复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制品领域，具体地，涉及一种复合Τβ 4的胶原-壳聚糖组织工程 支架及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 由于糖尿病患者机体的组织细胞长时间处于高糖环境，使局部皮肤组织细胞、蛋 白质等被糖基化，引起血管内皮功能异常，反应受损；巨嗜细胞的功能减弱，炎症反应延长 失衡；生长因子缺乏或者受损，胶原组织的减少、表皮屏障功能的失调，以及肉芽组织的减 少等，导致溃疡难以修复。且治疗糖尿病引起的皮肤难愈合创面的研宄仍未取得重大突破。
[0003] 以胶原和壳聚糖两种高分子生物为基础的胶原-壳聚糖组织工程支架是运用多 学科的方法和手段制备的一种较为完善的工程化组织，是能够恢复、保持或改善皮肤功能 的皮肤替代品，它可以模拟细胞外基质，构建组织再生的框架，支架的形态和微观结构直接 影响细胞的粘附、生长、迀移、增殖和代谢功能，最终使组织得以重建，完成创面的修复与再 生。但是，其治疗糖尿病皮肤难愈合创面的效率较低，不利于促进皮肤难愈合创面的修复进 程与皮肤附件的再生。
[0004] 生长因子可以作为调节细胞行为的重要营养物质，应用于组织工程皮肤支架中。 作为一种多功能的生长因子，胸腺素 β 4 (以下简称为T β 4)在促进创伤愈合方面是通过多 种途径来实现的。Τβ 4是存在于真核细胞中的一种肌动蛋白螯合分子，在机体内广泛分布， 具有调节多种生长因子的表达以及趋化新生细胞迀移的特性，在皮肤的创伤愈合过程中， Τβ 4可以刺激内皮细胞迀移，促进血管形成；调节某些炎症介质表达，抑制炎症反应；促进 角质细胞迀移进而加速创面再上皮化；与纤维蛋白和胶原交联，促进胶原纤维重排与基底 膜重建。
[0005] 随着难愈合创面研宄的进一步深入，T β 4的独特作用使它在难愈合创面研宄上有 了逐步发展，但如何安全、稳定、快速、高效地将T β 4运用在皮肤难愈合创面的修复与再生 上，仍是亟需解决的难题。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了克服现有技术中的上述缺陷，提供一种复合T β 4的胶原-壳 聚糖组织工程支架及其制备方法和应用，该复合T β 4的胶原-壳聚糖组织工程支架能够明 显有效地促进糖尿病等皮肤难愈合创面的再生、重构、修复与愈合。
[0007] 因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种复合T β 4的胶原-壳聚糖 组织工程支架的制备方法，该方法包括：制备胶原-壳聚糖多孔支架，并将胶原-壳聚糖多 孔支架浸泡在T β 4溶液中，得到复合T β 4的胶原-壳聚糖多孔支架；然后将复合T β 4的 胶原-壳聚糖多孔支架依次进行化学交联处理和冷冻干燥处理。
[0008] 第二方面，本发明提供了上述方法制备得到的复合T β 4的胶原-壳聚糖组织工程 支架。
[0009] 第三方面，本发明提供了复合T β 4的胶原-壳聚糖组织工程支架在制备皮肤替代 品中的应用。
[0010] 本发明的复合Τβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架具有以下有益效果：
[0011] (1)本发明的复合Τβ 4的胶原-壳聚糖组织工程支架为治疗难愈合创面并加快 其再生程度提供了有效手段，适用于难愈合创面的高效安全愈合。该支架在炎症期（即皮 肤损伤后第1-4天）的Τβ 4累积释放率高达70%，且之后以稳定的速度持续缓慢的释放 T β 4,并在损伤后12天T β 4的累积释放率高达96%，能够明显促进皮肤损伤部位的完美再 生。
[0012] (2)该支架拥有合理的孔径、孔隙和三维多孔结构和优良的生物降解率和溶胀属 性，在体内可以较好的模拟正常皮肤微环境，有利于细胞增生迀移以及生长因子的浸润，可 以有效促进损伤部位移植后的快速血管新生及再上皮化，促进难愈创面修复再生，提高移 植效率。
[0013] (3)该支架可以有效抑制损伤部位的炎症反应，促进损伤皮肤生成毛囊等附属结 构，从而使损伤部位皮肤结构和功能趋于正常化。
[0014] (4)该支架可以应用于糖尿病溃疡、严重创伤、烧伤患者等缺乏可供移植的自体皮 肤，以及创面修复困难、严重影响肢体功能的难愈慢性创面，为促进皮肤创面愈合，解决移 植皮源问题提供了新的出路。
[0015] (5)该支架揭示了糖尿病等皮肤难愈合损伤部位治疗的新的作用机制，为糖尿病 皮肤损伤的治疗提供新思路，也可以作为体外皮肤模型进行一些相关的基础医学领域比如 皮肤生理学及皮肤病理学方面的研宄。
[0016] 本发明的其它特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0017] 图1显示的是本发明的胶原-壳聚糖多孔支架的特性，其中，㈧为胶原-壳聚糖 多孔支架的肉眼直观图片，（B)、（C)、(D)分别为扫描电镜（200Χ倍数）下的实施例6、1和 7的胶原-壳聚糖多孔支架的显微图片。
[0018] 图2-4显示的是糖尿病皮肤损伤部位的大体观察及组织学评估情况。其中，图2 和图3分别为将实施例1的复合T β 4的胶原-壳聚糖组织工程支架和对比例1的支架移 植于糖尿病皮肤损伤部位后21天内的皮肤愈合情况图和伤口面积比率，图4为将实施例1 的复合T β 4的胶原-壳聚糖组织工程支架和对比例1的支架移植于糖尿病皮肤损伤部位 后第21天的组织学观察图。
【具体实施方式】
[0019] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0020] 第一方面，本发明提供了一种复合T β 4的胶原-壳聚糖组织工程支架的制备方 法，该方法包括：制备胶原-壳聚糖多孔支架，并将胶原-壳聚糖多孔支架浸泡在T β 4溶液 中，得到复合T β 4的胶原-壳聚糖多孔支架；然后将复合T β 4的胶原-壳聚糖多孔支架依 次进行化学交联处理和冷冻干燥处理。
[0021] 本发明的制备方法中，对于制备胶原-壳聚糖多孔支架的方法没有特别的限定， 可以为本领域常用的各种制备方法。但是，本发明的发明人在研宄中发现，在制备胶原-壳 聚糖多孔支架时，控制胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的特定的浓度和胶原-壳聚糖溶 液的PH值对包被的T β 4的累积释放率有影响，因此，为了进一步提高制得的复合T β 4的 胶原-壳聚糖组织工程支架的T β 4累积释放率，优选情况下，制备胶原-壳聚糖多孔支架 的方法包括：配制胶原-壳聚糖溶液，使得胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的浓度均为 l-5mg/mL，进一步优选均为2-3mg/mL ;然后将胶原-壳聚糖溶液的pH值调节为6-7,进一步 优选为6. 2-6. 4 ;再将胶原-壳聚糖溶液真空脱泡后注入模具中依次进行孵育处理和冷冻 干燥处理。更进一步优选地，胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的浓度比为1:1。
[0022] 本发明的制备方法中，对于配制胶原-壳聚糖溶液的溶剂没有特别的限定，可以 为本领域常用的各种溶剂，优选情况下，所述溶剂为醋酸溶液，即，胶原-壳聚糖溶液为胶 原-壳聚糖的醋酸溶液，进一步优选地，醋酸溶液中醋酸的浓度为〇. 01-lmol/L。
[0023] 本发明的制备方法中，对于配制胶原-壳聚糖溶液的方法没有特别的限定，只要 能够配制得到前述特定浓度的胶原-壳聚糖溶液即可，例如可以包括：分别将胶原粉末和 壳聚糖粉末溶解于醋酸溶液中，配制2-10mg/mL优选3-7mg/mL的胶原溶液和2-10mg/mL优 选3-7mg/mL的壳聚糖溶液，然后以适当的体积比例将两种溶液混合。
[0024] 本发明的制备方法中，在制备胶原-壳聚糖多孔支架时，优选情况下，孵育处理的 条件包括：温度为30-38°C，时间为25-40min。
[0025] 本发明的制备方法中，在制备胶原-壳聚糖多孔支架时，优选情况下，冷冻干燥处 理为先进行冷冻处理再进行干燥处理，冷冻处理的条件包括：温度为-70~-90°C，时间为 18-30h ;干燥处理的条件包括：温度为-70~-90°C，时间为8-18h。
[0026] 本发明的制备方法中，为了进一步提高制得的复合T β 4的胶原-壳聚糖组织工 程支架的T β 4累积释放率，优选情况下，T β 4溶液的浓度为10-60ng/mL，进一步优选为 25-35ng/mL〇
[0027] 本发明的制备方法中，为了进一步提高制得的复合TM的胶原-壳聚糖组织工程 支架的T β 4累积释放率，优选情况下，浸泡的条件包括：温度为0-4°C，时间为18-30h。
[0028] 本发明的制备方法中，优选情况下，化学交联处理的条件包括：将复