衍生肽的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P16im4a的特定片段以及所述片段用 于免疫针对表达Ρ16ΙΝΚ4Μ^肿瘤的个体的用途。
【背景技术】
[0002] 每年全世界有几百万人罹患癌，并且死于癌。尽管强化治疗研宄，但这些死亡率 已经多年保持未变。迄今为止，患有癌的患者经常不得不经历癌去除手术或化学治疗或 放射治疗。然而，这伴随着非常巨大的副作用，所述副作用然后促成患有癌的患者的死 亡率。有趣地，人乳头瘤病毒（HPV)与所有癌症中超过5%的癌症的形成相关（Parkin 和Bray，2006)。预防性HPV接种已经为可用的，但在已经被感染的人中未示出治疗效果 (Hildesheim等人，2007)。因此，存在对新型治疗方案的需要。
【发明内容】
[0003] 因此，本发明的目的为提供用于治疗和预防HPV-相关的肿瘤和其它表达pl6INK4a 的肿瘤的手段。
[0004] 根据本发明，这通过权利要求中限定的主题来实现。源自观察产生本发明的研宄： 当由于负反馈环被HPV致癌基因产物E7破坏而细胞实现转化的且可能为恶性表型时，细胞 蛋白pl6? 4在HPV感染的细胞中表达（Sano等人，1998 ;Klaes等人，2001)。因此，？16"^在 几乎所有HPV-诱导的癌和高度瘤形成前，包括宫颈肿瘤、外阴肿瘤、阴道肿瘤、阴茎肿瘤、 肛门肿瘤以及头颈肿瘤中强烈表达（Ishikawa等人，2006 ;Samama等人，2006 ;Missaoui等 人，2006 ;Santos 等人，2006 ;Roma 等人，2008 ;Hafkamp 等人，2003)。在生理条件下，pl6?4 仅在经历随后衰老的细胞中表达，因此，几乎未在正常组织中发现表达（BeauMjour等人， 2007)。除HPV-致癌基因驱使HPV-相关的肿瘤中的？16^^表达之外，也发现pl6 INK4a在与 HPV感染无关的各种肿瘤或在已经发现HPV但未证明病毒致癌作用的肿瘤中过表达，其包 括一部分黑素瘤和非黑素瘤皮肤癌（Nindl等人，2004 ;Busch等人，2010)、肺癌（Leversha 等人，2003 ;Esposito等人，2004)、食道癌、胃癌和结肠直肠癌（Ding等人，2010 ;Kim等人， 2005)以及肾癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫内膜癌和乳腺癌（Ikuerowo等人2007;Buza等人， 2010 ;Giordano 等人，2008 ;Giordano 等人，2007 ;di Vinci 等人，2005)。已知视网膜母细 胞瘤抑制基因的突变导致pl6INK4a的表达上调（Okamoto等人，1994)。然而，在这些情况下 强的pl6INK4a表达的潜在机制最可能是更异种的并且最终不能被理解。
[0005] 很久以来，癌细胞中内源性基因产物的过表达已被认为是肿瘤相关抗原的有价值 的来源。针对此类抗原的免疫响应已经在各种癌症患者中观察到并且已经在免疫治疗试验 中有所增加（犯ger 等人，2003;Finn，2008;Rescigno 等人，2007)。
[0006] 在形成本发明的实验期间，可证明从健康个体的外周血样品分离的T淋巴细胞可 在体外用Pie1ffi4a衍生肽特异性刺激以及来自宫颈癌患者的CD4+和CD8+T细胞对相同的 pl6INK4^^示出自发反应性并且产生细胞毒性T细胞系和宫颈癌细胞系，所述细胞毒性T细 胞系能够攻击并杀死共培养的HLA匹配的负载有pl6Iffi4a的细胞。换言之，pl6 Iffi4的片段具 有高度免疫原性，从而诱导针对pl6INK4的非常强的免疫响应。此外，已经证明也可检测针对 pl6INK4a的体液免疫响应。
[0007] P16INK4的所述表达模式以及针对pl6INK4的与任何自身免疫疾病不相关的自发免疫 响应的发现使P16 INK4成为用于免疫具有表达pl6 INK4a的癌症的患者的有前景的候选者。针 对Pie1ffi4的活性诱导的强免疫响应可特异性破坏HPV转化的细胞和其它表达P16 °*^的癌 细胞。具有这些P16INK4肽的供体T细胞的接种在细胞培养实验中进行。使用pl6INK4肽的另 外的实验揭示宫颈癌患者中的自发的T细胞响应，证实特定的pl6 INK4肽在体内也为免疫原 性的。因此，使用这些肽基于免疫的癌症的预防或治疗应对患者具有若干益处。Pie 1ffi4在 所有HPV-相关的癌症（不论HPV类型）以及各种其它癌症类型中强烈表达。pl6INK4免疫 的严重的副作用是未预期的，因为pl6 INK4在正常组织中几乎不表达并且在具有针对pl6 Iffi4 的自发的免疫响应的个体中未观察到自身免疫现象。最后，由于抗原损失的免疫逃避是非 常不同的，因为Pie1ffi4表达与肿瘤细胞的恶性表型复杂地相关。
【附图说明】
[0008] 图1 :用Die?1"肽刺激供体T细朐之前（A)和之后（B)的ELISD〇t(干扰素 γ)结 是
[0009] 斑点计数通过减去在不含肽的孔中的背景斑点检测而标准化。在B中用肽 pl6INK4a_37-63、pl6INK4a_51-80和pl6INK4a_73-104刺激的细胞中增加的斑点计数与第 0天相比变得清晰。CEF = CMV，EBV，流感（flu)肽混合物阳性对照。
[0010] 图2 :在针对阳件对照病毒混合物（CEF)以及针对七备30聚体Dieagia肽的23名 患者（Tx和Fx)和15名健康对照（BCx)中的ELISpot (干扰素 γ )结果（表1)
[0011] 结果为调整后的背景并且仅考虑了截断值之上的斑点（阴性对照孔中的两倍斑 点+针对各个pl6 INK41i^反应性的两个标准差）。两名个体具有CD4 +响应，剩余的个体具 有⑶8+响应。na=未分析的。
[0012] 图3 :铬释放测宙
[0013] 来自宫颈癌患者的CD8T细胞（HLA A2A3B7B15Cw3Cw7)诱导HLA匹配的负载有 pl6INK4a_37-63的B细胞（黑方块）裂解但不诱导不含pl6Iffi4^^的相同B细胞裂解（空 心三角形）。宫颈癌细胞系他1^(口16 1_3+、!11^六68、815、895、〇￥7〇￥12)和〇&81^(口161· 43+、 HLA A2、A3、B7、B37、Cw5、Cw7)裂解同时未检测到 ME180 和 K562 裂解。
[0014] 图4 :在用七种pl6INK4a肽（表1)刺激之后来自具有宮颈非典塑增牛的妇女的 外周血单核细朐的增葙
[0015] 示出了在用pl6INK4a肽、阳性对照（促分裂原PHA和破伤风类毒素）和阴性对照 (无抗原）孵育PBMC之后进行的BrdU增殖测定的光密度。虚线指示阳性响应的截断值。 星号指示诱导增殖的pl6INK4a肽。示出了来自三名发生反应的患者以及一名阴性患者的 结果。
[0016] 图5 :蛋白质印迹中的血清学Dielffife反应件
[0017] (a)⑴纯化的His-标签的pl6Iffi4a的银染色。（2)具有单克隆pl6 INK4a抗体E6H4 的纯化的His-标签的pl6INKl9蛋白质印迹。
[0018] (b)示出了 6个代表性阳性血清。蛋白大小对应于单克隆抗体（E6H4)针对重组蛋 白的反应。
[0019] (C)阴性血清的实例（1和2)。
[0020] ⑷在血清与重组pl6INK4a?孵育之前⑴和之后的（2)pl6 Iffi4a血清反应性。
【具体实施方式】
[0021] 因此，本发明涉及能够诱导针对Pie1ffi4a的免疫响应的细胞周期蛋白依赖性激酶抑 制剂pl6Ink4的特定片段。免疫响应被定义为满足以下标准中的至少一种的状态：1. CD8-阳 性T细胞的诱导，如通过细胞毒性测定或IFN- γ分泌或穿孔素表达或颗粒酶B表达或可以 由⑶8-阳性T细胞产生的其它细胞因子可检测的，通过ELISpot或细胞内细胞因子染色或 细胞因子ELISA或等同方法如上背景可测量的。2.⑶4-阳性T细胞的诱导，如通过细胞因 子分泌可检测的，通过ELISpot或细胞内细胞因子染色或细胞因子ELISA或等价方法如上 背景可测量的。细胞因子可以包括 I