41 ] (5)根据所述的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，可灵活使用。制备好的大孔改性蛋清细胞培养支架材料可进一步制成冻干粉末，添加到正在贴壁对数生长期的贴壁细胞培养瓶(皿)里，短期培养后，易于实现材料和细胞的分离，研宄材料对细胞行为的影响。
[0042]实施例1
[0043]一种大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，包括以下步骤:
[0044](I)选用10mL烧杯，将20克P (MVE-alt-MAH)加入到80mL超纯水中，加热90°C搅拌2h以上，充分溶解至无色透明。配制成20%溶液。取20% P (MVE-alt-MAH)溶液ImL,即0.2克，于6孔板中；
[0045](2)取10 %的碳酸氢钠溶液，缓慢滴加到6孔板中，调P (MVE-alt-MAH)的pH为6，反应10-15min ;加1-乙基_(3_甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)，活化15_20min ;再加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，反应15-20min ；
[0046](3)调节pH7.2左右，加2mL鸡蛋清进行交联，充分振荡或搅拌后静置，室温下反应24h以上，使其充分交联完全；
[0047](4)将步骤(3)得到的改性蛋清培养支架材料用注射器逐滴滴入PBS溶液，静止12h，使其中的多余小分子吸出去除，重复三次；
[0048](4)反应后，得到的改性蛋清细胞培养支架材料置于细胞超净工作台，紫外照射30min,保证培养支架材料的无菌状态，即可获得用于细胞培养的大孔蛋清培养支架材料。加入事先准备好的SK0V3卵巢癌细胞悬液进行培养。在培养过程中，短期培养，如7天左右，可连续追加培养液培养；长期培养，如15天以上，每3天各孔更新一半培养液的办法进行换液。
[0049]如图La、图 3.a。
[0050]实施例2
[0051]一种大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，包括以下步骤:
[0052](I)选用10mL烧杯，将20克P (MVE-alt-MAH)加入到80mL超纯水中，加热90°C搅拌2h以上，充分溶解至无色透明。配制成20%溶液。取20% P (MVE-alt-MAH)溶液0.75mL,即0.15克，于6孔板中；
[0053](2)取10 %的碳酸氢钠溶液，缓慢滴加到6孔板中，调P (MVE-alt-MAH)的pH为6，反应10-15min ;加1-乙基_(3_甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)，活化15_20min ;再加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，反应15-20min ；
[0054](3)调节pH7.2左右，加2mL鸡蛋清进行交联，充分振荡或搅拌后静置，室温下反应24h以上，使其充分交联完全；
[0055](4)将步骤(3)得到的改性蛋清培养支架材料用注射器逐滴滴入PBS溶液，静止12h，使其中的多余小分子吸出去除，重复三次；
[0056](4)反应后，得到的改性蛋清细胞培养支架材料置于细胞超净工作台，紫外照射30min,保证培养基的无菌状态，即可获得用于细胞培养的大孔蛋清培养支架材料。加入事先准备好的SK0V3细胞悬液。在培养过程中，短期培养，如7天左右，可连续追加培养液培养；长期培养，如15天以上，每3天各孔更新一半培养液的办法进行换液。
[0057]如图l.b、图 3.b。
[0058]实施例3
[0059]一种新型改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，包括以下步骤:
[0060](I)选用10mL烧杯，将20克P (MVE-alt-MAH)加入到80mL超纯水中，加热90°C搅拌2h以上，充分溶解至无色透明。配制成20%溶液。取20% P (MVE-alt-MAH)溶液0.5mL,即0.1克，于6孔板中；
[0061 ] (2)取10 %的碳酸氢钠溶液，缓慢滴加到6孔板中，调P (MVE-alt-MAH)的pH为6，反应10-15min ;加1-乙基_(3_甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)，活化15_20min ;再加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，反应15-20min ；
[0062](3)调节pH7.2左右，加2mL鸡蛋清进行交联，充分振荡或搅拌后静置，室温下反应24h以上，使其充分交联完全；
[0063](4)将步骤(3)得到的改性蛋清培养支架材料用注射器逐滴滴入PBS溶液，静止12h，使其中的多余小分子脲吸出去除，重复三次；
[0064](4)反应后，得到的改性蛋清细胞培养支架材料置于细胞超净工作台，紫外照射30min,保证培养支架材料的无菌状态，即可获得用于细胞培养的多密度大孔蛋清培养支架材料。加入事先准备好的SK0V3卵巢癌细胞悬液。在培养过程中，短期培养，如7天左右，可连续追加培养液培养；长期培养，如15天以上，每3天各孔更新一半培养液的办法进行换液。
[0065]如图1.C、图 3.C。
[0066]实施例4
[0067]一种大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，包括以下步骤:
[0068](I)选用10mL烧杯，将20克P (MVE-alt-MAH)加入到80mL超纯水中，加热90°C搅拌2h以上，充分溶解至无色透明。配制成20%溶液。分别取20% P (MVE-alt-MAH)溶液0.25mL,即0.025克，于6孔板中；
[0069](2)取10 %的碳酸氢钠溶液，缓慢滴加到6孔板中，调P (MVE-alt-MAH)的pH为6，反应10-15min ;加1-乙基_(3_甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)，活化15_20min ;再加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，反应15-20min ；
[0070](3)调节pH7.2左右，加2mL鸡蛋清进行交联，充分振荡或搅拌后静置，室温下反应24h以上，使其充分交联完全；
[0071](4)将步骤(3)得到的改性蛋清培养支架材料用注射器逐滴滴入PBS溶液，静止12h，使其中的多余小分子吸出去除，重复三次；
[0072](4)反应后，得到的改性蛋清细胞培养支架材料置于细胞超净工作台，紫外照射30min,保证培养支架材料的无菌状态，即可获得用于细胞培养的多密度大孔蛋清培养支架材料。加入事先准备好的SK0V3卵巢癌细胞悬液。在培养过程中，短期培养，如7天左右，可连续追加培养液培养；长期培养，如15天以上，每3天各孔更新一半培养液的办法进行换液。
[0073]如图l.d、图 3.d。
[0074]实施例5
[0075]一种大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，包括以下步骤:
[0076](I)选用10mL烧杯，将20克P (MVE-alt-MAH)加入到80mL超纯水中，加热90°C搅拌2h以上，充分溶解至无色透明。配制成20%溶液。分别取20% P (MVE-alt-MAH)溶液0.125mL,即0.025克，于6孔板中；
[0077](2)取10 %的碳酸氢钠溶液，缓慢滴加到6孔板中，调P (MVE-alt-MAH)的pH为6，反应10-15min ;加1-乙基_(3_甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)，活化15_20min ;再加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，反应15-20min ；
[0078](3)调节pH7.2左右，加2mL鸡蛋清进行交联，充分振荡或搅拌后静置，室温下反应24h以上，使其充分交联完全；
[0079](4)将步骤(3)得到的改性蛋清培养支架材料用注射器逐滴滴入PBS溶液，静止12h，使其中的多余小分子吸出去除，重复三次；
[0080](4)反应后，得到的改性蛋清细胞培养支架材料置于细胞超净工作台，紫外照射30min,保证培养支架材料的无菌状态，即可获得用于细胞培养的多密度大孔蛋清培养支架材料。加入事先准备好的SK0V3卵巢癌细胞悬液进行培养。在培养过程中，短期培养，如7天左右，可连续追加培养液培养；长期培养，如15天以上，每3天各孔更新一半培养液的办法进行换液。
[0081]如图l.e、图 3.e。
【主权项】
1.一种大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)配制质量百分比浓度为20%的P(MVE-alt-MAH)水溶液，取0.025-0.2g的P(MVE-alt-MAH)水溶液加入反应器皿中； (2)取质量百分比浓度为10%的碳酸氢钠溶液，缓慢滴加到P(MVE-alt-MAH)水溶液中，调节pH为5-6，反应10-15 min ;加入1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳酰二亚胺活化15-20min ;再加N-轻基瑭泊酰亚胺反应15-20 min ；1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:1 ; (3)调节pH7.2，再加入2 mL鸡蛋清进行交联，充分振荡或搅拌后静置，25~37°C下充分交联反应完全； (4)将步骤(3)得到的改性蛋清培养支架材料用注射器逐滴滴入PBS溶液，静止12h，使其中的多余小分子脲吸出去除，重复若干次； (5)反应后，得到的改性蛋清细胞培养支架材料置于细胞超净工作台，紫外照射杀菌即获得用于细胞培养的大孔改性蛋清培养支架材料。2.根据权利要求1所述的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，其特征在于，第(5)步得到的大孔改性蛋清培养支架材料进一步制备成冻干粉末。3.根据权利要求1所述的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，其特征在于，第(4)步重复若干次是指的用PBS溶液重复三次，每次12 h洗涤去除多余及未交联的小分子脲。4.根据权利要求1所述的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，其特征在于，所紫外照射杀菌为超净台内紫外光照不超过30 min。5.基于权利要求1?4任一所述的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的细胞培养方法，其特征在于，将大孔改性蛋清细胞培养支架移入六孔板中，向每孔加入0.4 mL事先准备好的SKOV3卵巢癌细胞悬液，细胞浓度为5 X 104(^118/1^，细胞数量每孔不低于5\104个；在培养过程中，小于等于7天的培养时间，采用连续追加培养液法进行培养；大于等于15天以上的培养期，则采用每3天各孔更新一半培养液的办法进行换液。6.根据权利要求5所述的基于大孔改性蛋清细胞培养支架材料的细胞培养方法，其特征在于，所用的细胞悬液为SKOV3卵巢癌贴壁细胞。7.根据权利要求2所述的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法的到的冻干粉末的应用，其特征在于，制备好的大孔改性蛋清细胞培养支架材料冻干粉末添加到正在贴壁培养瓶或皿里，短期培养后用以实现材料和细胞的分离。
【专利摘要】本发明涉及一种大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，包括以下步骤：配制质量百分比浓度为20％的P(MVE-alt-MAH)水溶液，取质量百分比浓度为10％的碳酸氢钠溶液，缓慢滴加到P(MVE-alt-MAH)水溶液中，调节pH为5-6，反应加入1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳酰二亚胺活化；再加N-羟基琥珀酰亚胺反应(3)调节pH7.2，再加入2mL鸡蛋清进行交联；(4)滴入PBS溶液，将多余小分子脲吸出去除，即得。硬度梯度容易控制，所形成的皱褶和密集的大型孔洞利于细胞的黏附生长。制备过程简单，材料经济，易于实现，蛋清本身可以给细胞提供一定的营养支持，不涉及采用高温高压装置，安全无毒副作用。
【IPC分类】A61L27/38, A61L27/16, A61L27/22, A61L27/56
【公开号】CN104984389
【申请号】CN201510439589
【发明人】张天柱, 郭振超, 杨新明, 顾宁
【申请人】东南大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月23日