一种双重原位杂化制备的具有磁响应性多重梯度载药微球的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种根据双重原位杂化原理和纳米自组装技术研制的多重梯度载药复合微球及其制备方法。
【背景技术】
[0002]因肿瘤、结核、外伤和代谢性骨病等原因造成的骨缺损的修复，一直是生物医药领域的难题之一。目前常用的异体骨移植、自体骨移植等方法在不同程度上存在一些问题。如自体骨来源极为有限，不能用于大面积骨缺损；异体骨存在免疫排斥反应，且可能造成病原体感染。近年来，随着生物医学工程的发展，药物释放体系作为一种优良的骨修复材料越来越受到人们的重视。作为药物释放体系的重要组成部分，理想的药物载体包括下面几个特点:(I)优良的生物相容性、亲水性和生物降解性，并且降解产物无毒无害，可迅速排出体夕卜。(2)良好的药物负载能力和缓释能力。药物负载量大可以减少药物摄入次数和输送损失，缓释性能的好坏直接影响到药物释放的浓度和释放稳定性。(3)载体材料来源广泛，制备简单，具备靶向输送能力，对磁、电等物理信号响应，具备定向输送能力。
[0003]磁场通过影响电荷微粒的运动、膜系统的通透性和生物高分子的磁矩取向等，从而使细胞的过程发生变化。研宄发现，黏附有磁性粒子的整合素和内化磁性粒子的机械刺激，能诱导细胞内钙信号的改变，进而促进细胞的增殖。结合电磁场的这种功能，利用双重原位杂化的原理将铁盐和亚铁盐原位生成超顺磁Fe3O4,作为复合微球的原料之一。该方法相较于水热合成法，反应条件更加温和，有效降低有机与无机界面的界面能，引导纳米四氧化三铁在有机基质上原位结晶，使得纳米颗粒分散更加均匀。采用同样的原理，再次运用原位杂化法由外到内逐层形成多梯度的纳米羟基磷灰石，通过有机基质与无机物离子在界面处的相互作用，从分子水平调控无机矿物相的析出，从而使无机相具有特殊的多级结构和组装方式。有机基质对无机物纳米羟基磷灰石和纳米四氧化三铁的结晶起到模板作用，利用两者之间的晶格匹配、静电作用、立体化学互补以及空间定位作用，引导纳米羟基磷灰石和纳米四氧化三铁在有机基质上原位结晶形成均匀分散的纳米颗粒，使无机矿物具有一定的形状、尺寸、取向和结构。
[0004]壳聚糖作为一种带正电荷的天然聚多糖，其结构与细胞外基质的主要成分一糖胺聚糖十分类似，优良的生物相容性、亲水性和生物降解性，并且降解产物无毒无害，可迅速排出体外，能促进伤口愈合和骨组织的形成。国内外将中药与生物材料的结合，应用于骨组织修复领域的研宄尚处于初步阶段。淫羊藿是一味传统的具有补肾壮阳、防治骨质疏松的中药，其黄酮类化合物的主体成分-淫羊藿苷，对骨质疏松起到良好的拮抗作用，可作为一种新型成骨诱导活性因子用于骨再生研宄。磁性材料与中药-淫羊藿苷的联合使用，不仅能改良中药剂型，增强中药疗效，而且可以弥补传统中药的不足。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种双重原位杂化制备的多重梯度载药复合微球及其制备方法，根据双重原位杂化原理和纳米自组装技术研制一种纳米粒均匀分散，生物磁响应性良好，以及具有控缓释能力的多梯度载药微球。该方法的制备程序简单，工艺条件温和，成本较低，生物相容性和生物可降解性能良好，独特的生物磁力导向性以及多重梯度性使得药物的控制缓释的能力明显增强。
[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种双重原位杂化制备的多重梯度载药复合微球及其制备方法，根据双重原位杂化原理和纳米自组装技术，以壳聚糖为有机基体，铁盐-亚铁盐为无机相Fe3O4的先躯物，钙-磷盐溶液为无机相羟基磷灰石的前驱体；含中药-淫羊藿苷的壳聚糖溶液，首先与铁盐、亚铁盐充分混合均匀，再与可溶性钙盐均匀混合，通过高压静电微囊成型装置，将其逐滴喷入含有可溶性磷酸盐的碱液中，模仿生物矿化采取有机大分子调控无机相生长的方式，在有机基质上双重原位杂化成核结晶，洗涤冷冻干燥，制备一种多重梯度载药微球。
[0007]所述的制备方法的具体步骤如下:
步骤一:微球前驱体混合液的制备
(1)将淫羊藿苷溶解于无水乙醇中，壳聚糖溶解于体积分数为I?2%的乙酸溶液中，磁力搅拌下，往壳聚糖的乙酸溶液中加入淫羊藿苷的醇溶液，搅拌使各组分混合均匀；
(2)按四氧化三铁的化学计量比n(Fe3+):n( Fe2+) =2: 1，向(I)得到的混合液中依次加入浓度为0.1?0.3mol/L的可溶性铁盐溶液，浓度为0.05?0.15mol/L的可溶性亚铁盐溶液；
(3)配制1.5?3mol/L可溶性钙盐溶液，将其加入到(2)得到的混合液中，持续搅拌使其充分混合均匀，得到微球前驱体混合液；最终混合液中壳聚糖的质量百分比为2?4% ;淫羊藿苷的质量百分比为0.03?0.08% ;杂化形成的Fe3O4的理论百分比为2?4% ；
步骤二:凝胶浴的制备
(1)配制I?3mo I/L KOH或NaOH的乙醇/水溶液，其中乙醇与水的体积比为I?
2:1 ；
(2)配制0.6?1.8mol/L的可溶性磷酸盐溶液，使最终体系中钙-磷摩尔比为1.67:1 ；
(3)将上述(1)、(2)的物料以不同的配比混合得到不同浓度的混合物，即凝胶浴； 步骤三:多重梯度载药微球的成型
(1)利用高压静电微囊成型装置，将步骤一所制备的混合液逐滴喷入步骤二所制备的凝胶浴中成型，然后置于37°C摇床中摇晃8?12 h，双重原位杂化，使其充分结晶；
(2)将成型的微球用去离子水反复浸洗至中性，-10°C?_80°C超低温冰箱冷冻后，再转入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，即获得一种双重原位杂化制备的具有磁响应性的多重梯度载药微球。
[0008]所述可溶性铁盐是氯化铁、硝酸铁或硫酸铁，可溶性亚铁盐是氯化亚铁、硫酸亚铁中的一种或几种；
所述钙盐为硝酸钙或氯化钙；所述的磷酸盐为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的一种或几种。
[0009]最终Ca/P前驱体溶液理论形成HAP量为3?5%。
[0010]本发明的显著优点在于:壳聚糖是一种含有大量氨基的天然阳离子多糖，该有机基体中含有的羧基、羟基和氨基等基团不仅可促进细胞的粘附和生长，而且是无机相四氧化三铁和羟基磷灰石的成核位点。本发明正是利用这些基团在有机基体上有规律的分布，双重原位杂化和纳米自组装技术，诱导纳米四氧化三铁和纳米羟基磷灰石的成核结晶，从而制备出纳米颗粒高度分散、独特的生物磁力导向性以及多重梯度性的具有良好的控缓释的能力的载药复合微球。本发明根据双重原位杂化原理以及纳米自组装技术，制备程序简单，工艺条件温和，生物相容性和生物可降解性能良好。
[0011]制备所得的微球相对于其他复合微球有以下优点:
(1)该复合微球独特的表面性能(比表面积大、表面能高、表面粗糙度及表面润湿性增加)有利于生长因子的吸附，促进细胞的粘附、增殖、分化；
(2)根据双重原位杂化原理以及纳米自组装技术研制一种纳米颗粒高度分散、生物磁性导向性良好的控缓释载药微球，由于微球结构的多梯度性，药物控缓释的能力明显增强；
(3)采用乳鼠成骨细胞建立复合微球材料的体外评价模型，结果表明该材料细胞相容性好；
(4)该纳米复合微球的制备程序简单，工艺条件温和，操作简便，成本较低。
【附图说明】
[0012]图1是一种双重原位杂化制备的具有磁响应性的多重梯度载药微球的扫描电子显微镜图。
[0013]图2是一种双重原位杂化制备的具有磁响应性的多重梯度载药微球的X射线衍射图。
[0014]图3是一种双重原位杂化制备的具有磁响应性的多重梯度载药微球的降解曲线图。
[0015]图4是一种双重原位杂化制备的具有磁响应性的多重梯度载药微球与乳鼠成骨细胞体外复合培养的MTT图。
[0016]图5-6是一种双重原位杂化制备的具有磁响应性的多重梯度载药微球的对照组与乳鼠成骨细胞体外复合培养第3，5天的AO/EB染色图。
[0017]图7-8是一种双重原位杂化制备的具有磁响应性的多重梯度载药微球与乳鼠成骨细胞体外复合培养第3，5天的AO/EB染色图。
【具体实施方式】
[0018]实施例1
(1)将淫羊藿苷溶解于无水乙醇中，壳聚糖溶解于体积分数为1%的乙酸溶液中，磁力搅拌下，往壳聚糖的乙酸溶液中加入淫羊藿苷的醇溶液，搅拌使各组分混合均匀，按质量百分比计算壳聚糖、淫羊藿苷的含量分别为2%、0.05% ;
(2)按照η(Fe3+):n( Fe2+) =2:1的比例将一定量的可溶性铁盐，可溶性亚铁盐分别加入到上述混合液中，两者分别持续搅拌30min，理论形成的Fe3O4质量配比为2% ;
(3)配制1.5mol/L可溶性钙盐溶液，将其加入到(2)得到的混合液中，持续搅拌使其充分混合均匀，得到微球前驱体混合液； (4)配制0.5mol/L NaOH的乙醇/水溶液，其中乙醇与水的体积比为I?2: 1，并配制1.8mol/L的可溶性磷酸盐溶液，使最终体系中钙-磷摩尔比为1.67:1 ;将上述物料以不同的配比混合得到不同浓度的混合物，即凝胶浴；
(5)利用高压静电微囊成型装置，将步骤(3)所制备的混合液逐滴喷入步骤(4)所制备的凝胶浴中成型，然后置于37°C摇床中摇晃8 h，双重原位杂化，使其充分结晶；
(6)将成型的微球用去离