细胞凋亡诱导剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及新型的细胞凋亡诱导剂、细胞增殖抑制剂、自噬抑制剂、含有该细胞凋 亡诱导剂、细胞增殖抑制剂或自噬抑制剂的医药组合物、以及伴随着细胞凋亡、细胞增殖或 自噬的异常的疾病的新型治疗方法等。
【背景技术】
[0002] 癌是人类所面对的最重要且最难对付的疾病之一，为了对其进行治疗进行了大量 的研宄努力。癌是由于基因的突变或表基因的异常等而使细胞失去控制地进行增殖的疾 病。关于癌的基因异常已有很多报告（例如非专利文献1等），其中很多被认为与细胞的增 殖、分化、生存相关的信号传递有某些关联。另外，由于这样的基因异常，由正常分子构成的 细胞内的信号传递发生异常，由此导致特定的信号级联的活化或灭活，最终有时会成为引 起细胞异常增殖的一个因素。初期的癌治疗主要着眼于对细胞增殖本身的抑制，但由于该 治疗也抑制生理性地正常增殖的细胞的增殖，因此会伴随着脱发、消化系统疾病、骨髄抑制 等副作用。因此，为了抑制所述副作用，基于以癌特有的基因异常或信号传递异常为靶的分 子靶向药等的新想法的癌治疗药的开发不断进展。
[0003] 作为催化谷胱甘肽结合的酶之一的谷胱甘肽-S-转移酶（GST)、特别是 GST-Ji (glutathione S-transferase pi，也称为GSTP1)的表达在各种癌细胞中增加，表明 其可能是对部分抗癌剂产生抗性的一个原因。实际上已知，当使针对GST-π的反义DNA或 GST-π抑制剂作用于过量表达GST-π并显示药物抗性的癌细胞系时，药剂抗性得到抑制 (非专利文献2~4)。此外，最近的报告中报告了，当使针对GST-π的siRNA作用于过量 表达GST-π的雄激素非依赖性前列腺癌细胞系时，其增殖得到抑制、细胞凋亡增加（非专 利文献5)。另外还报告了，当使针对GST-π的siRNA作用于KRAS存在变异的癌细胞系时， Akt的活化得到抑制且自噬增加，但细胞凋亡的诱导为中等程度（非专利文献6)。
[0004] 但是，关于GST-JI与细胞增殖或细胞凋亡之间的关系、GST-JI的分子机理、 GST-π在各种细胞内信号传递中的作用等还几乎未弄清楚。细胞内的信号传递极其复杂， 不仅常有1种分子影响多种分子的作用、或相反1种分子受到多种分子的影响的情况，而且 常有即使抑制了某种分子的作用，其它的信号级联也活化，从而无法获得期望效果的情况。 因此，为了开发更为优异的分子靶向药，需要弄清楚复杂地交织在一起的细胞的信号传递 机理，但是尽管经过了多年研宄也不过弄清楚了其中的极小一部分，因此还需要进一步的 研宄努力。
[0005] 现有技术文献
[0006] 非专利文献
[0007] 非专利文献 I :Futreal et al.，Nat Rev Cancer. 2004 ;4 (3) : 177-83
[0008] 非专利文献 2 :Takahashi and Niitsu，Gan To Kagaku Ryoho. 1994 ;21 (7): 945-51
[0009] 非专利文献 3 :Ban et al.，Cancer Res. 1996 ;56 (15) :3577-82
[0010] 非专利文献 4 :Nakajima et al.，J Pharmacol Exp Ther. 2003 ;306 (3) :861-9
[0011] 非专利文献 5 :Hokaiwado et al.，Carcinogenesis. 2008 ;29 (6) :1134-8
[0012] 非专利文献 6 :Nishita et al.，AACR 102nd Annual Meeting，Abstact No. 1065
【发明内容】
[0013] 发明要解决的课题
[0014] 本发明的目的在于提供用于在细胞中有效地诱导细胞凋亡和/或增殖抑制的组 合物及使用该组合物的方法。
[0015] 用于解决课题的手段
[0016] 本发明者们为了弄清楚GST-π的分子机理不断地进行刻苦研宄，结果发现了当 同时抑制GST-π和Akt的表达时，与仅抑制两者中的任一者的表达时相比，细胞增殖被进 一步强力抑制、细胞死亡也进一步被强烈诱导，并且进一步发现了由GST-π的表达抑制而 被诱导的自噬通过同时抑制Akt的表达而显著地得到抑制，从而完成了本发明。
[0017] 即本发明涉及以下内容。
[0018] (1) -种用于诱导细胞凋亡的药剂，其含有抑制GST-π的药物和抑制Akt的药物 作为活性成分。
[0019] (2) -种用于抑制细胞增殖的药剂，其含有抑制GST- π的药物和抑制Akt的药物 作为活性成分。
[0020] (3) -种用于在GST- JT得到抑制的细胞中抑制自噬的药剂，其含有抑制Akt的药 物作为活性成分。
[0021] (4) 一种用于增强由抑制GST-31的药物引起的细胞凋亡的诱导和/或细胞增殖的 抑制的药剂，其含有抑制Akt的药物作为活性成分。
[0022] (5)根据⑴~⑷中任一项所述的药剂，其中，活性成分选自由RNAi分子、核酶、 反义核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸及表达它们的载体组成的组。
[0023] (6) -种医药组合物，其含有⑴~（5)中任一项所述的药剂。
[0024] (7)根据（6)所述的医药组合物，其为细胞的异常增殖引起的疾病的治疗用。
[0025] (8)根据（6)所述的医药组合物，其为癌的治疗用。
[0026] 发明效果
[0027] 由于本发明的细胞凋亡诱导剂与以往的药剂相比能够更有效地诱导细胞凋亡、抑 制细胞增殖，因此作为医药组合物是极其有用的。特别是在癌的治疗中，由于能够通过细胞 凋亡杀死癌细胞，因此不仅可期待阻止癌发展的效果，而且可期待使癌退缩的效果。
【附图说明】
[0028] 图1为表示PANC-I细胞中的由GST- π或Akt的敲减（knockdown)产生的细胞增 殖抑制效果的图。
[0029] 图2为表示A549细胞中的由GST-π或Akt的敲减产生的细胞增殖抑制效果的图。
[0030] 图3为表示PANC-I细胞中的由GST- π及Akt的双敲减产生的细胞增殖抑制效果 的图。
[0031] 图4为表示A549细胞中的由GST-π及Akt的双敲减产生的细胞增殖抑制效果的 图。
[0032] 图5为表示由GST-π siRNA与Akt抑制剂并用产生的细胞增殖抑制效果的图。 *Ρ〈0. 05、**Ρ〈0. 01。
[0033] 图6为表示由GST-π及Akt的双敲减产生的自噬抑制效果的图。
【具体实施方式】
[0034] 本发明涉及用于抑制细胞增殖的药剂或组合物（以下也称为"细胞增殖抑制剂" 或"细胞增殖抑制用组合物"）及用于诱导细胞凋亡的药剂或组合物（以下也称为"细胞凋 亡诱导剂"或"细胞凋亡诱导组合物"），它们含有抑制GST- π的药物和抑制Akt的药物作 为活性成分。
[0035] 在本说明书中使用的情况下，GST-π是指由GSTPl基因编码的对谷胱甘肽结合 (glutathione conjugation)进行催化的酶。GST-Ji存在于包括人在内的各种动物，其序 列信息也是公知的（例如人：NP_000843(NM_000852)、大鼠：NP_036709(NM_012577)、小鼠： NP_038569(NM_013541)等。编号表示NCBI数据库的登录号，括号外为氨基酸序列的编号、 括号内为碱基序列的编号）。
[0036] 在本说明书中使用的情况下，Akt是指由Akt基因编码的具有PH区域的丝氨酸/ 苏氨酸激酶。Akt已知有Aktl~3这3种异型，但与PI3K/AKT/mT0R路径相关的是Aktl， 因此在本说明书中，只要没有特别说明，则Akt是指Aktl。Akt存在于包括人在内的各种动 物，其序列信息也是公知的（例如人：NP_005154(NM_005163)等。编号表示NCBI数据库的 登录号，括弧外为氨基酸序列的编号、括弧内为碱基序列的编号）。
[0037] 由于生物个体间有可能发生不影响蛋白的生理学功能的基因序列或氨基酸序列 的变异，因此本发明中的GST-π或GSTPl基因、或者Akt或Akt基因并不限于与公知序列具 有相同序列的蛋白或核酸，可具有相对于该序列有1个或2个以上、典型地有1个或数个、 例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个不同的氨基酸或碱基的序列，另 外可以包含与上述公知的GST-π或Akt具有同等功能的序列。关于GST-π及Akt的具体 功能，如后所述。
[0038] 需要说明的是，本说明书中，"在本说明书中使用的情况下"、"本说明书中使用 的"、"本说明书中"、"本说明书中记载的"等表述只要没有特别说明，则表示其后的记载适 用于本说明书中记载的全部发明。另外，只要没有另外地定义，本说明书中使用的全部技术 用语及科学用语具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。本说明书中参照的全部专 利、公报及其它出版物它们整体引用到本说明书中。
[0039] 对本说明书中使用的"抑制GST- π的药物"没有限定，例如包括抑制GST- π的产 生和/或活性的药物、促进GST-π的分解和/或灭活的药物等。作为抑制GST-π的产生的 药物，对其没有限定，可列举出例如针对编码GST-π的DNA的RNAi分子、核酶、反义核酸、 DNA/RNA嵌合多核苷酸及表达它们的载体等。
[0040] 作为抑制GST- JT的活性的药物，对其没有限定，可列举出例如与GST- JT结合的 物质、例如谷胱甘肽、谷胱甘肽类似物（例如WO 95/08563、W096/40205、WO 99/54346、非 专利文献4等中记载的物质）、酮洛芬（非专利文献2)、吲哚美辛（Hall et al.，Cancer Res. 1989 ;49 (22) :6265-8)、依他尼酸、伊洛前列素（iloprost) (Tew et al.，Cancer Res. 1988 ;48 (13) :3622-5)、抗GST-π抗体、GST-π的显性失活突变体等。这些药物可从