专利名称：：新型ω－芋螺毒素肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及ω-芋螺毒素类的新型肽，以及它们作为药物工具的应用和在其中对N型钙通道的阻滞可能是有益的任何指征中的应用，例如在局部缺血后神经元损伤的减轻，镇痛的产生，或者阿片剂镇痛的增强，精神分裂症、刺激引起的精神病、高血压、炎症和引起支气管缩小的疾病的治疗，以及在神经病疼痛进展的抑制中的应用。本发明还涉及包含这些肽的药物组合物和用于探寻这些肽的有用类似物的核酸探针。捕食性芋螺属海螺[锥形螺(conesnails)]是通过注射毒液制动它们的猎物的多族海洋软体动物。所述毒液是被称为芋螺毒素的肽复杂混合物，它们靶向种种不同的细胞受体。见于所述毒液中的肽混合物随锥形螺的种和该软体动物摄食的猎物的不同而不同。已发现了，从这样的毒液中分离的一个特别的肽家族(被称为ω-芋螺毒素)靶向和阻滞电压灵敏的钙通道(VSCCs)。这些ω-芋螺毒素都是相当小的肽(一般24～32个氨基酸)，它们具有六个特征性半胱氨酸取代和一种二硫键的型式。二硫键的型式和半胱氨酸残基的分布意味着该肽可被抽象地认为包括四个环。在半胱氨酸残基1和2、2和3、4和5以及5和6之间的氨基酸界定了这些环，而半胱氨酸残基3和4是相邻的。对于或者从芋螺属的各个不同种的复杂肽毒液分离的、或者作为已知ω-芋螺毒素的化学变体合成的不同ω-芋螺毒素的研究已提供了一组ω-芋螺毒素，它们显示对各亚类神经元钙通道的各不相同的亲和性和选择性。就是这些肽中的某些对于VSCCs的亲和性使一些ω-芋螺毒素已成为确定不同亚类的神经元电压灵敏性钙通道的重要研究工具。在哺乳动物系统中，ω-芋螺毒素(例如GVIA)对N型钙通道具有高水平的选择性，而其它ω-芋螺毒素(例如MVIIC)对N型通道却具有低亲和性但强烈结合P/Q型通道。这些配体的标记形式(例如125碘化MVIIA)经常被用于涉及VSCCs的药理学分析。虽然可获得的芋螺毒素适用于确定一些钙通道亚类，但是，显示不同的结合分布图和亲和性的新配体可能适用于进一步确定通道亚类。除了它们作为研究工具的应用外，还有提议将靶向N型钙通道的ω-芋螺毒素用于治疗种种病况，包括局部缺血引起的脑损伤，急性精神病发作(可能是药物引起的或者由精神病引起的)，引起支气管缩小的疾病、高血压、炎症和慢性疼痛。它们还可被用于精神分裂症的治疗、镇痛的产生和阿片剂引起的镇痛的增强。本发明的化合物可能用于其中对N型钙通道的阻滞可能是有益的任何指征。一种特定的ω-芋螺毒素(被称为MVIIA，或者呈其合成形式SNX-111)正在这些应用中的某些的临床试验中。尽管在ω-芋螺毒素的应用中存在这些进展，但目前可获得的化合物都不是理想的治疗剂。例如，报导了SNX-111由于在外周通道的作用而引起低血压。另一种ω-芋螺毒素(GVIA)是N型钙通道的有效拮抗物，但以不可逆方式与这类通道结合，所以不适合作为治疗剂。很多其它的已知ω-芋螺毒素不具有被认为是合适的治疗候选物的对N型通道足够的选择性水平；P/Q型通道的阻滞可能导致死亡。因此，存在对新治疗剂的需要，该治疗剂对N型钙通道的选择性胜过对P/Q型通道的选择性，而且它们可能适用于治疗与N型钙通道相关的病况。在本发明的第一方面，提供了一种分离的、合成的或重组的ω-芋螺毒素肽，其中，位于半胱氨酸残基5和6之间的第四个环包含如下氨基酸序列SGTVGR[序列1]或者这种序列，即，它已经历一个或多个氨基酸取代或侧链修饰。优选地，所述第四个环包含上述序列或者这种序列，即，它已经历一个或多个保守氨基酸取代或侧链修饰。优选地，ω-芋螺毒素肽的第一个、第二个和第三个环中的每一个相应于天然ω-芋螺毒素肽的环，或者这种氨基酸序列，即，它已经历一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。“取代”包括氨基酸改变，其中，一个氨基酸被一个不同的天然的或非常规的氨基酸残基替代了。这样的取代可被归为“保守”类，在该情况下，含于多肽中的一个氨基酸残基被另一个类似特征的天然氨基酸替代了，例如Gly_Ala,Val_Ile_Leu,Asp_Glu,Lys_Arg,Asn_Gln或Phe_Trp_Tyr。应懂得，某些非常规氨基酸也可能是天然氨基酸的合适的替代物。例如，鸟氨酸、高精氨酸和二甲基赖氨酸与His、Arg和Lys相关。本发明包括的“置换”还可以是“非保守的”，其中，多肽中存在的一个氨基酸残基被一个具有不同特性的氨基酸[例如得自不同类的天然氨基酸(例如以丙氨酸置换一个带电的氨基酸或疏水性氨基酸)]置换了，或者是，其中，一个天然氨基酸被非常规氨基酸取代了。氨基酸取代一般是单一的残基，但也可以是多个残基，或者是成簇的，或者是分散的。优选地，氨基酸取代是保守的。“添加”包括一个或多个天然的或非常规的氨基酸残基的添加。“缺失”包括一个或多个氨基酸残基的缺失。如上所述，本发明包括这样的肽其中，一个或多个氨基酸已经历了侧链修饰。本发明预期的侧链修饰实例包括氨基的修饰，例如通过还原性烷基化(即，通过与醛反应，接着用NaBH4还原)；用亚氨逐乙酸甲酯脒化(amidination)；用乙酸酐酰化；用氰酸酯使氨基甲氨酰化；用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)使氨基三硝基苄化；用丁二酸酐和四氢化邻苯二甲酸酐使氨基酰化；以及用吡哆醛-5-磷酸使赖氨酸pyridoxylation接着用NaBH4还原。精氨酸残基的胍基可这样修饰，即，通过与试剂(例如2,3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛)反应形成杂环缩合产物。羧基可这样修饰，即，碳二亚胺活化(经过0-酰基异脲形成)，接着衍生化(例如变成相应的酰胺)。巯基(sulphydrylgroups)可通过下列方法修饰，例如用碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化；过甲酸氧化成半胱磺酸；与其它硫醇化合物形成混合二硫化物；与马来酰亚胺、马来酐或其它取代马来酰亚胺反应；应用4-氯苯甲酸汞、4-氯苯磺酸汞、苯基氯化汞、2-氯汞基-4-硝基苯酚和其它汞化合物形成汞衍生物；用氰酸酯在碱性pH下甲氨酰化。半胱氨酸残基的任何修饰不能影响肽形成所需的二硫键的能力。还可能用硒等效物替代半胱氨酸的巯基以致肽形成二硒键而替代一个或多个二硫键。色氨酸残基可通过例如用N-溴丁二酰亚胺氧化或者用2-羟基-5-硝基苄基溴或磺酰卤(sulphenylhalides)使吲哚环烷基化而修饰。另一方面，酪氨酸残基可通过用四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物而改变。组氨酸残基的咪唑环的修饰可通过用碘乙酸衍生物烷基化或者用焦碳酸二乙酯N-乙酯基化而实现。脯氨酸残基可通过例如在4位羟基化而修饰。一些氨基酸残基(例如甲硫氨酸)可能在某些条件下易于氧化。在某些情况下，氧化的残基可能保留与亲本肽类似的生物活性，所以，认为肽的氧化形式在本发明的范围内，例如CVID，其中，甲硫氨酸残基被氧化了。但是，氨基酸残基的氧化可能在某些情况下导致活性或选择性的降低。因此，如果存在可氧化的残基，可用其它氨基酸替代它们。可以用具有类似特性(例如电荷和尺寸)的氨基酸或者可以用具有不同特性的氨基酸进行替代。例如，就CVID来说，12位的甲硫氨酸残基可用例如正亮氨酸、0-甲基丝氨酸、0-甲基高丝氨酸或丙氨酸替代。某些具有修饰侧链的氨基酸和其它非天然氨基酸的一览表如表1所示。表1如果给个体施药或者用作诊断试剂，这些类型的修饰可能对稳定肽来说是重要的。还可对肽作其它修饰以便稳定它或者增强它的其它特性(例如膜渗透或溶解性)。这样的修饰包括修饰一个或多个氨基酸的侧链而连接其它类的基(例如亲脂基)。这样的连接可通过连接基来实施，所述连接基被设计成将另一个或数个基与肽隔离而不干扰肽的活性。本领域技术人员应能容易地决定如何修饰本发明的肽。应认为所有这些修饰的肽形式都属于本发明的范围。本发明预期的其它衍生物包括从完全未糖基化分子到修饰的糖基化分子的一系列糖基化变体。改变的糖基化型式可能是由不同宿主细胞中重组分子的表达而产生的。本发明的ω-芋螺毒素一般在C末端酰胺化了，不过，具有游离羧基端或在C末端存在其它修饰的化合物被认为属于本发明的范围。优选地，所述肽被酰胺化了或者具有游离羧基。优选地，所述肽将保留Cys残基和特征二硫键型式。这些肽可能包含另外的Cys残基，但须在二硫键的形成过程中它们被保护了。优选地，所述肽具有第二个环，它包含一条选自如下的序列SKLMYD[序列2]，SRLMYD[序列3]，DRLMYD[序列4]，DKLMYD[序列33]，SKLAYD[序列34]，SKLNleYD[序列35]，SRLNleYD[序列36]，SKLOhmhserYD[序列37]，SKLOmserYD[序列38]，或者这样的序列，即，它已经历一个或多个保守氨基酸取代或者侧链修饰。在一个特别优选的实施方案中，ω-芋螺毒素肽具有如下序列CVID(1)CKSKGAKCSKLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列5]1234四个环如下画线所示。所述肽是从Conuscatus分离的，本文称之为“CVID”。在受体结合鉴定中，已证实所述肽具有高潜能和对N型钙通道的高选择性(与P/Q型钙通道相比)。还证实了CVID的两种修饰形式都具有高潜能和对N型钙通道的高选择性。这些修饰形式被称为R10-CVID和D9R10-CVID，如下所示R10-CVID(2)CKSKGAKCSRLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列6]D9R10-CVID(3)CKSKGAKCDRLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列7]本发明的肽可能是天然芋螺毒素肽(例如CVID)，或者可能是这类天然肽的衍生物。如前所述，天然芋螺毒素肽的衍生物和它们的天然对应物不同之处可能在于一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。在形成天然肽衍生物的修饰中，有用的是比较活性天然肽的氨基酸序列从而确定活性种类之间哪些残基(如果有的话)是保守的。这些保守残基的置换(虽然未被禁止)不如非保守残基的置换那样优选。其中Ala替代了一个或多个残基的衍生物可被用于鉴定药效基团。优选地，每一次只有一个或两个氨基酸被Ala替代了。可制备另外的新肽，其中，带电的、极性或疏水性残基分别被替代而帮助更准确地确定该药物类肽与它的受体结合中涉及的相互作用类别。非保守替代(其中，电荷是相反的，或者极性残基替代了疏水性残基)能进一步鉴定结合中涉及的残基。所有这些肽有潜力显示改善的潜能或更大的选择性。还可包括非天然氨基酸变更而改善潜能、选择性和/或稳定性。暴露的残基最有可能被包括于受体结合中并且可被系统地替代。尤其要将重点放在改变在结合中涉及的残基和恰好位于药效基团周边的残基，应用更长的侧链形式或非保守的变化以挑选另外的、改善潜能和/或选择性的结合作用。本领域技术人员已知的(Nielsen等，1996和1999)并且在实施例5中进一步描述了的三维1HNMR研究指示了，CVID仿效与已知ω-芋螺毒素(例如MVIIA)类似的折叠。然而，与那些ω-芋螺毒素不同，发现了CVID的环4呈与已知ω-芋螺毒素不同的取向，并且，CVID还具有将环2和环4保持在一起的两个氢键；具有可能赋予CVID区分VSCCs的能力的因子。鉴于环4的该新的证明和CVID环2和环4之间的稳定化，一类优选的衍生物是保持与在CVID中见到的相似的环4取向的那些。进一步优选的一类衍生物是那些ω-芋螺毒素，即，它们具有稳定环2和环4的构象(confirmation)的环2和环4之间的相互作用。本领域技术人员可以容易确定特定肽的三维结构、环4的取向和环之间的相互作用。另一类优选的衍生物是那些，即，它们在CVID的残基10、11、22和23处保持或只是具有保守取代。在本发明另一个实施方案中，提供了一种嵌合的ω-芋螺毒素肽，其中，芋螺毒素CVID的环1～3中的一个或多个已被不同ω-芋螺毒素的相应环取代了。一类优选的CVID的衍生物是保持CVID的某些残基的那些ω-芋螺毒素肽。这些衍生物以如下序列表示CxxxGxxCxKLxYxCCxSCSGxVGRC其中，每个x可能是任何其它的氨基酸，并且，至多一个x可能缺失。X的优选的选择应是得自ω-芋螺肽(ω-conopeptids)的相应的天然氨基酸，所述肽具有N型BSCC选择性和那些氨基酸的保守取代或丙氨酸取代，它们全部还可能具有修饰的侧链。例如，甲硫氨酸可能被O-甲基丝氨酸或O-甲基高丝氨酸替代了。一些已知的芋螺毒素如下所示MVIIA(SNX-Ⅲ)CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC[序列8]MVIICCKGKGAPCRKTMYDCCSGSCGRRGKC[序列9]GVIACKSOGSSCSOTSYNCCRSCNOYTKRCY[序列10]在GVIA的序列中的，“O”表示4-羟基脯氨酸(Hyp)。该氨基酸残基是从编码肽的翻译后修饰产生的，而且不是由核苷酸序列直接编码的。本发明预期的嵌合的ω-芋螺毒素包括DADD、DAGD和GGGD。其中，D、A或G分别表示选自CVID、MVIIA或GVIA的环。因此，DADD相应于环1，环3和4选自CVID，环2选自MVIIA，该嵌合的ω-芋螺毒素与R10-CVID的相同。发现了本发明的一些其它ω-芋螺毒素肽是由按实施例3中描述的一般方法从Conuscatus分离的mRNA编码的。这些编码肽是通过标准方法合成的，它们可被认为是CVID的衍生物，序列如下所示(4)CRSKGAKCSKLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列14](5)CKSKGARCSKLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列15](6)CKSKGAQCSKLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列16](7)CKSKGAKCSKLMYDCCSGSCSGAVGRC[序列17]CVID的其它衍生物的例子包括如下序列(8)CKSKGAKCDKLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列18](9)CKYKGAKCSRLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列19](10)CKSKGAKCSKLAYDCCSGSCSGTVGRC[序列20](11)CKSKGAKCSKLMYDCCTGSCSGTVGRC[序列21](12)CKSKDalAKCSKLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列22](13)CKSKGAKCSKLMYDCCSGSCSGTVGRCY[序列23](14)CKSKGAKCSKLMYDCCSGSCSGTVGRC-OH[序列24](15)YCKSKGAKCSKLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列25](16)AcCKSKGAKCSKLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列26](17)CKSKGAKCSKLNleYDCCSGSCSGTVGRC[序列27](18)CKSKGAKCSRLNleYDCCSGSCSGTVGRC[序列28](19)CKYKGAKCSRLNleYDCCSGSCSGTVGRC[序列29](20)CKSKGAKCSKLOmhserYDCCSGSCSGTVGRC[序列30](21)CKSKGAKCSKLOmserYDCCSGSCSGTVGRC[序列31](22)CKSKGAKCSKLM(O)YDCCSGSCSGTVGRC[序列32]化合物(13)和(15)(序列23和25)在C末端和N端分别具有另外的氨基酸。化合物(14)(序列24)在C末端具有游离羧基。化合物(16)(序列26)在N端被酰化了。化合物(22)(序列32)的甲硫氨酸残基被氧化成它的亚砜。化合物(10)、(17)、(2)和(21)(分别为序列20、27、30和32)代表甲硫氨酸替代物。一组优选的ω-芋螺毒素肽是CVID，化合物(4)、(5)、(10)、(17)、(18)、(20)和(21)。特别优选的ω-芋螺毒素肽是CVID。在附后的序列表中，氨基酸Xaa如表2中所示。表2本发明的肽优选具有对N型钙通道胜过对P/Q型钙通道的选择性。本文应用的术语“选择的”或“选择性”表示在N型钙通道的肽结合活性大于在P/Q型钙通道的结合活性。本领域技术人员应能应用标准技术轻易确定肽对于这些钙通道的选择性。碘化GVIA和MVIIC分别是N型钙通道受体和P/Q型钙通道受体的高亲和性配体，所以常用于受体结合鉴定中(Kristipati等，1994；Nadasdi等，1995)。这样的鉴定可被用于测试本发明的肽的钙通道结合活性。功能鉴定[例如由Lew等(1997)描述的那些]也适用于测定在N型钙通道的活性。本发明的肽还可用于这样的鉴定中。本发明的ω-芋螺毒素通常以标记形式(例如放射性碘标记的CVID)可被用于进行分析和/或筛选从而鉴定与N型钙通道和/或这类通道的特定亚型相互作用的化合物。本领域技术人员能轻易建立这样的分析和/或筛选。本发明化合物的各种标记形式可轻易通过标准方法制备和在标准分析中估测它们结合N型钙通道的能力的保持力。于是，不保持结合N型钙通道或这类通道的结合部分的能力的标记化合物形式就可被用于分析和/或筛选中。因此，本发明推广到本发明的肽在鉴定具有在N型VSCCs处的活性的化合物的筛选中的应用。本发明的ω-芋螺毒素可这样制备通过应用标准的肽合成方法、接着形成氧化二硫键。例如，线形肽可通过应用BOC化学的固相法合成[如Schnoltzer等(1992)描述的那样]。在去保护和从固体载体分离后，应用制备色谱法纯化还原的肽。纯化后的还原肽在缓冲体系中被氧化[例如实施例2中描述的那样]。应用制备色谱法纯化氧化的肽。描述芋螺毒素的合成的参考文献包括Sato等，Lew等和WO91/07980。还可应用重组DNA技术制备ω-芋螺毒素。编码所需的肽序列的核苷酸序列可被插入合适的载体和在适当表达系统中表达的蛋白质。在某些情况下，表达的肽的进一步化学修饰可能是合适的，例如C末端酰胺化。在某些情况下，可能需要在肽表达后作为化学步骤进行已表达肽的氧化键形成。在此之前可进行一步还原步骤而提供未折叠的肽。本领域技术人员可以轻易确定肽的还原和氧化的合适条件。天然CVID是从Conuscatus分离的，即，通过分析引导的所述毒液的分级接着对纯化的肽测序。本发明进一步提供了包含一条核苷酸序列的分离核酸分子，所述核苷酸序列编码编码上述ω-芋螺毒素肽的序列或与之互补。本发明又一方面提供了包含一条核苷酸序列的核酸探针，所述核苷酸序列编码一条编码具有CVID第四个环的ω-芋螺毒素肽的序列或与之互补，所述探针编码ω-芋螺毒素CVID的环4的全部或部分或者与之互补，或者编码这种序列(即，它已经历一个或多个氨基酸取代或侧链修饰)或与之互补。在一个特别优选的实施方案中，所述核酸探针包含一条核苷酸序列，该核苷酸序列编码一条编码序列1中所示序列的序列或与之互补。本文应用的“探针”包括应用于扩增中的引物或应用于直接杂交中的探针。本发明又一方面涉及抗本发明的ω-芋螺毒素肽的抗体。这样的抗体可能是单克隆的或多克隆的，并且可选自抗所述肽的天然抗体或者可应用标准技术专门对所述肽引发。在后一种情况下，可能首先需要将所述肽与载体分子关联。本发明的抗体特别适合作为治疗剂或诊断剂。在这方面，可应用特异性抗体筛选本发明的肽。用于这类分析中的技术是本领域已知的，例如包括夹心分析法和ELISA。肽水平的理解可能对于监测某些治疗方案来说是重要的。本发明的核酸分子可以是DNA或RNA。当该核酸分子呈DNA形式时，它可以是基因组DNA或cDNA。本发明的核酸分子的RNA形式一般是mRNA。虽然本发明的核酸分子一般呈分离的形式，但它们可被整合入或连接到其它基因分子或者与其它基因分子融合或结合，所述其它基因分子例如是载体分子(特别是表达载体分子)。载体和表达载体通常能在原核细胞或真核细胞中的一种或二者中复制和(如果合适的话)表达。优选地，原核细胞包括大肠埃希氏菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillussp)和假单胞菌(Pseudomonassp)。优选的真核细胞包括酵母、真菌、哺乳动物和昆虫细胞。因此，本发明的另一方面预期一种基因构建物，它包括载体部分和能编码本发明的肽的基因。优选地，所述基因构建物的基因部分可操纵地被连接到所述载体上的启动子，以致所述启动子能在适当细胞中指导基因部分的表达。本发明推广到这样的基因构建物和包含它们的原核细胞或真核细胞。鉴于它们的高潜能和对N型钙通道胜过对P/Q型钙通道的选择性，本发明的ω-芋螺毒素肽可适用于其中对N型钙通道的阻滞可能是有利的任何指征。这样的指征包括在局部缺血后神经元损伤的减轻，镇痛的产生，阿片剂镇痛的增强，精神分裂症、刺激性精神病、高血压、炎症和引起支气管缩小的疾病的治疗，以及神经病疼痛进展的抑制。“镇痛”表示疼痛普遍地减轻，包括急性、持续性或神经病性疼痛的减轻。优选的指征(其中，所述肽可能适用)包括镇痛的产生，阿片剂镇痛的增强，以及神经病疼痛进展的抑制。适用于评估在N型钙通道具有活性的化合物(例如本发明的ω-芋螺毒素)的分析可以是体外分析或体内分析，并且是本领域技术人员已知的。分析法实例包括如下文献中描述的或参考的那些WO91/07980、WO93/13128、US5,824,645、WO97/04797、未来的药物(1994和1998)、药物数据报导(DrugDataReport)(1993)或Heading(1999)。可能适用的具体分析法包括体外结合鉴定法；伤害性试验(例如福尔马林试验和电热板试验)(Molmberg和Yaksh,1995)，尾轻击试验和机械爪加压试验(Omote等，1996)，或神经病疼痛模型(White和Cousins,1998)；神经保护试验(例如大鼠4-血管阻塞模型)或体外细胞存活鉴定；考察对神经递质释放(例如物质P)的效果的其它分析法(Ray等，1991；Cabot等，1998)。本发明的ω-芋螺毒素已在这些分析法的某些中表现有效的活性。因此，本发明的进一步方面提供了一种组合物，它包含一种分离的、合成的或重组的ω-芋螺毒素肽，其中，半胱氨酸残基5和6之间的第四个环包含如下氨基酸序列SGTVGR[序列1]或者这一序列，即，它已经历一个或多个保守氨基酸取代，以及药物上可接受的载体或稀释剂。优选地，所述组合物呈药物组合物的形式。还提供了一种分离的、合成的或重组的ω-芋螺毒素肽在制备药物方面的应用，在所述肽中半胱氨酸残基5和6之间的第四个环包含如下氨基酸序列SGTVGR[序列1]或者这一序列，即，它已经历一个或多个保守氨基酸取代或侧链修饰，所述药物适用于在局部缺血后神经元损伤的减轻，镇痛的产生，阿片剂镇痛的增强，精神分裂症、刺激性精神病、高血压、炎症和引起支气管缩小的疾病的治疗，或者用于神经病疼痛进展的抑制。本发明进一步提供了一种方法，该方法适用于在局部缺血后神经元损伤的减轻，镇痛的产生，阿片剂镇痛的增强，精神分裂症、刺激性精神病、高血压、炎症和引起支气管缩小的疾病的治疗，或者神经病疼痛进展的抑制；所述方法包括这一步骤给哺乳动物施用有效量的一种分离的或重组的ω-芋螺毒素肽，其中，半胱氨酸残基5和6之间的第四个环包含如下氨基酸序列SGTVGR[序列1]或者这一序列，即，它已经历一个或多个保守氨基酸取代或侧链修饰。优选地，所述哺乳动物需要这种治疗，不过，所述肽可在预防意义上被施用。正如本领域技术人员轻易理解的那样，施药的途径和药物上可接受的载体的性质将取决于病况的性质和受治疗的哺乳动物。认为具体载体或送递体系的选择以及施药途径的选择可轻易由本领域技术人员决定。在包含所述肽活性物的制剂的制备中，应当小心以保证肽的活性在制备过程中不被破坏，并且，所述肽能到达它的作用部位而不被破坏。在某些情况下，可能需要通过本领域已知的方法(例如微型包囊法)保护所述肽。同样，选定的施药途径应当使所述肽到达它的作用部位。适合注射用的药物形式包括无菌可注射溶液或分散液，以及用于临时配制无菌可注射溶液的无菌粉末。它们应当在生产和贮存条件下稳定并且可被保存而抗氧化和微生物(例如细菌或真菌)的污染作用。本领域技术人员可以应用常规方法轻易确定本发明的肽或修饰的肽的适当制剂。优选的pH范围和合适的赋形剂(例如抗氧化剂)的确定是本领域的常规(例如参见Cleland等，1993)。通常应用缓冲体系提供所需范围的pH值，缓冲体系包括羧酸缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐和琥珀酸盐。就这样的制剂来说，可获得各种抗氧化剂，包括酚类化合物(例如，BHT或维生素E)，还原剂(例如甲硫氨酸或亚硫酸盐)以及金属螯合剂(例如EDTA)。用于可注射溶液或分散液的溶剂或分散介质可以包含适合肽活性物的任何常规溶剂或载体体系，例如，可以包含水，乙醇，多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)，其合适的混合物，以及植物油。合适的流动性例如可这样保持通过应用涂层(例如卵磷脂)，通过维持所需的粒径(就分散液来说)以及通过应用表面活性剂。如果需要的话，通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)可以防止微生物的作用。在很多情况下，将优选包含作用剂(例如糖或氯化钠)以调节重量摩尔渗透压浓度。优选地，注射制剂应是与血液等渗的。可注射组合物的持久吸收可通过在组合物中应用延迟吸收的作用剂(例如单硬脂酸铝和明胶)而实现。适合注射用的药物形式可通过任何合适的途径(包括静脉内的、肌内的、脑内的、鞘内的、硬膜外的注射或输注)送递。无菌可注射溶液是这样制备的将需要量的活性化合物与所需的各种其它配料(例如上文列举的那些)在适当的溶剂中掺和，接着过滤灭菌。通常，分散液是这样制备的将各种已灭菌的活性配料掺入无菌载体(它包含基本分散介质和得自上文列举的、所需的其它配料)。就用于配制无菌可注射溶液的无菌粉末来说，优选的制备方法是将活性组分加任何其它所需配料的预先无菌过滤后的溶液真空干燥或者冻干。当所述活性组分被适当保护后，它们可被口服(例如与惰性稀释剂或与可同化的可食载体一起)，或者它可被包封于硬壳或软壳明胶胶囊中，或者它可被压成片，或者可将它直接与饮食食品掺和。就口服治疗剂来说，可将活性化合物与赋形剂掺和并以可摄食的片剂、含片、糖锭、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸囊剂等形式应用。这样的组合物和制剂优选包含至少1wt％的活性化合物。所述组合物和制剂的百分数当然可以改变，就便在约5～约80％的单位重量之间。在这类治疗上有用的组合物中，活性化合物的量应使得达到合适的剂量。片剂、糖锭、丸剂、胶囊等还可包含下文列举的组分粘合剂，例如树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；以及可添加增甜剂，例如蔗糖、乳糖或糖精；或者调味剂，例如薄荷、冬青油或樱桃香精。当单元剂量形式是胶囊时，除上述类别的物质之外，它还可能包含液态载体。可存在各种其它物质作为包衣或另外修饰该单元剂量的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可用紫胶、糖或者这二者包衣。糖浆或酏剂可包含活性化合物、作为增甜剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和丙酯、染料和调味剂(例如樱桃香精或橙香精)。当然，在制备任何单元剂量形式中应用的任何物质应该是药物纯的，并且，应用的量基本上是无毒的。此外，所述活性化合物可被掺入缓释制剂和配方。本发明还推广到适合施药(例如局部施药)的任何其它形式，例如乳膏、洗剂和凝胶；或者适合吸入或鼻内送递的组合物，例如溶液或干粉。肠胃外剂型是优选的，包括适合静脉内、鞘内、脑内或硬膜外送递的那些。药物上可接受的载体和/或稀释剂包括任意和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这样的介质和作用剂在药物活性物质方面的应用是本领域中熟知的。除了与活性组分不相容的任何常规介质或作用剂的情况，它们在治疗组合物中的应用都可考虑的。还可将辅助活性组分掺入所述组合物中。特别有益的是配制呈单元剂量形式的肠胃外组合物以便施药和为了剂量的均一性。本文应用的“单元剂量形式”表示适合作为受治疗哺乳动物受试者的单元剂量的物理上分散的单元；每个单元包含预定量(经计算产生所需治疗效果)的活性物质与需要的药物载体。关于本发明的新单元剂量形式的说明取决于且直接依赖于(a)所述活性物质的独特的特性和要达到的特定的治疗效果，以及(b)在配制用于治疗患病的活受试者(其中，身体健康受如本文详细公开的那些损伤)的这类活性物质的技术中固有的限制。为了方便和有效施药，将主要的活性组分以有效量与合适的药物上可接受的载体按单元剂量形式配制。一个单元剂量形式例如可包含用量在0.25μg～约2000mg范围内的主要活性化合物。以比例表示时，活性化合物一般以约0.25μg～约200mg/ml载体的量存在。就包含辅助的活性组分的组合物来说，剂量是通过参考常规剂量和所述组分的施药方式确定的。为了便于理解本发明，应参照实施例和图(它们阐释了本发明一些优选的实施方案)。但是，应懂得，上文描述的一般性不能被下文描述的特殊性代替。参照附图图1是编码CVID的核酸序列实例。还示出了包含前导序列和末端甘氨酸的氨基酸序列。还分别以序列12和序列13示出了核酸序列和氨基酸序列，而编码第四个环的核酸则示于序列11。初级核苷酸序列长度为382bp，它包含前导序列(氨基酸残基1～45)、成熟肽(氨基酸残基46～73并以框圈住)、3’未翻译区(紧接成熟肽区以小写字母描述)和被掺入CSRD-301A引物的5’未翻译区的小部分(在序列起始处以粗斜体小写字母描述)。加下划线标出了描绘所述肽编码区的起始密码子和终止密码子。已从初级核苷酸序列翻译了关于前导肽和成熟肽的推定的氨基酸序列并以单字母缩写示于核苷酸序列下方。核苷酸序列上方的编号涉及取自起始密码子的氨基酸残基的位置。以粗斜体突出CVID序列中CSRD-301APCR引物的位置锚定引物(ANCHORprimer)应位于紧接聚腺苷酸尾的3’(382+bp)。在位置45的精氨酸残基处的箭号指示从成熟肽酶促分裂前导肽的最可能的位点。预期的已表达蛋白质的末端甘氨酸是通过一定形式的翻译后修饰将酰胺化C末端胱氨酸留在从螺分离的蛋白质中而除去的。ω-芋螺毒素CVID(1)最初是从由Conuscatus(采集自澳大利亚的GreatBarrierReef)的毒液管提取的粗毒液中分离的。应用梯度反相HPLC将粗毒液分离成一些级分，然后用125IGVIA结合鉴定法(参见实施例4)分析这些级分。通过鉴定法指导的反相HPLC进一步纯化在该结合鉴定法中活泼的级分，对明确获得的一级结构进行Edman测序。相应于CVID的级分保留时间约为25～27分钟。反相HPLC是在Waters600HPLC系统的制备型和分析性VydacC18柱上进行的。一般应用1％梯度(100％A,5min；100％A～60％B,60min)以1ml/min使样品流动并在214nm处监测。不时应用大小排阻HPLC获得另外的级分。或者在1分钟间隔或者相应于用紫外监测器检测的峰收集用于分析的级分。所有分析中应用的缓冲体系是A=0.1％TFA(于H20中)，并且B=0.09％TFA、10％H2O、90％CH3CN。将VydacC18,5μ(1.0×25cm)柱用于半制备型RP-HPLC，而将VydacC18,10μ(2.2×25cm)柱用于制备型RP-HPLC。通过制备型色谱法纯化粗还原肽，即，应用1％梯度(100％A～80％B,80min)以8ml/min的流速和在230nm处进行紫外检测。收集级分并通过电喷射质谱法分析。然后通过分析型RP-HPLC分析给出所需质量的级分而证实纯度，合并那些纯级分，冻干后给出还原肽。氧化肽是这样纯化的将酸化后的反应混合物以8ml/min的流速装填到制备型柱上，用100％A洗涤直至洗脱全部氧化缓冲液，然后应用1％梯度(100％A～80％B,80min)和8ml/min的流速，在230nm处进行紫外检测。收集级分，象对还原肽那样分析。如果需要进一步纯化，在半制备型柱上再纯化所述肽，即，应用1％梯度(100％A～80％B,80min)和8ml/min的流速，在230nm处进行紫外检测。收集级分，象前述那样分析。质谱法质谱是在PESciexAPI-Ⅲ三重四极离子喷雾质谱仪上测定的。信息是以正离子形式获得的，即，通过应用0.1amu的扫描步长和0.3s的延迟时间从数次扫描积累400～2100amu范围内的信息。将肽以1mg/ml的浓度溶于含0.1％TFA的45％乙腈水溶液。未进一步处理而应用HPLC级分。将样品经过玻璃毛细管传送到小孔，即，应用Rheodyne注射器直接注射(5～20ul)入30～40ul/min的、含0.05％TFA的50％乙腈水溶液溶剂流。将产生的信息去褶合(Hypermass-MacSpec3.2,SCIEX，加拿大)而测定观察到的质子化物质的Mr。其它高分辨信息是在BrukerSpectrospinBioAPEX外置离子源傅立叶转化电喷射质谱仪上、在4.7T的磁场下获得的。关于某些合成的肽的信息列表如下表3合成的肽、最佳产率和质量值一览表实施例3CVID基因序列的分离和表征RNA提取和cDNA合成两个Conuscatus样品都是从theQueenslandGreatBarrierReef的LadyElliotIsland采集的。将动物在冰上麻木，解剖而摘除从毒液球至吻突的区内的毒液管。将管切片，置于含硫氰酸胍/N-月桂酰肌氨酸的缓冲液中，然后手工研磨乳化。应用PharmaciaBiotechQickPrepmRNA纯化系统从混合物提取聚腺苷酸有尾mRNA。链-1cDNA是应用Notl-d(T)18双功能引物(5’-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAAT(18)-3’)(PharmaciaBiotech)结合SuperscriptⅡ逆转录酶(GibcoBRL)从C.catus聚腺苷酸mRNA模板合成的3’端。生成的cDNA模板被用于制备双链cDNA，即，应用RNA酶H/DNA聚合酶操作按PharmaciaBiotechcDNATimesaver方案制备。然后将Marathon(Clontech)连接物加到ds-cDNA分子的5’端和3’端而完成cDNA构建。一个典型的完整芋螺毒液肽cDNA分子示于图1。CVID的PCR衍生和相关的cDNA序列在热循环仪(Omnigene)中对包含下列物质的样品进行了PCR得自C.catus的ds-cDNA、CSRD-301A引物(5’-ATCATCAAAATGAAACTGACGTC-3’)、ANCHOR引物(5’-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAAT-3’)和适当的Tag聚合酶(BiotechInternational)和缓冲液(25mMMg,100uM脱氧核苷酸，在pH8.5缓冲)，在95℃/2mins进行1次循环，95℃/30sec～55℃/60sec～72℃/90sec进行35次循环，以及在72℃/10mins进行1次循环。该PCR产生大约380bp～500bp的不均一DNA产物。得自该PCR产物的克隆的序列分析表明，它包含序列CVID和其它相关的毒液肽序列。CVID的克隆和测序在低熔点琼脂糖中将从CSRD-301A-ANCHOR驱动的C.catuscDNA的PCR产生的DNA产物进行电泳再切除。从Qiagen柱上的琼脂糖提取DNA，用T4DNA激酶(Progen)再磷酸化，用Klenow聚合酶(Progen)弄成平端，再用T4DNA连接酶(Progen)连接入去磷酸化Sma-1切割pUC-18质粒载体DNA(PharmaciaBiotech)的多克隆位点。载体DNA被电转化入Bluescript大肠埃希氏菌细胞，产生代表PCR产物的克隆文库。将该文库的等分样铺在LBamp板上，选择个体克隆，在TBamp培养液中繁殖一夜。应用RPM系统(BIO-101)从培养物纯化质粒DNA，应用pUC-18正向引物和反向引物(PharmaciaBiotech)、双脱氧终止子测序化学品(PerkinElmer)在ABI373测序仪上对载体内的PCRDNA插入片段进行测序。应用SequenceNavigator软件(AppliedBiosystems)分析序列信息。CVID基因序列C.catusCSRD-301A/ANCHOR毒液管cDNAPCR文库内的克隆号Cca-6提供了CVID肽的序列。关于CVID基因的核苷酸序列和预期翻译的相关氨基酸序列示于图1中。该克隆文库的进一步分析揭示了共有八个克隆具有相同的序列。在两个取向中对所有的克隆测序而产生共有序列。CVID序列具有下列特征●222个碱基对(它翻译成73个氨基酸)的编码序列●28个氨基酸的预测的成熟肽序列。应注意，在从螺分离的蛋白质中，预计表达的蛋白质的末端甘氨酸是通过某形式的翻译后修饰除去的，留下酰胺化C末端胱氨酸。●预测的成熟肽具有下列型式的六个半胱氨酸构架C-a6-C-a6-CC-a3-C-a6-C前导肽和成熟肽二者的核苷酸序列和氨基酸序列都不与任何已知的肽序列相同。应用某些另外的引物代替CSRD-301A引物，对C.catus进行了与上述类似的进一步试验。这些引物被设计成更专一的，它们是OM-2A(5’-ATCAAAATGAAACTGACGTGTGTGGTG-3’)和Cca-6-3B(5’-GCGTTTTGATCAGCCACATCTACCTA-3’)。这些试验导致鉴定CVID的某些衍生物的序列。125I-标记的肽的制备型HPLC是在装有两个Waters510HPLC泵和一个Waters481吸光度检测器的Waters680梯度控制器上进行的。在Vydac反相C-18分析柱(4.6×250mm)上分析肽，用0～67％溶剂B的线性梯度在100min内以1ml/min洗脱溶剂A,1％TFA(三氟乙酸)；溶剂B,90％ACN+0.09％TFA。在214nm监测分离，收集各为1ml的级分。用LKBWallac1272自动γ计数器检测研究中的级分。为了证实碘化肽的同一性，在PE-SCIEXAPIⅢ质谱仪(PESciex,Thornhill,Ontario，加拿大)上进行了质谱分析。将得自用无放射活性K127I碘化的肽的HPLC级分直接注入质谱仪。质谱是应用软件包MacSpec(Sciex,Toronto)在AppleMacintoshIIfx计算机上获得的。大鼠膜制备大鼠膜是按Wagner等(1988)的方法制备的。通过颈离位杀死大鼠，摘除它们的脑并立即在液氮中冷冻。将冷冻的脑在-78℃下贮存备用。将三个脑(湿重6.25g)融化，在125ml50mMHEPES(pH7.4)中用ultraturrex(IKA,170瓦)均化。在4℃,16000rpm(35000g)下将均化后的脑离心20min，弃去上清液。将离心片通过进一步均化而重悬浮于50mMHEPES(pH7.4)、10mMEDTA中，在4℃下保温30min。重复如上述那样的离心并弃去上清液。将离心片重悬浮于125ml50mMHEPES(pH7.4)(1∶20稀释)中，在-78℃下贮存。结合鉴定法结合试验是按以前的描述(Kristipati等，1994,Nadasdi等，1995)进行的。在室温下的玻璃管内一式三份进行配体结合鉴定。简单地说，是在室温下的12×75mm硼硅酸盐培养管中并保温1hr而进行鉴定的。每支管盛有100μl各试验化合物，依次添加碘化配体(7fmol)和大鼠膜(16mg)。鉴定缓冲液包含20mMHEPES(pH7.2)、75mMNaCl、0.1mMEDTA、0.1mMEGTA、0.1％BSA和蛋白酶抑制剂、2mM亮抑酶肽和0.5U抑酶肽。或者在17nMGVIA或者在100nMMVIIC存在下测定非特异性结合。通过真空过滤终止鉴定，即，在Millipore歧管过滤系统上应用预先浸泡在0.6％聚乙烯亚胺中的玻璃纤维过滤器(WhatmanGFB)进行过滤。用3ml冰冷的洗涤缓冲剂(20mMHEPES(pH7.2)、125mMNaCl和0.1％BSA)将每支管洗涤3次。在γ计数器上对过滤器计数。在某些情况下，通过测定结合到过滤后的大鼠脑膜上的125I-GVIA而确定N型钙通道处的效价估计值，即，应用Tomtec采集机并且用MicroBetaJet闪烁计数器计数。两种操作获得了类似的结果。在所有情况下，应用GraphpadPrism产生结合曲线并计算EC50值。本发明的某些化合物的值示于表4中。表4大鼠脑结合鉴定中的EC50<tablesid="table3"num="007"><table>肽125IGVIA鉴定125IMVIIC鉴定CVID3.1e-11(2.3e-10)7.1e-5(6.4e-5)R10-CVID7.5e-11(5.3e-11)＜3.5e-6(1.2e-3)D9R10-CVID1.8e-9(7.6e-10)＜4.6e-5(＜1.0e-3)(4)3.2e-11＜6.3e-7(5)2.15e-11＜7.1e-7(7)4.3e-11＜5.6e-7(11)4.57e-11＜4.3e-6(12)7.11e-11＜4e-6(13)5.03e-11＜4e-6(14)7.1e-10＜4.7e-6(15)4.4e-10＜4.6e-6(18)1.7e-10＜1.4e-6(20)3.5e-11＜3.4e-7(21)9.1e-11＜7.4e-7</table></tables>当引用了两个数值时，括号中的数据表示初始结合研究的数据，而另一个数值则表示得自进一步试验的结果。实施例5鉴于CVID表现的对于N型VSCC的高水平选择性，研究了可能对它的N型选择性有影响的结构特征。应用本领域技术人员已知的那种标准1HNMR技术进行了研究。方法1HNMR结构研究1HNMR光谱法-所有NMR实验都是在装有一个z-梯度单元的BrukerARX500分光仪上或者装有一个x,y,z-梯度单元的BrukerDMX750分光仪上记录的。肽浓度在1～5mM范围内。每种类似物都是在95％H2O/5％D2O(pH2.5～3.5)中检测的.记录的1HNMR实验是混合时间为200和400ms的NOESY(Kumar等，Jeener等)，以及混合时间为120ms的TOCSY(Bax)。所有光谱都是在293°K下记录的，在6024Hz(500MHz)或8192Hz(750MHz)范围操作，4K数据点，400～512FIDs,16～64次扫描，和1s的再循环延迟。记录CVID的额外实验包括NOESY(100ms混合时间)，DQF-COSY(Rance)，以及在293°K的E-COSY(Greisinger)(100％D2O)，在280°K下重复实验。应用WATERGATE序列(Piotto等，1992)抑制溶剂并应用UXNMR处理光谱。通过多项式函数放大FIDs，应用90°变换的正弦钟形函数在两个方向变迹，或者在傅立叶变换前应用以f1表示的适中高斯函数(mildGaussianfunction)变迹。应用第5阶多项式校正基线，化学位移值以0.00ppm处的DSS为内标。次级Hα位移是应用Marutka等，(1995)的无规线团位移值测定的。3JNH-Hα偶合常数是从高分辨1D光谱(32K)测定的，与得自DQF-COSY光谱的那些(它们是转化成8K×1K的窄条)比较，并应用程序Aurelia(BrukerGMBH)中的Lorentzian直线拟合子程序求出。3JHα-Hβ偶合常数是从转化成高数字式分辨(8K×1K)的E-COSY光谱直接测定的。距离限制和结构计算-NOESY光谱中的峰体积被分为强的、适中的、弱的和很弱的，分别相应于质子间距离为2.7、3.5、5.0和6.0_的上限。距离下限设定在1.8_。作了适当的假原子校正(Wüthrich等，1983)，将0.5_和2.0_的距离分别加到包括甲基质子和苯基质子的限制范围的上限。应用3JNH-Hα偶合常数确定φ二面角限制范围[Pardi等，1984]，应用3JHα-Hβ偶合常数和相关的NOESY峰强度确定x1二面角限制范围[Wagner等，1987]。如果没有质子的前手性对的非对映专一排布，就应用两个限制范围的最大上限，但是，如果要确定立体有择的排布，就要清楚地说明距离。结构是利用基于Engh和Huber参数(Brooks等，1983)的几何力场、应用XPLOR3.8版[Brünger等，1986；Brünger,1992；Rice；Stein]中的扭转角动力学/模拟退火方案计算的。起始结构是应用无规(φ,1)二面角和能量最小化(500步)从头产生的，生成具有校正的局部几何形状的结构。该结构经历了在15ps期间冷却到0°K和最后的能量最小化(1000步)之前共计15ps的高温(50000°K)分子动力学。结构精修是应用在改良的Engh和Huber力场影响下的能量最小化(1000步)进行的。数据分析-应用关于Ca原子、C原子和N原子的成对的和平均的RMSDs(XPLOR3.8版)，并且通过计算关于主链二面角的角序数参数[Hyberts等，1992；Pallaghy等，1993]比较了结构。结构具体化是应用INSIGHTII(MSI)进行的。结果1HNMR光谱法在CVID的环2和4中见到了Hα次级位移的最大差异(与MVIIA比较)。环4中的差异并不意外，已知CVID具有新的序列而且掺入了两个另外的残基，环2中的差异值得注意，因为MVIIA和CVID中的环2是相似的。CVID中残基9～14的次级位移遵循MVIIA中那些的基本形式，但是数值更大，表明CVID中环2的结构可能更稳定。这可能是由和环4远程相互作用引起的。环2以前一直是ω-芋螺肽结构的最不明确区，该环的残基特征在于1HNMR光谱中的较宽峰，指示构象变换(Nielsen等，1996；Lew等，1997)。该结构的不明确妨碍了对环2在ω-芋螺肽的活性、功能和选择性中所起的关键作用的研究，尤其是重要的结合决定子Tyr13以及次要的残基(例如MVIIA中的Leull和Arg10)的作用(Nadasdi等，1995)。所以，CVID可能为药效基团开发提供新的结构模板。由于CVID的环2和环4中残基的次级Hα位移的显著差异阻碍从现有ω-芋螺毒素结构准确模拟CVID，以及已知它的增强的N-型选择性，所以如下述那样应用1HNMR光谱法测定了CVID的3D结构。ω-芋螺肽CVID的3D结构计算了CVID的一组50个结构，该计算基于共计481个距离限制(来自159个残基内的、110个序列的、184个中间的和远程NOEs,28个H键限制(界定共14个H键))和23个φ与10个x1二面角限制。一共47个结构集中于共有褶，没有大于2_的NOE干扰，也没有大于3°的二面角干扰。在这些结构中，选定了20个最低能量结构而代表CVID的结构。这些结构被特别准确地确定了，主链成对的RMSD为0.35_(从所有残基计算的)。关于φ和1主链二面角的角阶参数(angularorderparameters)(S)平均是0.99，指示高度的结构准确性，它反映在使平均RMSDs降低至0.24_的中等结构。对其它ω-芋螺毒素未曾描述的CVID的新特征包括在环2和环4之间存在两个氢键，分别从Lys10和Leu11的NH质子到Gly22和Thr23的C=O氧原子。有可能这些氢键增强了CVID中环2的稳定性(与其它ω-芋螺毒素比较)。重要的是，Tyr13的主链已在αL构象中被稳定了，x1侧链的扭转角为-60°。试图确定其它ω-芋螺毒素中Tyr13的构象的研究一直不明确，确实，Tyr13在其它ω-芋螺毒素中可能呈平均构象。强残基内NHi-HαiNOE与更弱Hαi-1-NHi以及7Hz的3JNH-Hα偶合常数的存在支持了关于CVID中Tyr13构象的结构观察结果。讨论发现了CVID采取与已知ω-芋螺毒素(例如MVIIA、MVIIC和GVIA)类似的球形折叠。该对比还突出了环4结构中的显著差异，它的取向是在MVIIA(具有最短的环4)和MVIIC中向下，在GVIA中向外，但在CVID中趋向环2弯曲而形成更象球形的表面。在CVID中环4和环2之间两个氢键的存在可能有利于环4呈该取向，并有助于稳定环2。这是一项有意义的发现，因为以前关于GVIA、MVIIA或MVIIC未曾报导环4和环2之间的氢键。CVID结构的该独特方面可能促进它对N型VSCC选择性的改善，并且启示了，环2/4组合可能包含ω-芋螺肽选择性的重要决定子。CVID的高潜能和选择性使它成为基于它的3D结构开发药效基团的引人注意的候选物。环2改善了的稳定性可能一致促使它比其它迄今发现的ω-芋螺毒素更优良的选择性。但是，缺乏在MVIIA(Arg21,Nadasdi等，1995)和GVIA(Lys24,Tyr22；Lew等，1997)的环4中存在的重要的次级结合残基，很可能独特的一组ω-芋螺毒素/VSCC相互作用起源于CVID中的环4，有可能通过较暴露的Thr23或Val24。参考文献Ahmad,S.N.等，(1988)脑研究，453,247～56。Bax,A.和Davis,D.G.,(1985)磁共振杂志，65,355～60。Brooks,B.,Brucoli,R.,Olafson,B.O.,States,D.,Swaminathan,S.和Karplus,M.(1983)计算机化学杂志，4,187～217。Brünger,A.T.,Clore,G.M.,Gronenborn,A.M.和Karplus,M.,(1986)美国国家科学院院报，83,3801～3805。Brünger,A.T.(1992)X-PLOR3.1版，X射线晶体学和NMR的体系，YaleUniversity,NewHaven,CT。CabotP.J.,CramondT.R.和SmithMT(1998),Pul.Pharmacol.Ther.,10(4),215～221。Cleland等，CritRev.Therap.DrugCarr,Syst.,(1993),10,307～366.Cruz,L.J.等，(1986)生物学与化学杂志，261,6230～6233.未来的药物，(1994),19(2),128.未来的药物，(1998),23(2),152.药物数据报导，(1993),15(9),807.Fraker,P.J.等，(1978)生物化学与生物物理学研究通讯，80,849～857.Greisinger,C.,Sφrenson.O.W.和Ernst,R.R.,(1987)，磁共振杂志，75,474～492。HeadingC.,(1999),Curr.Opin.CPNSInvestigationalDrugs,(1999),1(1),153～166。Hyberts,S.G.,Goldberg,M.S.,Havel,T.S.和Wagner,G.,(1992)，蛋白质科学，1,736～751。Jeener,J.,Meier,B.H.,Bachmann,P.和Ernst,R.R.,(1979)，化学与物理学杂志，71,4546～4553。Kim,J.等，(1995)，生物化学与生物物理学研究通讯，214,305～309。Kristipati,R.等，分子和细胞神经科学，5,219～228(1994)。Kumar,A,Ernst,R.R.和Wüthrich,K.,(1980)生物化学与生物物理学研究通讯，95,1～6。Lew,M.等，(1997)生物学与化学杂志，272,12014～12023。M.Schnoltzer等，国际肽蛋白质研究杂志，40,180(1992)。Nadasdi,L.等，(1995)生物化学，34,8076～8081。OmoteK.等，(1996)麻醉学，84,636～43。MalmbergA.B.和YakshT.L.,(1995)神经科学杂志，14,4882～90。Marutka,G.,Dyson,H.J.和Wright,P.E.,(1995)生物分子NMR杂志，5,14～24。Nielsen,K.J.,Skjaerbaek,N.,Dooley,M.,Adams,D.A.,Mortensen,M.,Dodd,P.,Craik,D.J.,Alewood,P.F.和Lewis,R.J.(1999)药物学与化学杂志，42,415～426。Nielsen,K.J.,Thomas,L.,Lewis,R.J.,Alewood,P.F.和Craik,D.J.(1996)分子与生物学杂志，263,297～310。Pallaghy,P.K.,Duggan,B.M.,Pennington,M.W.和Norton,R.S.,(1993)分子与生物学杂志，234,405～420。Pardi,A.,Billeter,M.和Wüthrich,K.(1984)分子与生物学杂志，180,741～751。Piotto,M.,Saudek,V.和Sklenar,V.(1992)生物分子NMR杂志，2,661～665。Rance,M.,Sorenson,O.W.,Bodenhauser,G.,Wagner,G.,Ernst,R.R.和Wüthrich,K.,(1983)生物化学与生物物理学研究通讯，177,479～485。Ray,N.J.,A.J.Jones和P.Keen,(1991)，英国药理学杂志，102,797～800。Rice,L.M.和Brunger,A.T.(1994)，蛋白质结构、功能和遗传，19,277～290。SarinV.K.等，分析生物化学，117,147(1981)。Sato,K.等，(1997)FEBS通讯，414,480～484。Stein,E.G.,Rice,L.M.和Brunger,A.T.(1996)磁共振杂志，124,1554～1564。Wagner,G.,Braun,W.,Havel,T.F.,Schaumann,T.,Go,N.和Wüthrich,K.(1987)分子与生物学杂志，196,611～639。Wagner,J.A.等(1998)神经科学杂志，8,3354～9。WhiteD.M.和CousinsM.J.，脑研究杂志，(1998),801,50～58。Wüthrich,K.,Billeter,M.和Braun,W.(1983)分子生物学杂志，169,949～961。在本说明书和附后的权利要求书中，除非文中另有要求，术语“包括”应被理解为包含所述整数或整数组，但不排除任何其它的整数或整数组。本领域技术人员应懂得，本文描述的本发明易于改变和修饰而不是具体描述的那样。应懂得，本发明包括所有这样的改变和修饰。本发明还单独地或集体地包括本说明书中涉及的或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何两个或多个的任一个和全部组合。序列表<110>QUEENSLAND大学<120>新型肽<130>MJC/RR<140><141><150>PP2989<151>1998-04-16<150>PP8419<151>1999-02-01<160>29<170>PatentInVer.2.0<210>1<211>6<212>PRT<213>Conuscatus<400>1SerGlyThrValGlyArg15<210>2<211>6<212>PRT<213>Conusmagus<400>2SerLysLeuMetryrAsp15<210>3<211>6<212>PRT<213>Conuscatus<220><223>人工序列的描述合成的<400>3SerArgLeuMetTyrAsp15<210>4<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>4AspArgLeuMetTyrAsp15<210>5<211>27<212>PRT<213>Conuscatus<400>5CysLysSerLysGlyAlaLysCysSerLysLeuMetTyrAspCysCys151015SerGlySerCysSerGlyThrValGlyArgCys2025<210>6<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>6CysLysSerLysGlyAlaLysCysSerArgLeuMetTyrAspCysCys151015SerGlySerCysSerGlyThrValGlyArgCys2025<210>7<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>7CysLysSerLysGlyAlaLysCysAspArgLeuMetTyrAspCysCys151015SerGlySerCysSerGlyThrValGlyArgCys2025<210>8<211>25<212>PRT<213>Conusmagus<400>8CysLysGlyLysGlyAlaLysCysSerArgLeuMetTyrAspCysCys151015ThrGlySerCysArgSerGlyLysCys2025<210>9<211>26<212>PRT<213>Conusmagus<400>9CysLysGlyLysGlyAlaProCysArgLysThrMetTyrAspCysCys151015SerGlySerCysGlyArgArgGlyLysCys2025<210>10<211>33<212>PRT<213>Conusgeographus<400>10CysLysSerHypGlySerSerCysSerHypThrSerTyrAshCysCysArg151015SerCysAsnHypTyrThrLysArgCysTyr2025<210>11<211>27<212>PRT<213>ConuscatuS<210>11<211>18<212>DNA<213>Conuscatus<400>11agcggcaccgtaggtaga18<210>12<211>382<212>DNA<213>ConuscatuS<220><221>CDS<222>(10)..(228)<400>12atcatcaaaatgaaactgacgtgtgtggtgatcgtcgccgtgctgctcctg51MetLysLeuThrCysValValIleValAlaValLeuLeuLeu1510acggcctgtcaactcatcacagctaatgactccagaggtacgcagaag99ThrAlaCysGlnLeuIleThrAlaAsnAspSerArgGlyThrGlnLys15202530catcgtgccctgaggtcggacaccaaactctccatgtcgactcgctgc147HisArgAlaLeuArgSerAspThrLysLeuSerMetSerThrArgCys354045aagagtaaaggagcaaaatgttcaaagcttatgtatgactgctgcagc195LysSerLysGlyAlaLysCysSerLysLeuMetTyrAspCysCysSer505560ggttcttgcagcggcaccgtaggtagatgtggctgatccggcgcttgatctcc248GlySerCysSerGlyThrValGlyArgCysGly6570cccttctgtgctctatccttttctgcctgagtcctccttacctgagagtggtcatgaacc308actcatcacctaccccctggaggtctcaaagaactacttgaaataaagccgcttgcaaaa368aaaaaaaaaaaaaa382<210>13<211>73<212>PRT<213>Conuscatus<400>13MetLysLeuThrCysValValIleValAlaValLeuLeuLeuThrAla151015CysGlnLeuIleThrAlaAsnAspSerArgGlyThrGlnLysHisArg202530AlaLeuArgSerAspThrLysLeuSerMetSerThrArgCysLysSer354045LysGlyAlaLysCysSerLysLeuMetTyrAspCysCysSerGlySer505560CysSerGlyThrValGlyArgCysGly6570<400>14CysArgSerLysGlyAlaLysCysSerLysLeuMetTyrAspCysCys151015SerGlySerCysSerGlyThrValGlyArgCys2025<210>12<211>27<212>PRT<213>Conuscatus<400>15CysLysSerLysGlyAlaArgCysSerLysLeuMetTyrAspCysCys151015SerGlySerCysSerGlyThrValGlyArgCys2025<210>13<211>27<212>PRT<213>Conuscatus<400>16CysLysSerLysGlyAlaGlnCysSerLysLeuMetTyrAspCysCys151015SerGlySerCysSerGlyThrValGlyArgCys2025<210>14<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>17CysLysSerLysGlyAlaLysCysSerLysLeuMetTyrAspCysCys151015SerGlySerCysSerGlyAlaValGlyArgCys2025<210>15<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>18CysLysSerLysGlyAlaLysCysAspLysLeuMetTyrAspCysCys151015SerGlySerCysSerGlyThrValGlyArgCys2025<210>16<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>19CysLysTyrLysGlyAlaLysCysSerArgLeuMetTyrAspCysCys151015SerGlySerCysSerGlyThrValGlyArgCys2025<210>17<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>20CysLysSerLysGlyAlaLysCysSerLysLeuAlaTyrAspCysCys151015SerGlySerCysSerGlyThrValGlyArgCys2025<210>18<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>21CysLysSerLysGlyAlaLysCysSerLysLeuMetTyrAspCysCys151015ThrGlySerCysSerGlyThrValGlyArgCys2025<210>19<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>22CysLysSerLysXaaAlaLysCysSerLysLeuMetTyrAspCysCys151015SerGlySerCysSerGlyThrValGlyArgCys2025<210>20<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>23CysLysSerLysGlyAlaLysCysSerLysLeuMetTyrAspCysCys151015SerGlySerCysSerGlyThrValGlyArgCysTyr2025<210>21<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>24CysLysSerLysGlyAlaLysCysSerLysLeuMetTyrAspCysCys151015SerGlySerCysSerGlyThrValGlyArgCys2025<210>22<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>25TyrCysLysSerLysGlyAlaLysCysSerLysLeuMetTyrAspCys151015CysSerGlySerCysSerGlyThrValGlyArgCys2025<210>23<211>29<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>26CysCysLysSerLysGlyAlaLysCysSerLysLeuMetTyrAsp151015CysCysSerGlySerCysSerGlyThrValGlyArgCys2025<210>24<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>27CysLysSerLysGlyAlaLysCysSerLysLeuXaaTyrAspCysCys151015SerGlySerCysSerGlyThrValGlyArgCys2025<210>25<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>28CysLysSerLysGlyAlaLysCysSerArgLeuXaaTyrAspCysCys151015SerGlySerCysSerGlyThrValGlyArgCys2025<210>26<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>29CysLysTyrLysGlyAlaLysCysSerArgLeuXaaTyrAspCysCys151015SerGlySerCysSerGlyThrValGlyArgCys2025<2l0>27<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>30CysLysSerLysGlyAlaLysCysSerLysLeuXaaTyrAspCysCys151015SerGlySerCysSerGlyThrValGlyArgCys2025<210>28<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>31CysLysSerLysGlyAlaLysCysSerLysLeuXaaTyrAspCysCys151015SerGlySerCysSerGlyThrValGlyArgCys2025<210>32<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>32CysLysSerLysGlyAlaLysCysSerLysLeuXaaTyrAspCys151015CysSerGlySerCysSerGlyThrValGlyArgCys2025<210>33<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>33AspLysLeuMetTyrAsp15<210>34<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>34SerLysLeuAlaTyrAsp15<210>35<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>35SerLysLeuXaaTyrAsp15<210>36<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>36SerArgLeuXaaTyrAsp15<210>37<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>37SerLysLeuXaaTyrAsp15<210>38<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的<400>38SerLysLeuXaaTyrAsp1权利要求1．一种分离的、合成的或重组的ω-芋螺毒素肽，其中，位于半胱氨酸残基5和6之间的第四个环包含如下氨基酸序列SGTVGR[序列1]或者这种序列，即，它已经历一个或多个氨基酸取代或者侧链修饰。2．权利要求1的分离的、合成的或重组的ω-芋螺毒素肽，其中，第四个环包含如下序列SGTVGR[序列1]或者这种序列，即，它已经历一个或多个氨基酸取代或者侧链修饰。3．权利要求1或权利要求2的分离的、合成的或重组的ω-芋螺毒素肽，其中，该ω-芋螺毒素肽的第一个、第二个和第三个环中的每一个相应于天然ω-芋螺毒素肽的环，或者这种氨基酸序列，即，它已经历一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。4．前述权利要求任一项的分离的、合成的或重组的ω-芋螺毒素肽，其中，所述氨基酸取代是保守的。5．权利要求1的分离的、合成的或重组的ω-芋螺毒素肽，其中，第二个环选自SKLMYD[序列2]，SRLMYD[序列3]，DRLMYD[序列4]，DKLMYD[序列33]，SKLAYD[序列34]，SKLNleYD[序列35]，SRLNleYD[序列36]，SKLOhmhserYD[序列37]，SKLOmserYD[序列38]，6．权利要求6的分离的、合成的或重组的ω-芋螺毒素肽，它具有如下序列CKSKGAKCSKLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列5]CKSKGAKCSRLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列6]CKSKGAKCDRLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列7]CRSKGAKCSKLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列14]CKSKGARCSKLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列15]CKSKGAQCSKLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列16]CKSKGAKCSKLMYDCCSGSCSGAVGRC[序列17]CKSKGAKCDKLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列18]CKYKGAKCSRLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列19]CKSKGAKCSKLAYDCCSGSCSGTVGRC[序列20]CKSKGAKCSKLMYDCCTGSCSGTVGRC[序列21]CKSKDalAKCSKLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列22]CKSKGAKCSKLMYDCCSGSCSGTVGRCY[序列23]CKSKGAKCSKLMYDCCSGSCSGTVGRC-OH[序列24]YCKSKGAKCSKLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列25]Ac-CKSKGAKCSKLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列26]CKSKGAKCSKLNleYDCCSGSCSGTVGRC[序列27]CKSKGAKCSRLNleYDCCSGSCSGTVGRC[序列28]CKYKGAKCSRLNleYDCCSGSCSGTVGRC[序列29]CKSKGAKCSKLOmhserYDCCSGSCSGTVGRC[序列30]CKSKGAKCSKLOmserYDCCSGSCSGTVGRC[序列31]CKSKGAKCSKLM(O)YDCCSGSCSGTVGRC[序列32]或者这种序列，即，它已经历一个或多个氨基酸取代或者侧链修饰。7．权利要求6的分离的、合成的或重组的ω-芋螺毒素肽，它具有如下序列之一CKSKGAKCSKLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列5]CRSKGAKCSKLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列14]CKSKGARCSKLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列15]CKSKGAKCSKLAYDCCSGSCSGTVGRC[序列20]CKSKGAKCSKLNleYDCCSGSCSGTVGRC[序列27]CKSKGAKCSRLNleYDCCSGSCSGTVGRC[序列28]CKSKGAKCSKLOmhserYDCCSGSCSGTVGRC[序列30]CKSKGAKCSKLOmserYDCCSGSCSGTVGRC[序列31]8．权利要求1的分离的、合成的或重组的ω-芋螺毒素肽，它具有如下序列CKSKGAKCSKLMYDCCSGSCSGTVGRC[序列5]9．前述权利要求任一项的分离的、合成的或重组的ω-芋螺毒素肽，它对N型钙通道的选择性胜过对P/Q型钙通道的选择性。10．前述权利要求任一项的分离的、合成的或重组的ω-芋螺毒素肽在测试肽或其它化合物的钙通道结合活性的受体结合测定法中的应用。11．一种分离的核酸分子，它包括编码下述序列或者与之互补的核苷酸序列编码权利要求1～9任一项的ω-芋螺毒素肽的序列。12．一种核酸探针，它包括编码下述序列或者与之互补的核苷酸序列编码权利要求1～9任一项的ω-芋螺毒素肽的全部或部分的序列，所述探针编码所述ω-芋螺毒素肽第四个环的全部或部分或者与之互补。13．一种权利要求1～9任一项的ω-芋螺毒素肽的单克隆或多克隆抗体。14．一种基因构建物，它包含载体部分和能编码权利要求1～9任一项的肽的核酸。15．一种组合物，它包含一种分离的、合成的或重组的ω-芋螺毒素肽，在所述肽中，位于半胱氨酸残基5和6之间的第四个环包含如下氨基酸序列SGTVGR[序列1]或者这种序列，即，它已经历一个或多个保守氨基酸取代，以及药物上可接受的载体或稀释剂。16．一种分离的、合成的或重组的ω-芋螺毒素肽在制备用于治疗N型钙通道的阻滞与有效治疗相关的病况的药物方面的应用，在所述肽中，位于半胱氨酸残基5和6之间的第四个环包含如下氨基酸序列SGTVGR[序列1]或者这种序列，即，它已经历一个或多个保守氨基酸取代或者侧链修饰。17．一种分离的、合成的或重组的ω-芋螺毒素肽在制备药物方面的应用，在所述肽中，位于半胱氨酸残基5和6之间的第四个环包含如下氨基酸序列SGTVGR[序列1]或者这种序列，即，它已经历一个或多个保守氨基酸取代或者侧链修饰；所述药物用于在局部缺血后神经元损伤的减轻，镇痛的产生，麻醉剂镇痛的增强，精神分裂症的治疗，或者刺激性精神病、高血压、炎症、引起支气管缩小的疾病的治疗，或者用于神经病疼痛进展的抑制。18．一种治疗N型钙通道的阻滞与有效治疗相关的病况的方法，该方法包括这样的步骤给哺乳动物施用有效量的一种分离的或重组的ω-芋螺毒素肽，在所述肽中，位于半胱氨酸残基5和6之间的第四个环包含如下氨基酸序列SGTVGR[序列1]或者这种序列，即，它已经历一个或多个保守氨基酸取代或者侧链修饰。19．一种用于下列方面的方法在局部缺血后神经元损伤的减轻，镇痛的产生，麻醉剂镇痛的增强，精神分裂症、高血压、炎症或引起支气管缩小的疾病、刺激性精神病的治疗，或者神经病疼痛进展的抑制；该方法包括这一步骤，即，给哺乳动物施用有效量的一种分离的或重组的ω-芋螺毒素肽，其中，位于半胱氨酸残基5和6之间的第四个环包含如下氨基酸序列SGTVGR[序列1]或者这种序列，即，它已经历一个或多个保守氨基酸取代或者侧链修饰。20．前述权利要求任一项的分离的、合成的或重组的ω-芋螺毒素肽在鉴定在N型VSCCs处具有活性的化合物的筛选中的应用。全文摘要一种分离的、合成的或重组的ω－芋螺毒素肽,其中,位于半胱氨酸残基5和6之间的第四个环包含序列1或者这种序列,即,它已经历一个或多个氨基酸取代或侧链修饰,及其应用。序列1包括氨基酸序列SGTVGR。文档编号A61P29/00GK1297454SQ99805103公开日2001年5月30日申请日期1999年4月16日优先权日1998年4月16日发明者R·D·德林克沃特尔,R·J·利维斯,P·F·艾尔伍德,K·J·尼尔森申请人:昆士兰大学