水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种二联活疫苗及其制备方法和应用，特别涉及一种水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗及其制备方法和应用。本发明属于兽用生物制品技术领域，
【背景技术】
[0002]水貂作为一种珍贵的皮毛动物，在世界范围内有着广泛的养殖。丹麦、中国、美国、加拿大、荷兰、俄罗斯、芬兰等都是水貂养殖大国，我国水貂养殖量位居世界第一。水貂养殖具有市场稳定、经营风险小和经济效益好等特点，具有良好的养殖前景。由于我国水貂养殖业多以小规模的家庭式分散养殖为主，饲养条件差，免疫防控不统一、不及时，加之疾病的流行造成整体生产效率低下。目前危害我国水貂养殖业的病毒性传染病主要有水貂病毒性肠炎、水貂犬瘟热和水貂阿留申病等。
[0003]水貂病毒性肠炎是由水貂病毒性肠炎病毒(MEV)引起的一种高度接触性传染病，广泛流行于世界各养貂国，是公认的危害水貂养殖业的疾病之一。该病具有较高的发病率和死亡率，3到6月龄的幼貂最易感染，死亡率高达60%。我国于1974年首次发生该病，之后在我国多地爆发性流行，发病率达83.4%，死亡率达15.1%，严重的危害了我国水貂养殖业。
[0004]水貂犬瘟热是由犬瘟热病毒(CDV)引起的一种急性、高传染性、高死亡率的疾病，广泛分布于世界各国。该病一年四季均可发病，以夏秋为多发季节，不同年龄、不同品种的水貂均易感，断乳后至3月龄的幼貂最易感染，具有较高的发病率和死亡率。我国1973年首次报道了水貂犬瘟热，以后蔓延至全国，给我国水貂养殖业造成了巨大的经济损失。2002年8月，富锦市某貂场爆发犬瘟热，发病率41.2%，死亡率97.1 % ；2002年9月，临沂市某貂场爆发犬瘟热，发病率67.9%，死亡率44% ；2004年4月，山东潍坊某貂场爆发犬瘟热，发病率50%，死亡率20%。
[0005]目前，预防水貂病毒性肠炎和水貂犬瘟热多采用疫苗接种。国内水貂病毒性肠炎疫苗均为灭活苗，犬瘟热为活疫苗，没有联苗。因此国内急需研制水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗，以达到一针防两病，提高免疫效果，节省劳动力的目的。
【发明内容】
[0006]针对现有技术存在的问题，本发明的目的之一是提供一种免疫力高、无免疫干扰的水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗，达到同时预防水貂病毒性肠炎以及水貂犬瘟热的目的。
[0007]为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段:
[0008]本发明的一种水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗，其特征在于有效成分包括水貂病毒性肠炎病毒抗原以及犬瘟热病毒抗原，其中所述的水貂病毒性肠炎病毒抗原为水貂病毒性肠炎病毒JLM株，分类命名为水貂病毒性肠炎病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研宄所，其菌种保藏编号为:CGMCC N0.9904，保藏时间为2014年10月30日；所述的犬瘟热病毒抗原为犬瘟热病毒JTM株，分类命名为犬瘟热病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研宄所，其菌种保藏编号为:CGMCC N0.9905，保藏时间为2014年10月30日。
[0009]在本发明中，优选的，每头份所述的水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗中，水貂病毒性肠炎病毒含量不低于102_ 5TCID5tl，犬瘟热病毒含量不低于102_°TCID5Q。
[0010]本发明的目的之二是提供所述的水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗在在制备预防或治疗水貂病毒性肠炎以及水貂犬瘟热中的应用。
[0011]本发明的目的之三是提供一种制备水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗的方法。
[0012]在本发明中，分别提供了三种制备水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗的方法，分别是转瓶培养方法、悬浮培养方法以及微载体悬浮培养方法。
[0013]其中，一种制备所述的水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗的转瓶培养方法，其特征在于包括以下步骤:
[0014](I)制苗用水貂病毒性肠炎病毒病毒液制备
[0015]取生长良好的CRFK细胞按MOI为0.005-0.5接种水貂病毒性肠炎病毒JLM株病毒，置37°C下培养，培养4?5日后收获病毒液，_15°C冻融I次后保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用；
[0016](2)制苗用犬瘟热病毒病毒液制备
[0017]取生长良好的Vero或MDCK单层细胞按MOI为0.005-0.5接种犬瘟热病毒JTM株病毒，置37°C下培养，培养4?5日后收获病毒液，_15°C冻融I次后保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用；
[0018](3)配苗及分装
[0019]检验合格的病毒液作为制苗用病毒液，将两种病毒抗原配比确定为每头份疫苗中水貂病毒性肠炎病毒含量不低于102_ 5TCID5tl，犬瘟热病毒含量不低于102_ tlTCID5tl，计算两种成分的配苗用量，混合均匀，用稀释液补加所需抗原剂；将水貂病毒性肠炎病毒与犬瘟热病毒病毒混合液与冻干保护剂按4:1体积比例混合均匀，即为疫苗原液，混匀后定量分装并加盖。
[0020]其中，一种制备所述的水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗的悬浮培养方法，其特征在于包括以下步骤:
[0021](I)制苗用水貂病毒性肠炎病毒病毒液的制备:取生长良好的CRFK细胞接种到细胞转瓶中，置37°C培养48?72小时，控制转速为8?12转/小时；当细胞长成致密单层时用0.25%胰酶消化成单个细胞并计数，按0.8 X 15?1.2 X 10 5个/ml细胞密度将细胞接入一级生物反应器中培养48?72小时，当细胞密度不低于2 X 16个/ml时，按照同样条件将细胞转移至二级生物反应器中培养48?72小时，当细胞密度达到2 X 16个/ml时，以MOI为0.005-0.5接种水貂病毒性肠炎病毒生产毒种JLM株，在37°C、40?60r/min、pH值7.2、溶氧50%的条件下培养36?48小时，收获病毒液，置_15°C以下保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用；
[0022](2)制苗用犬瘟热病毒病毒液的制备:取生长良好的Vero或MDCK细胞接种到细胞转瓶中，置37°C培养48?72小时，控制转速为8?12转/小时；当细胞长成致密单层时用0.25%胰酶消化成单个细胞并计数，按0.8 X 15?1.2 X 10 5个/ml细胞密度将细胞接入一级生物反应器中培养48?72小时，当细胞密度不低于2 X 16个/ml时，按照同样条件将细胞转移至二级生物反应器中培养48?72小时，当细胞密度达到2 X 16个/ml时，以MOI为0.005-0.5接种犬瘟热病毒生产毒种JTM株，在37°C、40?60r/min、pH值7.2、溶氧50%的条件下培养36?48小时，收获病毒液，置_15°C以下保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用；
[0023](3)配苗及分装
[0024]检验合格的病毒液作为制苗用病毒液，将两种病毒抗原配比确定为每头份疫苗中水貂病毒性肠炎病毒含量不低于102_ 5TCID5tl，犬瘟热病毒含量不低于102_ tlTCID5tl，计算两种成分的配苗用量，混合均匀，用稀释液补加所需抗原剂；将MEV与CDV病毒混合液与冻干保护剂按4:1体积比例混合均匀，即为疫苗原液，混匀后定量分装并加盖。
[0025]其中，一种制备所述的水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗的微载体悬浮培养方法，其特征在于包括以下步骤:
[0026](I)制苗用水貂病毒性肠炎病毒病毒液的制备:取生长良好的CRFK细胞接种到细胞转瓶中，置37°C培养48?72小时，控制转速为8?12转/小时；当细胞长成致密单层时用0.25%胰酶消化成单个细胞并计数，按0.8 X 15?1.2 X 10 5个/ml细胞密度将细胞接入一级生物反应器中，每升含微载体5g，培养48?72小时，当细胞密度不低于2 X 16个/ml时，按照同样条件将细胞转移至二级生物反应器中，每升含微载体5g，培养48?72小时，当细胞密度达到2 X 16个/ml时，以MOI为0.005-0.5接种水貂病毒性肠炎病毒生产毒种JLM株，在37°C、40?60r/min、pH值7.2、溶氧50%的条件下培养36?48小时，收获病毒液，置_15°C以下保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用；
[0027](2)制苗用犬瘟热病毒病毒液的制备:取生长良好的Vero或MDCK细胞接种到细胞转瓶中，置37°C培养48?72小时，控制转速为8?12转/小时；当细胞长成致密单层时用0.25%胰酶消化成单个细胞并计数，按0.8 X 15?1.2 X 10 5个/ml细胞密度将细胞接入一级生物反应器中，每升含微载体5g，培养48?72小时。当细胞密度不低于2 X 16个/ml时，按照同样条件将细胞转移至二级生物反应器中，每升含微载体5g，培养48?72小时，当细胞密度达到2 X 16个/ml时，以MOI为0.005-0.5接种犬瘟热病毒生产毒种JTM株，在37°C、40?60r/min、pH值7.2、溶氧50%的条件下培养36?48小时，收获病毒液，置-15°C以下保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用；
[0028](3)配苗及分装
[0029]检验合格的病毒液作为制苗用病毒液，将两种病毒抗原配比确定为每头份疫苗中水貂病毒性肠炎病毒含量不低于102_ 5TCID5tl，犬瘟热病毒含量不低于102_ tlTCID5tl，计算两种成分的配苗用量，混合均匀，用稀释液补加所需抗原剂；将MEV与CDV病毒混合液与冻干保护剂按4:1体积比例混合均匀，即为疫苗原液，混匀后定量分装并加盖。
[0030]在水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗的研发过程中，我们发现水貂病毒性肠炎病毒JLM株与水紹犬瘟热病毒JTM株均具有优良的安全性和免疫原性，两者同时免疫