包含单一可变域和甲磺酸卡莫司他(cm)的组合物的制作方法
【专利说明】包含单一可变域和甲磺酸卡莫司他（CM)的组合物
【背景技术】
[0001] 绝大多数生物药物（尤其是治疗性抗体及其片段）通过胃肠外途径（例如静脉或 皮下注射）进行给药。这些给药途径通常是不方便且痛苦的，这降低了患者的顺应性，尤其 是当需要每日多次注射时。对于保健医疗提供者而言，在工作人员的时间、储存和设备方 面，这些生物药物也是花费巨大的。
[0002] 口服给药生物药物将克服许多的这些缺点，但也具有其自身的问题。具体地，这些 分子易在胃和肠的蛋白酶富集的环境中发生蛋白降解。
[0003] 重点是，对治疗胃肠（GI)道疾病的口服药物存在需求。尤其是对以低剂量使用的 药物存在需求，以降低系统毒性的风险。
[0004] 因此，迫切地需要稳定蛋白以便使它们抵御胃肠道的蛋白酶富集的环境，从而促 成成功口服给药生物药物。
[0005] 发明概沐
[0006] 本发明提供了组合物（任选地药物组合物），其包含甲磺酸卡莫司他（camostat mesylate)和单一可变域。
[0007] 提供了用作药物的本发明的组合物。还提供了本发明的组合物在制备药物中的用 途。尤其是所述组合物是口服给药的。
[0008] 本发明提供了治疗胃肠道病症的方法，其包括以下步骤：向有此需要的患者给药 (任选地口服给药）本发明的组合物。
[0009] 本发明还提供了稳定在蛋白酶富集的溶液中的单一可变域的方法，其包括将该单 一可变域配制于包含甲磺酸卡莫司他的组合物中，在该组合物暴露于蛋白酶富集的溶液之 刖。
【附图说明】
[0010] 图1显示了在模拟肠液（SIF)中培养的一组具有不同转变中点（transition midpoint) (Tm)的 dAb(TM)的半衰期。
[0011] 图2显示了在SIF中培养的一组高Tm的dAb(TM)的半衰期。
[0012] 图3显示了在存在或不存在CM的模拟肠液（SIF)中培养的一组具有不同转变中 点（Tm)的dAb(TM)的半衰期。
[0013] 图4显示了在存在或不存在CM的SIF中培养的一组高Tm的dAb(TM)的半衰期。
[0014] 图5显示了具有相同的预期胰蛋白酶切割位点但是不同Tm的两个dAb(TM)的半衰 期。将该dAb(TM)用存在和不存在CM时的胰蛋白酶培养。
[0015] 图6显示了在不存在（a)和存在（b)CM的十二指肠内给药后的不同时间点，从肠 组织回收的dAb(TM)D0M101的量。结果表示为纳克/克组织。
[0016] 图7显示了在存在和不存在CM的结肠内给药后，从大肠回收的dAb(tm)D0M101的 量。结果表示为纳克/克组织。
[0017] 发明详沐
[0018] 本发明提供了对上述问题的解决方法。本发明提供了稳定单一可变域的方法。提 供了包含单一可变域和甲磺酸卡莫司他的组合物（尤其是药物组合物），以及所述组合物 作为药物和在治疗方法中的用途。本文的实施例表明，甲磺酸卡莫司他（CM)可用于在禁食 的模拟肠液以及在小肠和大肠中稳定单一可变域（例如域抗体(TM)或dAb (TM))，并因此支持 了 CM在口服递送生物药物以局部治疗GI病症（例如克罗恩病或溃疡性结肠炎）以及直接 作用于肠黏膜免疫系统中的用途。
[0019] 甲磺酸卡莫司他（CAS号：59721-29-8)的化学名为4-[[4_[(氨基亚氨基甲基） 氨基]苯甲酰基]氧基]苯乙酸2-(二甲基氨基）-2-氧代乙基酯甲磺酸盐且其可从例 如Sequoia Research Products获得。甲磺酸卡莫司他（CM)是有口服活性的丝氨酸蛋 白酶抑制剂，其在日本和韩国被批准用于治疗胰腺炎和术后食道反流（Foipan Product information sheet ；Takasugi 等人，Digestion 1982,24:36 - 41 ;Kono 等人，Am J Surg. 2005S印，190(3) :412-7)。CM具有广谱抑制，包括胰蛋白酶、凝血酶、激肽释放酶和纤 溶酶（Tamura 等人，1977, Biochimica et Biophysica Acta 484,417 - 422)。CM 在肠内的 代谢尚不明确，但是CM的代谢产物GBPA本身是有活性的（Beckh等人，Res Exp Med，1987， 187:401-406)。
[0020] 术语"单一可变域"是指折叠的多肽域，其包含以抗体可变域为特征的序列。因此， 其包括完整的抗体可变域（例如VH、VHH和VL)和经修饰的抗体可变域（例如，抗体可变域 中的一个或多个环被不是以抗体可变域为特征的序列代替，或者抗体可变域已被截短或包 含N-或C-端延长），以及可变域片段，其至少保留了全长结构域的结合活性和特异性。单 一可变域能够独立地结合不同可变区或可变域的抗原或表位。"域抗体?"或"dAb(TM) "可被 认为与"单一可变域"相同。单一可变域可为人单一可变域，但也包括源自其他物种（例如 啮齿类动物（例如，如WO 00/29004所公开）、铰口鲨和骆驼科动物的VHH dAb?)的单一可 变域。骆驼科动物的VHH是免疫球蛋白单一可变域，其衍生自以下物种，包括：骆驼、美洲驼 羊、羊驼、单峰骆驼和大羊驼，其产生天然缺乏轻链的重链抗体。可根据本领域可用的标准 技术将该VHH结构域人源化，且这种结构域被认为是"单一可变域"。本文所用的VH包括骆 驼科动物的VHH结构域。
[0021] 抗祀点（anti-target)单一可变域，例如抗-TNFa单一可变域，是指结合至所述 靶点（例如TNF a)的单一可变域。所述靶点可为任意合适的靶点。在一个实施方式中，本 发明的单一可变域靶向以下的任一种：TNF a、IL-23、LAG-3、IL-6、IL-13、IL-18、TSLP、CD3 或前述任一个的受体，例如TNF a受体（例如TNFR a RI或TNFR a RH)、IL-23受体、LAG-3 受体、IL-6受体、IL-13受体、IL-18受体、TSLP受体或CD3受体。在一个实施方式中，本发 明的单一可变域靶向趋化因子或趋化因子受体，例如谷氨酸-亮氨酸-精氨酸受体，即ELR 受体（例如包含SEQ ID NO : 12和19-22所示的氨基酸序列的受体）。
[0022] 亲和力是一个分子（例如本发明的单一可变域）与另一个分子（例如其靶点）在 单一结合位点处结合的力。单一可变域与其靶点的结合亲和力可通过平衡方法（例如酶联 免疫吸附测定（ELISA)或放射免疫测定（RIA))或动力学（例如BIAC0RE?分析）进行测 定。
[0023] 在一个实施方式中，所述单一可变域-靶点间的相互作用的平衡解离常数（KD)为 IOOnM或更小、IOnM或更小、2nM或更小或InM或更小。或者，该KD可在5至IOnM之间；或 1至2nM之间。该KD可在IpM至500pM之间；或500pM至InM之间。本领域技术人员将理 解，KD数值越小，结合越强。KD的倒数（即1/KD)为具有单位M4的平衡结合常数（KA)。本 领域技术人员将理解，KA数值越大，结合越强。
[0024] 解离速率常数（kd)或"解离速率（off-rate) "描述了单一可变域-靶点复合物 的稳定性，即每秒发生衰变的复合物的比例。例如，〇. OlsH的kd等于每秒有1 %的复合物 发生衰变。在一个实施方式中，该解离速率常数（kd)为IxKT3iT1或更小、1x10 ΛΓ1或更小、 ΙχΙΟ?或更小，或1x10 Λ-1或更小。该kd可在1x10-Υ1至1x10 Λ-1之间；或1x10 ΛΓ1至 1x10 3S 1 之间。
[0025] 在整个申请中所用的术语"中和"是指，在存在本文所述的单一可变域的情况下， 靶点的生物