专利名称：突变型单纯疱疹病毒及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及突变型单纯疱疹病毒，它们具有使其表现非致病性的失活突变。本发明也涉及这些突变型单纯疱疹病毒在基因疗法和测定析基因功能的方法上的用途。
背景技术：
疱疹单纯病毒(HSV)已经由于其神经营养的生活方式和其细胞终生维持在神经元中的能力而常常被建议作为一种合适的神经系统载体。然而，野生型的HSV是高度病原性的且与大多数病毒载体一样必需在某些方面被失去能力。HPV的病原性作用起因于病毒的裂解性感染，因此HSV作为一种载体的用途需要携带突变型株系的发展，这些突变可以中断裂解周期，同时允许无症状的潜在性感染的建立。
HSV载体以前已经产生并在体内通过删除必要的立即早期(IE)基因ICP4进行测试(Dobson等，1990和Chiocca等，1990)，为了在培养基中生长，ICP4必需是被互补的。ICP4在裂解性感染的病毒早期和晚期基因的转录活化中是必需的。因此，缺少该基因的病毒可以迅速感染细胞但不能裂解性生长。另一种必需的基因是ICP27，其基因产物具高度细胞毒性，可能是由于其在阻止前-mRNA剪接(有助于从基本上未剪接的疱疹RNA转录)上的二级作用。已经产生删除ICP27(单独删除ICP27(如Reef Hardy和Sandri-Goldin，1994及Rice和Knipe，1990)、或者与ICP4结合(如US-A-5，658，724))的HSV株系。
已经在非必需的基因上进行了突变，这些基因如IE基因ICP0、IE基因ICP6、酪氨酸激酶(TK)、US5或VMW65，所有这些基因在体内的完全致病性上是必需的，但对于在培养基中的生长不是必要的(由Coffin和Latchman回顾，1996)。这些类型的突变提供了附加的优点，即该删除对于在培养基中生长的不必被互补，这些突变以前已经显示偶尔会在生长时通过病毒和细胞系互补序列之间的同源重组导致从非致病型表型退回到野生型表型。然而，在这些中的每种情况下，由于高效价的接种将克服体内对复制的阻断，因而非必需的基因的突变没有完全阻止病毒的复制。
ICP34.5，所谓的神经毒力因子，是体内神经毒力绝对需要的，但对于在培养基中的生长是非必需的(Chou等，1990)。在ICP34.5上的突变提供了一个敏感的机制，HSV可以通过该机制被失去能力。ICP34.5被认为可以在神经元中阻止对生产性感染的的通常宿主反应，该反应导致(在ICP34.5缺乏的情况下)细胞死亡以及因此对初期被感染细胞感染的局限性。ICP34.5被认为可以越过的这一应答并允许完全的裂解性复制的发生。因此在ICP34.5缺乏的情况下，无论何种原因，如果失去能力的病毒曾被恢复生产性感染，则ICP34.5的突变将确保保护性宿主应答将病毒复制局限在少数细胞中。
然而，携带单个缺陷的病毒不太可能会被认为对最终的人体使用是绝对安全的。必需的IE基因提供了对复制的完全阻断(以及因此其在培养基中必需被互补)，通过失活该必需的IE基因和失活一种非必需的基因可以达到附加的安全和较高效价接种的可能性。
发明概述目前我们已经发现至少在ICP4和ICP34.5中携带失活突变(选择性地在VMW65和(或)vhs上携带失活突变)的单纯疱疹病毒，相对于仅携带单个ICP34.5突变、ICP34.5及VMW65突变、或ICP34.5及VMW65和vhs突变型病毒株系呈现出毒性水平降低。它们比仅删除ICP4的病毒较安全。然而这些高度突变型株系仍然可以有效地在培养基中生长，其中使用一种ICP4互补的细胞系，允许了病毒原种的制备。此外，本发明中的这些HSV株系已经被显示是将异源基因传递到哺乳动物细胞中的合适的载体。
因此本发明提供了一种具有功能ICP27基因的单纯疱疹病毒(HSV)，其缺少至少一个功能ICP4基因和一个功能ICP34.5基因。所述病毒优选的是进一步缺少一个或多个所述ICP34.5基因之外的功能非必需基因。例如，该病毒可以进一步缺少一个或多个选自VMW65、vhs、ICP0、ICP6和TK的功能性非必需基因。这些非必需基因中的两种甚至三种可以因此被失活。
特别地，为了降低在体内的毒性，我们已经在本发明的HSV的非必需基因VMW65上插入了一种失活突变以降低立即早期(IE)基因的表达，以及因此这些基因的表达水平也受这些蛋白的调控。此外，我们也已经生产出在编码病毒体宿主关闭蛋白(vhs)基因上有缺失的单纯疱疹病毒。Vhs是一种在病毒体中携带的蛋白，是使mRNA不稳定和因此降低了有助于从更迅速生产的病毒RNA(其伴随着一种野生型病毒的感染)的翻译的宿主蛋白合成的原因。
因此，在本发明的一个优选的实施方案中，本发明中的HSV也缺乏一个功能vhs基因和/或一个功能VMW65基因(由于在所述VMW65基因上的一处突变，该突变废除了其转录活化的活性)。所以本发明中一种尤其优选的病毒缺乏一个功能ICP4基因、一个功能ICP34.5基因、一个功能vhs基因和一个功能VMW65基因由于在所述VMW65基因上的一处突变，该基因废除了其转录活化的活性。
本发明中的单纯疱疹病毒可以被用于例如在治疗神经系统的疾病或损伤(包括帕金森病、脊柱损伤或中风、或眼睛、心脏或骨骼肌的疾病、或恶性肿瘤)的方法上传递治疗基因。本发明也涉及到在哺乳动物细胞中研究基因功能的方法，例如在鉴定互补细胞机能障碍的基因上，或者研究突变型基因在野生型或突变型哺乳动物细胞中表达的效果。本发明中的方法尤其可以用于对涉及疾病的基因的功能的研究。
本发明进一步提供了本发明中的一种携带有一个异源基因的HSV。术语异源基因用来包括任何在HSV基因组中没有发现的基因。异源基因可以是一种野生型基因的任何等位基因的变体，或者它可以是一种突变型基因。异源基因优选的是与一段控制序列操作性连接以允许所述异源基因在哺乳动物细胞中的表达，优选的细胞是中枢或外周神经系统的细胞、或眼睛、心脏或骨骼肌的细胞，更优选的细胞是中枢或外周神经系统的细胞。本发明中的HSV因此可以被用作将一种异源基因传递到哺乳动物细胞中，该基因将在该处表达。这种载体在许多应用中都是有用的，例如，在基因治疗、或体外分析方法或HSV基因调控的研究中。
异源基因优选编码一种具有治疗作用的多肽，包括具细胞毒性或能够将药物前体的前体物转换成一种具细胞毒性化合物的多肽类。
本发明进一步提供了单纯本发明中的疱疹病毒，其带有一种用于人类和动物的治疗的异源基因。例如，这些病毒可以被用于治疗神经系统的疾病或损伤，包括帕金森病、脊柱损伤或中风、或眼睛、心脏或骨骼肌的疾病、或恶性肿瘤。
本发明中的HSV也可以被用于研究基因在哺乳动物的细胞中功能的方法中，例如在鉴定与细胞功能紊乱互补的基因中，或者研究突变型基因在野生型或突变型哺乳动物细胞中表达的效果。本发明中的方法尤其可以用于涉及疾病的基因的功能研究。
本发明还提供了一种生产本发明中的一种单纯疱疹病毒的方法，所述方法包括修饰一种单纯疱疹病毒的ICP34.5和ICP4基因(以及任意VMW65和(或)vhs基因)，以使所述基因在功能上失活，条件是ICP27基因保持完整和(或)具有功能。
发明详述A．病毒株系本发明中的单纯疱疹病毒可以来自，例如，HSV1或HSV2株系、或它们的衍生物，优选的是HSV1。衍生物包括含有来自HSV1和HSV2株系的DNA的中间型重组体。衍生物优选地具有至少与HSV1或HSV2基因组有70％同源的序列，较优选的是至少有80％，更为优选的是至少有90或95％。可以被使用以得到本发明中的病毒的其它的衍生物包括已经在ICP4、ICP34.5、VMW65或vhs中的任一上具有突变型的株系，例如株系1716(MacLean等，1991)、株系R3616和R4009(Chou和Roizman，1992)和R930(Chou等，1994)，所有这些在ICP34.5上具有突变，株系d120上ICP4被删除(DeLuca等，1985)。这些株系的使用将减少生产本发明中突变型HSV株系所需的步骤数目。
用于描述各种HSV基因的术语如Coffin和Latchman在1996中所见。
B．互补细胞系本发明中的病毒在表达ICP4的细胞系中增殖，例如E5细胞(DeLuca等，1985)或B4细胞(见实施例1)，优选的是B4细胞。
表达ICP4的细胞系可以通过共转染哺乳动物细胞来生产，例如非洲绿猴肾细胞株系或BHK细胞，其中用一种载体，优选的是一种质粒载体、它含有一种可以在所述细胞中表达的功能HSV ICP4基因；以及一种载体，优选的是质粒载体、它可编码一种选择标记，例如新霉素抗性。然后筛选带有选择标记的克隆以进一步确定哪个克隆也表达功能ICP4，例如基于它们支持ICP4-HSV株系生长的能力、使用本领域技术人员所知的方法进行。
不允许一种ICP4-突变型HSV株系退回到具有功能ICP4株系的细胞系如以上所描述的进行生产，确保含有一个功能ICP4基因的载体不含有与保留在ICP4-突变型病毒中的序列重叠(即与之同源)的序列。
C．突变方法可以通过几种本领域中众所周知的技术致使ICP4、ICP34.5、vhs和其它HSV基因功能性失活。例如，可以通过删除、替代或插入使其功能性失活，优选的是通过删除。删除可以除去基因的部分或整个基因。例如，可以仅删除一个核苷酸，导致框架转移。然而，优选的是删除较大部分，例如占总编码和非编码序列(或可选地，以绝对的术语，至少10个核苷酸，更优选的是至少100个核苷酸，最优选的是至少1000个核苷酸)的至少25％、更优选的是至少50％。尤其优选的是除去整个基因和一些侧翼序列。插入的序列可以包括以下所描述的异源基因。特别地，优选的是将异源基因插入到ICP4上。至于VMW65基因，不删除其整个基因，因为它编码一种必需的结构蛋白，但进行一个小的失活插入，其废除了VMW65活化转录的IE基因的能力(如在Ace等，1989，Smiley和Duncan，1997中，或其它导致类似结果的突变)。
在单纯疱疹病毒中通过本领域技术人员熟知的同源重组的方法制造突变，或者可选地，通过直接连接到线性HSV基因组DNA上，或者通过本领域技术人员公知或开发的任何其它的方法。例如，HSV基因组DNA与一种载体(优选的是一种质粒载体，包括同源的HSV序列在其侧面的突变序列)一起转染。突变的序列可以包括删除、插入或替代，所有这些可以通过常规的技术构建。插入可以包括选择性标记基因，例如lacZ，以通过如β-半乳糖苷酶活性筛选重组体病毒。
D．异源基因和启动子本发明中突变的型HSV株系可以被修饰以携带一种异源基因，也就是存在于HSV基因组中基因之外的一种基因。术语“异源基因”包括除了存在于HSV基因组中的基因以外的任何基因。异源基因可以是某一野生型基因的等位基因的变体，或者其可以是一个突变型基因。术语“基因”用来涵盖至少可以被转录的核苷酸序列。因此编码mRNA、tRNA和rRNA的序列包括在该定义内。核酸可以是，例如，核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或它们的相似体。关于启动子，这些序列可以为有义*或反义定向。反义构建物可以依据熟知的技术被用于抑制某一基因在一种细胞中的表达。编码mRNA的序列将选择性地包括一些或全部的5’和(或)3’端天然被转录但不被翻译的侧翼序列或者与被翻译的编码序列联合。其可以选择性地进一步包括正常地与被转录的序列连接的联合转录控制序列，例如转录终止信号、多聚腺苷位点和下游增强子元件。
异源基因可以通过HSV株系与例如带有异源基因(侧面伴随有HSV序列)的质粒载体的同源重组而被插入到HSV基因组中。可以使用本领域众所周知的克隆技术将异源基因引入到一种合适的、含有HSV序列的质粒载体上。异源基因可以在任何位置插入到HSV基因组中，只要该病毒仍然可以增殖。优选的是该异源基因被插入到必需的基因ICP4上。
异源基因的转录序列优选地是与允许该异源基因在哺乳动物细胞(优选的是中枢和外周神经系统的细胞)中表达的控制序列操作性连接。术语“操作性连接”是指毗邻地定位，其中所描述的组分之间的关系允许它们以其预定的方式发挥功能。“操作性地连接”有一段编码序列的一段控制序列以这样一种方式连接，即该编码序列的表达是在控制序列兼容的条件下达到的。
控制序列包含一个允许异源基因表达的启动子和一段终止转录的信号。该启动子选自在哺乳动物、尤其是在人类的细胞中起作用的启动子。启动子可以源自于真核基因的启动子序列。例如，其可以是源自于该异源基因将在其中表达的细胞基因组的启动子，优选的是哺乳动物中枢或外周神经系统的细胞。至于真核启动子，它们可以是以普遍存在的方式起作用的启动子(如β-肌动蛋白、微管蛋白的启动子)，或者，可选地，以组织特异性方式作用的启动子(如丙酮酸激酶基因的启动子)。它们也可以是响应特定刺激的启动子，例如结合类固醇激素受体的启动子。也可以使用病毒启动子，例如莫洛尼鼠类白血病毒长末端重复序列(MMLV LRT)启动子或HSV基因的启动子。
HSV LAT启动子和包含LAT启动子区域上的元件的启动子可以是尤其优选的，因为在潜伏期中存在达到异源基因长期表达的可能性。特别地，组成必需的LAT P2区域的一个表达弹夹，其本身不充当启动子，与一个启动子和一个异源基因以该次序连接，它是尤其优选的(WO98/30707)。
术语“长期表达”是用来表示一个异源基因在一种用本发明中的某一单纯疱疹病毒感染的细胞中的表达，表达甚至是在该单纯疱疹病毒进入潜伏期之后。优选地，这至少持续两周，较优选地在感染之后的至少一或两个月，更为优选的是持续细胞的生存期。
表达弹夹可以进一步包括第二个启动子和第二个异源基因，其在与第一个启动子和第一个异源基因相反的定向上与所述HSV LAT P2区域以该次序操作性连接，其中所述第二个启动子和第二个异源基因与第一个启动子和第一个异源基因相同或不同。因此以相反的定向与允许异源基因对长期表达的单个LAT P2区域毗邻的一对启动子/异源基因构建物，其可以相同或不同，受相同或不同的启动子驱动。此外，在合适的生理条件下，第一个异源基因的产物可以调节第二个异源基因的表达(或反之亦然)。
表达弹夹可以使用本领域技术人员已知的克隆技术的途径进行构建(见，例如，Sambrook等，1989，《分子克隆-实验室手册》(Molecular Cloning-a laboratory manual)；Cold Spring HarborPress)。此外，含有这种表达弹夹的特定HSV株系的构建在实施例中被描述。
此处LAT P2区域在HSV株系17+、该区域的片段或衍生物(包括HSV2和其它HSV1株系的同源区域)中被定义为HSV1核苷酸118866-120219(GenBank HELCG来自PstⅠ-BstⅪ位点)，其能够为与之连接的启动子提供长期表达。
也对启动子有利的是可诱导性，以至异源基因的表达水平在细胞的生存期中可以被调控。可诱导是表示使用启动子获得的表达水平可以被调控。例如，在一个优选的实施方案中，其中将一种以上的异源基因插入到HSV基因组中，在HSV基因组中相同的位点上或是在不同的位点上，一个插入的启动子将包含一个响应以前所报导的tet阻抑物/VP16转录激活因子融合蛋白(Gossen和Buiard，1992，Gossen等，1995)并驱动异源基因表达(其表达受调控)的启动子。第二个插入的启动子将包括一个驱动tet阻抑物/VP16融合蛋白表达的强启动子(如CMV IE启动子)。因此，在该实施例中，第一个异源基因的表达将依赖于四环素的存在或不存在。一种以上的启动子/异源基因(其表达水平受调控)弹夹将在本发明的实施方案中被插入到HSV基因组中，以允许多个基因的表达水平将受调控，如受四环素或其它来自使用中的可控制的启动子的可以调节表达水平的物质控制。
另外，任何这些启动子可以通过加入另外的调控序列进行修饰，例如增强子序列(包括LAT区域的元件)。也可以使用嵌合启动子，其包括来自两个或更多以上所描述的不同启动子的序列元件，例如一种MMLV LTR/LAT融合启动子(Lokensgard等，1994)或包含LAT区域元件的启动子(见上文)。
该异源基因可以编码例如涉及细胞分裂调控的蛋白，如促进有丝分裂的生长因子包括神经营养生长因子(如脑衍生的神经营养因子、神经胶质细胞衍生的神经营养因子、NGF、NT3、NT4和NT5、GAP43)、细胞因子(如α-、β-或γ-干扰素，白细胞介素包括ⅠL-1、ⅠL-2，肿瘤坏死因子，或胰岛素样生长因子Ⅰ或Ⅱ)、蛋白激酶(如MAP激酶)、蛋白质磷酸酶和以上任何因子的细胞受体。该异源基因也可以编码涉及细胞代谢途径的酶，如涉及氨基酸生物合成或降解(如酪氨酸羟化酶)、嘌呤或嘧啶生物合成或降解、以及神经递质(如多巴胺)的生物合成或降解的酶，或者是涉及这些途径的调控的蛋白，例如蛋白激酶和磷酸酶。该异源基因也可以编码涉及它们的调控的转录因子或蛋白，例如Brn3族的成员(包括Brn3a、Brn3b和Brn3c)或Rb族的小型蛋白(如Rb或p107)、膜蛋白(如视紫红质)、结构蛋白(如肌营养不良蛋白)或热激蛋白(如hsp27、hsp65、hsp70、和hsp90)。
优选地，该异源基因编码一种具有治疗作用的多肽，或者其功能或功能的缺乏在疾病的过程中可能是重要的。例如，以上所描述的蛋白中，酪氨酸羟化酶可以被用于治疗帕金森病，视紫红质可以被用于治疗眼部病症，肌营养不良蛋白可以被用于治疗肌营养不良，以及热激蛋白可以被用于治疗与局部缺血应激反应相关的心脏或脑病症。具有治疗作用的多肽也可以包括细胞毒素多肽，如蓖麻毒蛋白，或可以将前导的药物前体转化为一种具细胞毒性化合物的酶(以用于，例如，病毒指导的酶药物前体治疗或基因指导的酶药物前体治疗的方法中)。在后一情况下，希望的是确保该酶具有一段合适的指导其到达细胞表面的信号序列，优选的是允许酶暴露在细胞表面外部同时保持锚定在细胞膜上的信号序列。合适的酶包括细菌硝基还原酶(如WO93/08288中所公开的大肠杆菌硝基还原酶)或羧肽酶，尤其是如WO88/07378中所公开的羧肽酶CPG2。其它酶可以参照EP-A-415731中找到。合适的药物前体包括氮芥药物前体和其它如WO88/07378、WO089/10140、WO090/02729和WO93/08288(其作为参照结合在本文中)中所描述的化合物。
异源基因也可以编码作为疫苗使用的抗原多肽。优选的是这些抗原多肽来自于致病生物体，如细菌或病毒，或来自肿瘤。
异源基因也可以包括标记基因(例如编码β-半乳糖苷酶或绿色荧光蛋白)或其产物调节其它基因表达的基因(例如，转录调节因子包括以上所描述的tet阻抑物/VP16转录激活因子融合蛋白)。
基因治疗和其它治疗上的应用有充分理由可以需要施用多个基因。多个基因的表达可能会有利于治疗许多种疾病-如使用多个神经营养因子。HSV是唯一适当的，因为其不具有其它病毒载体系统的有限包装能力。因此多个异源基因可以容纳在其基因组中。举例来说，有至少两种途径可以达到这一点。例如，一种以上的异源基因和相联的控制序列可以被引入到一个特定的HSV株系中。也有可能使用以相反定向面对的成对的启动子(相同或不同的启动子)，其远离位于中央的LAT P2元件，这些启动子每种驱动以上所描述的一个异源基因(相同或不同的异源基因)的表达。可选择地，异源基因可以被插入到HSV基因组中的多个位点上。
E．给药本发明中突变型单纯疱疹病毒因此可以被用于将治疗基因传递到人类或动物中以应治疗的需要。使用本发明中突变型单纯疱疹病毒传递治疗基因可以治疗例如帕金森病、神经系统的病症、脊柱损伤、中风或恶性肿瘤(如神经胶质瘤)。
一种被施用的基因治疗的方法包括将治疗基因插入到本发明中突变型单纯疱疹病毒上，如以上所描述的，然后将所得到的重组体病毒与一种药理上可接受的载体或稀释剂混合，以得到一种药物组合物。合适的载体和稀释剂包括等渗的盐溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。该组合物可以配制适于胃肠外、肌肉内、静脉内、皮下、眼内或经皮给药。
该药物组合物以这样一种方式给药，即含有用于基因治疗的治疗基因的突变病毒可以在适当的位置结合到细胞内。例如，当基因治疗的目标是中枢或外周神经系统时，该组合物可以在突触末梢所在的位置施用。该药物组合物典型地是通过立体定位接种给药到脑。当该药物组合物被给药到眼部时，视网膜下注射是典型使用的技术。
所施用病毒剂量的变化范围是从104到1010pfu(噬斑形成单位)，优选的是从105到108pfu，更优选的是约从106到107pfu。当被注射时，一般给予的是在一种药理上可接受的合适的载体或稀释剂中1到10个病毒。
所描述的给药途径和剂量仅作为一个指导，因为一个熟练的医师将可以容易地确定对于任何特定的病人和疾病最适宜的给药途径和剂量。
F．分析方法本发明中突变型单纯疱疹病毒也可以用于科学研究的方法上。因此，本发明的另一个方面涉及到在哺乳动物细胞中分析基因功能的方法，在体外或在体内。某一异源基因的功能的确定可以通过的方法包括下列步骤(a)将上述异源基因引入到本发明的某一突变型单纯疱疹病毒中；(b)将所得到的病毒引入到某一哺乳动物细胞系中；以及(c)确定所述异源基因在所述哺乳动物细胞系中的表达效果。
例如，该细胞系可能在细胞分裂中存在温度敏感的缺陷。当含有依据本发明的异源基因的某一HSV株系被引入到该缺陷的细胞系和在限定性温度下生长的细胞系中时，本领域技术人员将能够很容易地确定该异源基因是否可以与细胞分裂中的缺陷互补。类似地，其它已知的技术可以被用于确定该异源基因的表达是否可以纠正哺乳动物细胞系中明显的突变表型。
这一过程也可以被用于实现某一异源基因的体系诱变，以确定该基因编码的蛋白的哪一部分涉及突变表型的恢复。
该方法也可以被用于动物中，例如小鼠，携带所谓“基因剔除”。可以使用本发明的一个突变型HSV株系将一种野生型的异源基因引入到动物中，使用各种本领域已知的行为学的、组织化学的或生物化学的方法来确定对动物影响。可选择地，某一突变型异源基因可以被引入到野生型的或“基因剔除型”的动物体内，以确定是否诱导了与疾病相关的病状。其中一个例子是使用编码朊病毒的基因诱导啮齿类中枢神经系统中的Creutzfeld-Jacob和其它朊病毒型的疾病。其它疾病模型可以包括阿尔茨海默病、运动神经元疾病或帕金森病的模型。
既然有可能由于HSV基因组的大容量而可以将至少两种不同的异源基因引入到一个细胞中，也将有可能研究两个或更多个基因产物之间的相互作用。
因此，本发明中的方法尤其可以用于涉及疾病的基因的功能研究。
本发明将从参考以下实施例进行描述，这些实施例仅用做说明性的而不具限制性。
实施例实施例1-突变病毒的产生病毒具有致使VMW65转录激活活性功能性失活的突变的ICP34.5删除的突变体，其产生是通过含有ICP34.5的两个拷贝均被删除的1716株系(MacLean等，1991)与含有一个功能性失活的VMW65基因的1814株系(Ace等，1989)的共同培养(在BHK细胞中，3mM HMBA)。通过本领域技术人员已知的方法(限制性消化已纯化的基因组DNA及DNA印迹)分析所得到的噬菌斑的基因组结构，含有1814及1716中的突变型病毒进一步被噬斑纯化五次，得到病毒株系1764。含有1814中的突变或其它影响VMW65转激活活性的突变(如在Smiley和Duncan，1997中)的病毒生长的增强可以在病毒生长时通过使用含有六亚甲基二乙酰胺的培养基(McFarlene等，1992)而达到。
Vhs/ICP34.5/VMW65删除的突变体的生产是通过质粒pR15和HSV株系1764 DNA的同源重组以产生病毒1764/pR15，其ICP34.5、VMW65和vhs被删除，具有一个受插入到vhs的编码区域的莫洛尼鼠类白血病毒的长末端重复序列(MMLV LTR)的启动子驱动的lacZ基因。质粒pR15的构建是通过将一段MMLVLTR/lacZ/pA弹夹插入到vhs基因中独特的Nrul位点上。因此来自HSV1株系17+基因组的限制片段KpnⅠ-i克隆到质粒pAT153的PstⅠ位点上(Northumbria Biologicals Ltd)。
ICP4的两个拷贝均从株系1716和株系1764/pR15中被除去。这是通过纯化的株系1716或株系1762/pR15的基因组DNA与质粒pΔ4/GFP的同源重组达到的。pΔ4/GFP的构建使用了ICP4侧翼序列(nts123，459-126，774[Sau3aⅠ-Sau3aⅠ]和nts131，730-134-792[SphⅠ-KpnⅠ]，通过来自pSP72[Promega]的XbaⅠ和SalⅠ位点分离，构建物在该处制造)。一段含有ICP34.5的编码区域的大约0.8kb的NotⅠ片段(nts124，945-125，723)也被除去，以阻止在与株系1716或株系1764/pR15同源重组的过程中对ICP34.5删除的修复。然后将一段CMV/GFP/pA弹夹插入到所得到的pΔ4/GFP的独特的XbaⅠ位点上。首先从pEGFPN1(Clontech)中用AgeⅠ和NotⅠ切除CMV基因，然后将其插入到pcDNA3(Invitrogen)的EcoRⅠ和NotⅠ位点之间以得到pcDNA3GFP。然后可以将CMV/GFP/pA弹夹从pcDNA3GFP中切除以通过NruⅠ和BbsⅠ插入到ICP4侧翼区域中。接着通过如以前的同源重组将pΔ4/GFP引入到株系1716和株系1764/pR15中，GFP表达斑通过荧光显微镜检术和对B4细胞进行噬斑纯化(以下所描述)鉴定，得到病毒株系1716/Δ4和病毒株系1764/pR15Δ4。噬斑纯化的病毒不能对不表达ICP4的BHK细胞形成生产性感染。
病毒株系17+/Δ4的制备如以上，除了使用株系17+基因组DNA和一种含有ICP4侧翼区域的质粒(ICP34.5基因没有通过除去NotⅠ片段从其中被删除)。
核苷数目参照HSV1株系17+序列(Genbank no.HEICG)。使用互补细胞系的突变型HSV株系的生长允许ICP4删除的病毒生长的一种互补细胞系(B4)的产生是通过质粒pICP4 DNA和编码新霉素抗性质粒pMamNeo(Invitrogen)共转染到BHK细胞中和选择新霉素抗性克隆达到的。质粒pICP4含有来自HSV1基因组的DdeⅠ-SphⅠ片段[nts126，764-131，730]，其包括从pSP72(Promega)的EcoRV和SphⅠ位点之间克隆出来的ICP4的编码区域和启动子。
选择高度允许HSV1 ICP4删除型突变体(B4)生长的克隆以适应病毒生长。
实施例2-使用本发明中的HSV1株系在体外感染非神经元细胞。
使用类似于Samaniego等，1998的方法，在非洲绿猴肾细胞株系细胞中以高感染复数(MOI)测试本发明中的HSV株系在细胞培养物中的存活率。病毒基因组的存活率，基因表达可以从中被再激活，提供了病毒对细胞的细胞毒性程度的指示。此处非洲绿猴肾细胞株系细胞在24孔平板上以每个株系(1764/pR15Δ4、1716/Δ4和17+/Δ4)的MOI值为20被感染。然后在34℃/5％ CO2下温育细胞以进行剩下的实验。随时间观察GFP的荧光，在不同的时间(2天、1周、2周和1个月)以HSV株系zΔMN+(其包含一个插入到ICP27基因中的lacZ；Howard等，1998)的MOI值为20超感染细胞培养物。
这些实验显示在使用每种病毒的2天之后，在每种培养物中＞95％的细胞内均可观察到强荧光，虽然在被1716/Δ4和17+/Δ4感染的培养物中细胞毒性的信号很明显(可以观察到一些正常细胞形态的丢失)。用1764/pR15Δ4感染的细胞显示出与未感染的对照细胞完全相同的细胞形态，这显示该病毒的毒性降低，虽然可以观察到细胞分裂的速度短暂地降低。在感染之后的1周以及随后达到一个月的时间点时，非超感染的细胞在每种情况下显示出GFP荧光的减小。然而，在某种程度上的所有情况下，当在一周时这种荧光可以被病毒zΔMN+的转染再激活，在2周和1个月的时间点时，GFP荧光仅可以在最初被1764/pR15Δ4感染的细胞内被明显地再激活，又一次证明了该病毒的毒性降低。
实施例3-在体外使用本发明中的HSV1株系感染初级神经元细胞在体外使用肠神经元的原代培养物(来自7天龄的Sprague-Dawley大鼠的肠-Saffrey等，1991)测试本发明中的HSV株系的毒性。与1716、1764、17+/Δ4或1764/pR15相比，在96孔的微量滴定平板上用2x106pfu/孔的1764/pR15Δ4处理培养物3天之后，这些培养物显示出成活率(如锥虫蓝染色评定)和神经元形态的维持提高很大。因此用1764/pR15Δ4处理3天之后，80％的细胞维持神经元突起，相比之下1764/pR15大约为20％，17+/Δ4为35％。
使用1764/pR15Δ4、17+/Δ4或1764/pR15，大于90％的存活细胞显示出标记基因活性(lacZ和(或)GFP依赖于使用的病毒)，从而在体外使用病毒载体显示出有效的基因转染。相比于其它所使用的病毒，当该病毒在体内作为载体使用时，尤其是在需要长期基因表达的位置上，1764/pR15Δ4大大降低的毒性可能是有利的。
与ICP4一起除去ICP34.5提供了一种与单独删除ICP4相比其安全特性大大提高的病毒。这是因为ICP34.6基因对于病毒在培养基中的生长是不需要被互补的，因此该突变在病毒的生长过程中绝对不会被修复。因此即使ICP4在病毒生长时被再结合修复，所得到的病毒将仍然是被删除ICP34.5的，以及因此在体内作为载体使用将仍然是安全的。当体内注射到实验动物脑部时，仅删除ICP34.5的病毒不具有神经毒力(见Chou等，1990)。在VMW65和vhs上的进一步失活突变进一步降低了毒性。
实施例4-体内的基因传递立体定位接种Sprague-Dawley大鼠的纹状体，使用5x10exp7pfu/ml的每种病毒原种5微升，在10分钟的时间内接种，使用了一种与哈密顿注射器连接的UltraMicroPump(World PrecisionInstruments)并采用一种MicroFil针(World PrecisionInstruments)进行注射，之后评定株系1764/pR15Δ4、1716/Δ4和17+/Δ4在体内的基因传递效率。在接种的两天、两周和一个月后成对处死大鼠，通过在磷酸盐缓冲液中灌注2％中甲醛固定、解剖、通过荧光显微镜检术测定GFP的表达，之后进行基因传递的评定。
两天以后，在所有病毒接种的位点周围的大量细胞中，可以看到GFP高水平表达。因此最初的基因传递效率在仅删除ICP4和删除ICP4及ICP34.5的病毒之间是可以比较的。因此删除ICP34.5不降低ICP4被删除的病毒作为载体的效率，即使这种病毒具有相对于仅删除ICP4的病毒安全性提高的优点。然而两周以后，在被1716Δ4和17+/Δ4接种的动物体内仅可以观察到相对较小数目的GFP+ve细胞，在经1764/pRl5Δ4接种的动物体内可以观察到明显较大数目的GFP+ve细胞，这进一步证明了该病毒毒性的降低。一个月时，经1716Δ4和17+/Δ4接种的动物体内没有观察到GFP+ve细胞，一些GFP+ve细胞保留在经1764/pRl5Δ4接种的动物体内(GFP此处受CMV IE启动子的驱动)，再次进一步证明了这一点。当用X-gal染色时，来源于经1764/pRl5Δ4接种的动物的脑切片在一个月时显示出比GFP+ve细胞明显较多的染成蓝色的细胞(指示lacZ活性)，可能反映了此处用于驱动lacZ的启动子的活性，其与以前在体内显示在HSV的潜伏期引起基因表达的启动子十分类似(Lokensgard等，1994)。
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权利要求
1．一种具有一个功能ICP27基因的单纯疱疹病毒(HSV)，其缺乏至少一个功能ICP4基因和一个功能ICP34.5基因。
2．一种根据权利要求1中所述的病毒，其进一步缺乏一个或多个除ICP34.5基因外的功能性非必需的基因。
3．一种根据权利要求2中所述的病毒，其缺乏一个功能vhs基因。
4．一种根据权利要求2或3中所述的病毒，其缺乏一个功能VMW65基因，这是由于所述基因中的一个突变废除了其转录激活的活性。
5．一种根据上述权利要求中任意一项所述的病毒，其中ICP4、ICP34.5和(或)非必需基因的缺乏是由于所述基因内的删除或在其中的插入。
6．一种具有一个功能ICP27基因的单纯疱疹病毒，其缺乏一个功能ICP4基因、一个功能ICP34.5基因、一个功能vhs基因和一个功能VMW65基因，这是由于在上述VMW65基因上的突变废除了其转录激活的活性。
7．一种根据上述权利要求中任意一项所述的病毒，其选自一种HSV1株系、一种HSV2株系或它们的衍生物。
8．一种根据权利要求7中所述的病毒，其是一种HSV1株系。
9．一种根据上述权利要求中任意一项所述的病毒，其带有至少一个异源基因。
10．一种根据权利要求9中所述的病毒，其中所述异源基因与一段允许所述异源基因在哺乳动物细胞中表达的操纵序列操作性连接。
11．一种根据权利要求10中所述的病毒，其中所述哺乳动物细胞是某一哺乳动物的中枢或外周神经系统的细胞。
12．一种根据权利要求10中所述的病毒，其中所述哺乳动物细胞是某一哺乳动物的眼部、心脏或骨骼肌的细胞。
13．一种根据权利要求9到12中任意一项所述的病毒，其中所述异源基因编码一种具有治疗作用的多肽。
14．一种根据权利要求13中所述的病毒，其中所述基因编码的多肽具细胞毒性。
15．一种根据权利要求13中所述的病毒，其中上述基因编码的多肽可以将一种药物前体的前体物转化成一种细胞毒性化合物。
16．一种根据权利要求10到13中任意一项所述的病毒，其中的异源基因是选自编码涉及细胞分裂调节的蛋白、涉及代谢途径的酶、转录因子和热激蛋白的基因。
17．一种根据权利要求10中所述的病毒，其是用于将所述异源基因传递到某一哺乳动物细胞内。
18．一种根据权利要求10到17中任意一项所述的，用于治疗人类或动物身体的方法的病毒。
19．一种根据权利要求18中所述的用于治疗某一哺乳动物神经系统的紊乱或损伤的病毒。
20．一种根据权利要求10到17中任意一项所述的单纯疱疹病毒在制造用于治疗人类或动物体的药物上的用途。
21．权利要求20中所述的单纯疱疹病毒在治疗某一哺乳动物神经系统的紊乱或损伤上的用途。
22．一种含有权利要求10到17中任意一项中所述的一种HSV株系以及一种药理上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。
23．一种研究某一异源基因在哺乳动物细胞中的功能的方法，该方法包括下列步骤(a)将所述异源基因引入到权利要求1到8中任意一项中所述的单纯疱疹病毒内；(b)将所得到的单纯疱疹病毒引入到所述哺乳动物细胞内；以及(c)测定所述异源基因在所述哺乳动物细胞中表达的效果。
24．一种根据权利要求23中所述的方法，其中所述异源基因是一种涉及引起疾病的野生型或突变型基因。
25．一种根据权利要求23或24中所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是功能紊乱的，所述基因是野生型的，以及所述异源基因的表达效果由细胞功能的分析来确定。
26．一种根据权利要求23或24中所述的方法，其中所述哺乳动物的细胞含有一个或多个被突变失活的内源基因。
27．一种生产权利要求1中所述的单纯疱疹病毒的方法，所述方法包括修饰某一单纯疱疹病毒的至少ICP4和ICP34.5基因，以使所述基因功能性失活，条件是所述ICP27基因保持完整性和(或)功能性。
全文摘要
本发明提供了一种疱疹单纯病毒,其具有一个功能ICP27基因并缺少至少一个功能ICP4基因和一个功能ICP34.5基因。本发明还提供了一种缺少至少一个功能ICP4基因和一个功能ICP34.5基因的单纯疱疹病毒株系在治疗哺乳动物神经系统的失调、或损伤上的用途。
文档编号A61K35/76GK1295612SQ9980460
公开日2001年5月16日 申请日期1999年1月29日 优先权日1998年1月29日
发明者R·S·科芬, D·S·拉特克曼, N·J·芬尼 申请人:拜奥维克斯有限公司