的AUG起始密码子和UGA终止密码子。这个读框编码的氨基酸序列与从组织中提纯的bFGF氨基酸序列一致。此外，在常见的起始密码子前面三个不同位置上有三个不常见的起始密码子CUG。已证实这些CUG密码子分别启动三种末端延长形式的bFGF(分子量分别为24、23.1和22kD)的合成。
二、bFGF的结构bFGF是单链多肽。由cDNA推断的初级转录物编码155个氨基酸组成的前体分子，分子量约为18kD，其中不含信号肽。从不同组织中提纯的bFGF肽链长短不一。最早从牛脑和垂体分离提纯的bFGF由146个氨基酸组成，而黄体bFGF仅由130个氨基酸组成。少于155个氨基酸的bFGF为氨基末端截短形式。已证实bFGF氨基末端缩短少于25个氨基酸不影响其活性，说明N-端氨基酸不参与生物活性或bFGF与细胞表而受体的结合。
bFGF分子内部有两个潜在的肝素结合区，一个位于氨基端的第18～22位残基，另一个位于羧基端的第107～110位残基，因此对肝素有很高的亲合力。二级结构分析表明，第37～40和第78～81位残基恰好是纤连素(fibronectin)的精-甘-天冬-X序列的颠倒，可能存在于蛋白质的外部，这些残基可以使bFGF附着到细胞表面的识别部位。
bFGF有四个半胱氨酸，形成两个二硫键。bFGF在进化过程中极其保守，如人和牛的bFGF,146个氨基酸中只有两个不同，同源性达98.7％，鸟bFGF与牛bFGF氮基酸组成相同。
bFGF的结构和功能与aFGF相似，但bFGF的活性比aFGF大10倍～100倍，且aFGF的细胞分布比较有限，主要在脑组织、视网膜、肾脏和骨组织中，而bFGF则分布在脑、垂体、视网膜、肾、肾上腺、胎盘、前列腺、胸腺、骨、免疫系统和各种肿瘤中。基本上所有的细胞都有bFGF的特异性、高亲和性受体。因此，bFGF是一种基本调节因子，通过自分泌和旁分泌两种机制起作用。
三、bFGF的理化性质bFGF的等电点为9.6对热不稳定，易被蛋白酶降解；对肝素有很强的亲和力，与肝素结合后，生物活性不变，但对温度和酸的稳定性增强，不易被蛋白酶降解。
四、重组人bFGF生产工艺利用T7启动子表达系统在E.coli中表达了人bFGF，并利用肝素-Sepharose亲和柱层析实现了重组bFGF的一步纯化。
1．表达质粒pJU1005的构建构建bFGF表达载体的基础是质粒pET-3b。这个质粒是pBR322的衍生物，含T7噬菌体的φ10基因启动子、翻译起始部位和前11个密码子以及Tφ-T7RNA聚合酶识别的转录终止信号。这些序列在pBR322的BamHⅠ位点插入，使转录以逆时针方向进行。用EcoRⅠ-EcoRv双酶消化，除去pET-3b中的一个含内源EcoRⅠ、ClaⅠ和HindⅢ切点的185bp片段。在BamHⅠ切点插入一个合成的多聚接头(Polylinker)，其中，靠近T7启动子的是BamHⅠ切点，最远端的是XhoⅡ切点。用同源的tet基因的一个650bp EcoRⅠ-Sall片段(已用亚硫酸氢盐诱变消除了内部的BamHⅠ和HindⅢ切点)置换pET-3b中的BglⅡ-Sall片段，恢复了该质粒的tet基因，使其同时具有氨苄青霉素抗性和四环素抗性。此质粒命名为pJU1003。用一个合成的两端分别为BamHⅠ和NcoⅠ切点的接头，将bFGF cDNA序列与pJU1003中的T7噬菌体基因10直接衔接，得到表达质粒pJU10052．bFGF的表达和纯化用质粒pJU1005转化E.coli BL21(DE3)菌株，筛选出阳性转化菌。将转化菌于30℃在含四环素的培养基中培养至对数后期，加入0.1mmol/L IPTG诱导bFGF表达。2h后收获菌体，快速冰浴冷却。于4℃离心，每克细胞沉淀重悬于4ml缓冲液A(50mmol/L Tris-HCl pH7.5)中，用弗氏细胞压碎器破碎细胞。将细胞裂解液调至0.5mol/L氯化钠浓度，于4℃离心，去除细胞碎片。含重组bFGF的悬液成分用含0.5mol/L氯化钠的缓冲液A，进一步稀释至相应于5ml/g细胞湿重的体积，直接加到预先用同样缓冲液平衡的肝素-Sepharose亲和柱上层析。用二倍体积的平衡缓冲液洗柱，然后，再用含1mol/L氯化钠的缓冲液A洗住，直至流出物的A280nm达到基线值。用含2mol/L氯化钠的缓冲液A从柱上洗脱bFGF，得到高纯度的bFGF。
这个表达系统产生的重组bFGF占菌体总蛋白的10％以上，产量达40mg/L培养物/A260nm单位。
五、重组bFGF的活性测定通过3H-TdR掺入法，用小鼠3T3成纤维细胞测定其丝裂原活性。
C、神经生长因子(NGF)。
NGF最早是由蛇毒腺提取，后来又由小鼠下颌腺分离提纯的。从小鼠下颌腺中提纯的NGF是一种沉降系数为7S的复合物，含α、β和γ三种蛋白质亚基，组成为α2βγ2，分子量130kD。γ亚基是一种精氨酸特异性的酯肽酶，参与β-NGF前体的加工。α亚基与γ亚基有80％以上的同源性，但没有酯肽酶活性。只有β亚基具有NGF活性。
7SNGF的α、β和γ亚基通过弱的非共价键结合，只有在pH5～8时稳定。当pH＞8或pH＜5时，或者简单稀降。7SNGF可解离为α、β和γ亚基。在生理条件下，NGF以7S复合体形式存在。7SNGF各亚基等电点不同，可通过离子交换层析完全分离(见表利用羧甲基纤维素柱层析得到了NGF的活性单位β-NGF，它具有NGF的全部生理效应。沉降系数为2.5，分子量26kD，等电点为9.3，由二条相同的单链非共价连接成二聚体，每条链由118个氨基酸组成。N-末端为Ser.C-末端为Arg，含三个分子内二硫键。
(二)人NGF(hNGF)及其基因由于人体组织中合成的NGF量极低，所以hNGF的研究非常困难。
利用小鼠β-NGF克隆cDNA的665bpHgaⅠ-HincⅡ片段做为探针，从人基因组文库中筛选出3.9kb的hβ-NGF基因DNA序列。这个序列含有两个分别为124bp和738bp的区域，与mNGF的前肽原(prepropeptide)基因高度同源，是hNGF基因的两个外显子，其中738bp的较大外显子含成熟hβ-NGF编码序列。这两个外显子之间有一个6.6kb的间隔序列，在-126位和-125位之间。在-187,-121和-119位有三个ATG三联体，其中-121位的ATG可能是hβ-NGF的前肽原基因起始密码子。-121位的上游，包括124bp的小外显子可能是5＇非翻译序列。β-NGF的信号肽(-121位-104位)和成熟β-NGF在人与小鼠之间高度保守，同源性分别为94.5％和90％。成熟hβ-NGF的N-末端氨基酸为Ser，与mNGF相同，C-末端比mNGF多出两个氨基酸Arg和Ala。因此，hβ-NGF为120个氨基酸，其中的第45位Asn可能是N-糖基化位点。
(三)hNGF的性质hNGF的前肽原含241个氨基酸，信号肽为18个氨基酸，成熟β-NGF为120个氨基酸。分子量13000，有一个N-糖基化位点，六个Cys残基，形成三个链内二硫键。等电点为8.86。在体内以二聚体存在。
(四)重组hNGF生产工艺目前，重组hNGF已在E.coli、酵母和动物细胞中获得表达。不过，根据已公布的试验报道，重组hNGF的表达量一般都比较低，E.coli和酵母表达的NGF活性只相当于小鼠下颌腺mNGF的1/200～1/1000，而用动物细胞表达的NGF与mNGF活性相等。
利用构建的表达质粒pTB1058在CHO细胞中表达了hNGF。
1．表达载体质粒的构建以人工合成的0.38kb hNGF编码序列做为探针，从人白血细胞基因组λEBL3文库中筛选出一个具有15kb插入体的阳性克隆。这个插入体中的一个开放读框的核苷酸序列与报道的编码prepro-NGF(由Met-121至Ala120)的开放读框相同。从这个插入体DNA中分离出一个0.8kb的BclⅠ-ApaⅠ片段，编码信号肽的C-端部分。肽原(propeptide)和成熟NGF。将这个片段与编码信号肽N-端部分的合成DNA连接，得到完整的hNGF基因，插入到质粒pTB399(已除去其中的II-2cDNA)中的鼠白血病毒(MuLV)长末端重复序列(LTR)的下游，得到质粒pTB1054。从pTB1054中分离出含MuLV LTR和hNGF基因的2kb ClaⅠ片段，插入含二氢叶酸还原酶(DHFR)cDNA的质粒pTB348的(ClaⅠ切点，得到表达质粒pTB1058
(五)重组hNGF的检验通过SDS-PAGE电泳测定的重组hNGF分子量为13000；等电点为9～10；N-端氨基酸序列与从hNGF基因核苷酸序列推断的相同；根据肼解作用确定的羧基末端氨基酸是Ala，与Ullrich等推断的成熟hNGF的羧基端比mNGF多两个氨基酸即Arg119和Ala120的结论相符；依次用胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶(thermolysin)消化得到三个片段，每个片段的氨基酸序列分析确定三个二硫键位于Cys15-Cys80,Cys58-Cys108和Cys68-Cys110，与mNGF相同。
根据刺激PC12细胞轴突生长和支持鸡胚背根神经节感觉神经元存活测定的重组hNGF的特异生物学活性与2.5SmNGF相匹配。D、脑源神经营养因子(BDNF)。
(一)结构和性质BDNF是由119个氨基酸组成的蛋白质，分子量为13500；分子内有三个二硫键和一个糖基化位点；等电点为9.99。在体内以二聚体存在，主要分布于中枢神经系统，对多种神经元如运动神经元、神经脊及基板起源的感觉神经元、黑质的多巴胺神经元、基底前脑的胆碱能神经元以及海马、皮层、视神经节等处的神经元的生长、分化以及损伤后修复有促进作用。最近发现，BDNF还具有促进学习和记忆的功能。
(二)重组BDNF的生产工艺BDNF(还有NT3,NT4/5)的基因结构与NGF相似，成熟蛋白的编码序列位于单一外显子内，没有内含子间隔。因此，可以利用PCR方法直接以人基因组DNA为模板扩增出来。何晓龙等(1995)利用这种方法制备了BDNF的编码基因，并在E.coli中获得较高表达。
首先设计两种PCR引物引物I含成熟BDNF的N-端部分编码序列和NdeⅠ酶切位点，引物2含成熟BDNF C-端部分编码序列的互补序列，并在终止密码子后加BamHⅠ酶切位点。将PCR扩增出的BDNF基因插入质粒pET-3a和pET-16a的NdeⅠ和BamHⅠ位点之间，转化E.coli JM109株，经筛选鉴定，分别得到含BDNF基因的重组质粒pET-3B和pET-16B。这两个质粒都由T7启动子控制BDNF的表达。
将重组质粒pET-3B和pET-16B重新转化E.coli BL21(DE3)株，用IPTG诱导表达(37℃,3h)。菌体裂解液的SDS-PAGE电泳表明，pET-3B工程菌表达了分子量约15kD的蛋白质，为非融合的BDNF，占菌体总蛋白的15.4％。N-端前15个氨基酸序列分析结果除起始端多了一个Met以外，与文献报道完全一致，但SDS-PAGE显示的分子量与理论值有一定差异，原因不清。pET-16B工程菌表达了分子量为16.5kD的蛋白质，N-端融合了21肽的BDNF，占菌体总蛋白的47.2％。其中的21肽含10个连续的组氨酸和凝血因子Xa特异性识别位点。因此，可以用特殊的组氨酸结合树酯(Novage公司产品)纯化，然后用凝血因子Xa切除N-端融合的21肽，得到成熟BDNF。
E、睫状神经营养因子(CNTF)。
(一)结构与性质CNTF由200个氨基酸组成，分子量为24kD,N-端不带信号肽，不是典型的分泌因子。分子内只在第17位有一个Cys残基，不含二硫键，也不含糖基化位点。等电点为5.78，是酸性蛋白质。CNTF对感觉神经元、运动神经元、海马胆碱能神经元、黑质多巴胺神经元等均有促进存活和损伤保护作用。
(二)生产工艺用EooRⅠ从人CNTF cDNA克隆载体pKSH CNTF质粒中切出CNTF基因片段，定向插入到含PL启动子的载体pBPL的EcoRⅠ切点，转化E.coliJM83，经筛选鉴定得到表达载本pBLHc，转化E.coliHB101得到CNTF表达菌株。该菌株经培养和热诱导，表达了分子量为24kD的蛋白质，占菌体总蛋白的25％。
收集菌体，超声裂解，离心取上清。上清用硫酸铵沉淀，收集30％～60％饱和度的沉淀组分，用TE缓冲液(50mmol/L Tris-HCl、5mmol/LEDTA,pH7.5)溶解后，对TE透析。然后上DEAE-A50离子交换-交联葡聚糖凝胶柱层析。用TE和TE加0.5mol/L氯化钠(pH7.5)进行线性梯度洗脱，收集CNTF富集组分，对TE透析，再上Sephacryl S-200柱，用TE洗脱，得纯化CNTF，纯度95％以上，得率25.4％。
用鸡胚背根神经节培养法测定重组CNTF的活性为1.3TU/ng。此处ITU(活性单位)表示在1ml培养液中能使神经细胞达到最大存活数一半时所需样品的质量数。
原料中的多肽类神经营养因子需经CNBr处理后的蛋白酶消化，得到活性小肽链后，制成注射用冻干粉剂或注射剂。
口服制剂无需经蛋白酶消化，而是将原料制成冷干粉后，直接制成胶囊剂、片剂、滴丸剂或其它口服制剂。
权利要求
1.一种治疗老年性痴呆症、帕金森症、心脑血管病的药物，其特征在于它是以神经生长因子(nerve growth factor、NGF)、脑源神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)、、神经营养因子-4(NT-4)、神经营养因子-5(NT-5)、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic fa-ctor,CNTF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、神经节苷脂(ganglioside)、乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)、组胺(his-tamine,HA)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related pep-tide,CGRP)、神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)、环核苷酸(cAMP)、心钠素(atrial natriuretic peptide,ANP)、脑钠素(brain natriuretic peptide,BNP)、C型利钠肽(C-typeNatriuretic peptide,CNP)、前列环素(PGI2)、内皮细胞舒张因子(EDRF)为原料，上述原料可单独或混合制成治疗老年性痴呆症、帕金森症、脑血管病、冠心病、高血压、动脉粥样硬化的药剂。
2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于所说的药剂是任何一种药剂学上所说的剂型。
3.根据权利要求1所述的药物，用于治疗老年性痴呆症、帕金森症、脑血管病、冠心病、高血压、动脉粥样硬化。
全文摘要
本发明涉及一种以神经生长因子(NGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养因子－3、4、5(NT－3、NT－4、NT－5)、睫状神经营养因子(CNTF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、神经节苷脂(ganlioside)、乙酰胆碱(Ach)、组胺(HA)、降钙素基因相关肽(CGRP)、神经肽Y(NPY),环核苷酸(cAMP)为原料制成的治疗老年性痴呆症、帕金森症、脑血管病、冠心病、高血压、动脉粥样硬化的药剂,剂型包括注射用冻干粉剂、注射剂和口服用胶囊剂、片剂、滴丸剂。该药物经控制性酶解,得到的小肽链能通过血脑屏障,作用于大脑。上述病症严重危害人类的生命健康,它的市场需求是巨大的。
文档编号A61K38/17GK1228995SQ9911343
公开日1999年9月22日 申请日期1999年1月26日 优先权日1999年1月26日
发明者卢杲 申请人:卢杲