]在一种实施方式中，⑶34阴性祖细胞结合至少一种另外的活性组分使用。例如，所述至少一种另外的活性组分可具有选自下述的药理学活性:抗炎症活性、抗缺血性活性、抗血栓形成活性和它们的组合。另外或可选地，所述至少一种另外的活性组分可具有保护内皮细胞避免同种异体识别和/或裂解的能力。在某些例子中，至少一种另外的活性组分包括脱氧核糖核酸衍生物，例如去纤维蛋白多核苷酸。
[0049]在第二方面中，本发明提供了用于上述任一用途的人⑶34阴性祖细胞的制造方法，该方法包括下述步骤:a)分离CD34阴性祖细胞；b)在细胞生长培养基中扩增CD34阴性祖细胞至少12天；c)收获⑶34阴性祖细胞。
[0050]在一种实施方式中，在方法步骤a)中，⑶34阴性祖细胞分离自包括下述的组织:骨髓、脐带、胎盘和脂肪组织，或它们的组合。发明人发现来自这些组织来源的祖细胞尤其适于保护血管炎性疾病中的血管内皮细胞层。优选地，CD34阴性祖细胞是CD34阴性间充质干细胞/基质细胞。最优选的是来自骨髓的CD34阴性间充质干细胞/基质细胞。
[0051]根据该方法的进一步实施方式，方法步骤b)的细胞生长培养基包括包含下述的培养基:
[0052]-人血小板裂解物，不含直径大于0.22 μ m的固体物质，其中裂解物占细胞生长培养基总体积的2%至15%，
[0053]-人新鲜冷冻的血浆(FFP)滤液，不含直径大于0.22 μ m的固体物质，其中FFP滤液占细胞生长培养基总体积的1%至10%，
[0054]-肝素，在细胞生长培养基中的浓度为OU/ml至10U/ml，
[0055]-L-谷氨酰胺，浓度为0.5mM至10mM，和
[0056]-适于哺乳细胞生长的无血清、低葡萄糖培养基，其中无血清、低葡萄糖培养基占细胞生长培养基总体积的75%至97%。
[0057]此处，人新鲜冷冻的血浆指已经被离心、分离并且在_18°C或更冷时在收集的数小时内冷冻成固体的人血液的液体部分。发明人在该培养基中完成CD34阴性祖细胞的扩增，其特别有力地保护血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应。下面，该培养基被称为“B1-Ι”培养基。
[0058]在优选的实施方式中，在方法步骤c)中收获CD34阴性祖细胞，其主要在接触细胞培养基的表面，比如细胞培养皿或细胞培养容器的壁上附着生长。
[0059]优选地，在良好生产规范(GMP)和/或现行良好生产规范(cGMP)下进行方法步骤a)至 c) ο
[0060]利用这些方法，发明人完成了具有非常高的血管内皮细胞层保护效能的更好限定、高度可移植的细胞的体外扩增和正向选择，反之，常规方法通常产生CD34阴性祖细胞中不同亚群的异源混合物。
[0061]在第三方面中，本发明提供了测定CD34阴性祖细胞保护血管内皮细胞层避免免疫介导细胞毒性反应的能力的方法，其通过制备包含内皮靶细胞、细胞毒性CD8+T淋巴细胞和CD34阴性祖细胞的样品和包含内皮靶细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞而没有CD34阴性祖细胞的参考样品，并且比较样品和参考样品中的内皮靶细胞的裂解来进行测定。
[0062]在一种实施方式中，内皮靶细胞和/或CD34阴性祖细胞相对于CD8+T淋巴细胞是同种异体的。
[0063]在另一实施方式中，在用内皮靶细胞和所述CD8+T淋巴细胞制备样品和参考样品之前，将CD8+T淋巴细胞与同种异体内皮细胞在存在白介素-2(IL-2)的情况下共同培养。共同培养例如可维持至少一天，优选为至少3天，更优选为至少5天，最优选为至少7天。
[0064]在另一实施方式中，至少一种另外的活性组分添加至所述样品和/或所述参考样品中。例如，所述至少一种另外的活性组分可具有选自下述的药理学活性:抗炎症活性、抗缺血性活性、抗血栓形成活性和它们的组合。另外或可选地，所述至少一种另外的活性组分可具有保护内皮细胞避免同种异体识别和/或裂解的能力。在某些例子中，所述至少一种另外的活性组分包括脱氧核糖核酸衍生物，例如去纤维蛋白多核苷酸。
[0065]利用该方法，发明人完成了用于评估来自不同来源的CD34阴性祖细胞保护血管内皮细胞层的能力的效力试验。而且，实现了用于正向预测CD34阴性祖细胞在体内的疗效的体外测试。
[0066]所述方法可也用于分析受试者的血液，用于接受移植物和/或发展内皮并发症之前、期间和/或之后内皮-细胞毒性⑶8+T淋巴细胞的存在和/或病理生理活性。
[0067]例如，在相对于受试者是同种异体的实体器官移植的情况下，内皮靶细胞可包括源自实体器官供体的细胞。在相对于受试者是同种异体的实体器官移植的另一情况下，CD34阴性祖细胞可包括源自实体器官供体的细胞。在实体器官移植物相对于受试者是同种异体的某些情况下，内皮靶细胞和CD34阴性祖细胞可包括源自实体器官供体的细胞。另外或可选地，CD34阴性祖细胞也可包括源自至少一个不是受试者或实体器官供体的第三方供体的细胞。
[0068]在同种异体造血干细胞移植的情况下，内皮靶细胞可包括源自受试者，即移植物接受者的细胞。在同种异体造血干细胞移植的另一情况下，CD34阴性祖细胞可包括源自移植物接受者的细胞。在同种异体造血干细胞移植的某些情况下，内皮靶细胞和CD34阴性祖细胞可包括源自移植物接受者的细胞。另外或可选地，CD34阴性祖细胞也可包括源自至少一个不是移植物接受者或造血干细胞供体的第三方供体的细胞。
[0069]这样，所述方法不仅能够用于确定受试者的对于发展免疫介导细胞毒性反应的感受性，其基于使用源自受试者血液的细胞毒性CD8+T淋巴细胞的个体结合上面鉴定的、情况特异性内皮靶细胞，而且也可选择展示特别有力保护内皮靶细胞的CD34阴性祖细胞。
[0070]结果，患者例如可根据他们血管炎性疾病的风险而分层。而且，可设计个性化预防和/或疗法。
【具体实施方式】
[0071]在下述实施例中，参考图和实验数据更详细阐释本发明的某些实施方式。实施例和附图并不是要对本发明做出限制。
[0072]实施例1:实验设计细胞毒性试验
[0073]下述实施例描述发明人设计的实验设置，用于评估CD34阴性祖细胞就保护血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应的效力。
[0074]图1是图解本发明细胞毒性试验的一个代表性实施方式的方块图。外周血的单核细胞(PBMC，10)可用作细胞毒性细胞的来源。PBMC例如可源自健康的第三方供体。可选地，可使用待治疗受试者的PBMC。
[0075]接下来，可进一步选择PBMC用于⑶8+T淋巴细胞(11)。用于⑶8+T淋巴细胞的选择例如可包括通过免疫分离从PBMC来富集CD8+T淋巴细胞。免疫分离例如可包括通过去除非⑶8+T淋巴细胞来反向选择⑶8+T淋巴细胞。用于富集⑶8+T淋巴细胞的适当的方法是例如利用免疫磁性微粒的非接触选择。不需要的细胞例如可被作为目标，通过可识别CD4、CD14、CD16、CD19、CD20、CD36、CD56、CD66B、CD123、TCRy/ δ、血型糖蛋白 A 和包被葡聚糖的磁性颗粒的抗体复合物去除。其后，可通过例如流式细胞仪确认选择的细胞的表型纯度。优选地，大部分选择的细胞是⑶8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL，12)。
[0076]在下一阶段，可保持⑶8+CTL与相对于⑶8+CTL同种异体的内皮刺激细胞(13)共培养(14)。优选地，内皮刺激细胞不能进行有丝分裂。适当的细胞系例如是SV40大T抗原转化的微脉管内皮细胞系CDC/EU.HMEC-1 (HMEC)。内皮刺激细胞和CD8+CTL的共培养例如可保持约七天。优选地，共培养进一步包括用白介素-2刺激⑶8+CTL。
[0077]内皮靶细胞(17)的制备可经受标记步骤(18)，其中它们用第一标签标记，使得内皮靶细胞与其他非靶细胞区分开。例如，这样的标签可包括荧光性化合物，其存在于细胞的质膜中时相较于存在于质膜的外侧时，具有不同的发射特征。适当的化合物例如是3，3’双十八烷基氧杂羰花青高氯酸盐(D10C183)。靶细胞例如可以是来自移植组织的内皮细胞。靶细胞可以是内皮细胞系，例如微脉管内皮系CDC/EU.HMEC-1。
[0078]在下一阶段，通过结合第一部分标记的靶细胞(20)、第一部分效应细胞(16)和CD34阴性祖细胞(21)制备样品(22)。CD34阴性祖细胞例如可以是相对于内皮靶细胞和效应细胞同种异体的。内皮靶细胞和CD34阴性祖细胞的比例例如可以是5:1。效应细胞对内皮靶细胞的比例例如可以是20:1、10:1或5:1。通过结合第二部分标记的靶细胞(20’)和第二部分没有CD34阴性祖细胞的效应细胞(16’)，以如上述样品中相同的比例制备参考样品(22’)。保持样品和参考样品的温育(23，23’)。温育例如可保持约四小时。
[0079]其后，测定样品和参考样品中裂解的内皮靶细胞的量(24，24’)。为了该目的，可用第二标签标记裂解的内皮靶细胞，使得裂解靶细胞与非裂解的靶细胞区分开。这样的第二标签例如可以是适于阳性染色死细胞的染色。例如，可使用荧光染色比如碘化丙啶。测定裂解的内皮靶细胞的适当的方法例如可以是流式细胞术。例如，可通过流式细胞仪测定携带第一标签例如D10CI83的细胞的总群体中携带第一和第二标签例如D10CI83和PI的细胞的量来测定裂解的细胞的百分数。
[0080]另外，由效应细胞特异性裂解的靶细胞的百分数可通过减去随机裂解的细胞的百分数来校正。为了该目的，制备第三部分(25)标记的靶细胞(19)，其不包含效应细胞也不包含CD34阴性祖细胞。以与样品和参考样品相同的方式进一步处理第三部分(25)，其后如上述那样测定第三部分(26)中的随机裂解内皮靶细胞的量。
[0081]实施例2:第三方CD34阴性祖细胞保护内皮细胞避免同种异体CD8+CTL引起的裂
M
[0082]实施例1中描述的细胞毒性试验用于评估内皮靶细胞(HMEC)被具有和没有源自第三方CD34阴性祖细胞的同种异体细胞毒性T淋巴细胞导致的裂解。在该情况下，使用分离自骨髓的CD34阴性间充质干细胞/基质细胞。在B1-1培养基中扩增BM-MSC，其产生有利的细胞群体用于从保持干细胞特征、细胞活力和保护血管内皮细胞层避免免疫介导的细胞毒性反应的效力角度的治疗性用途。
[0083]制备20:1、10:1和5:1的不同比例的效应细胞和靶细胞。对于每个比例，制备没有骨髓MSC的六个个体样品和有骨髓MSC (BM-MSC)的六个个体样品。就后者而言，在添加效应细胞之前，用单个供体的BM-MSC温育靶细胞24小时。
[0084]实验的结果显示在图2中。该图显示没有BM-MSC (菱形标记物)和有BM-MSC (方形标记物)的样品中，关于各自的效应细胞与靶细胞比例，以百分数计靶细胞的特异性裂解。数据表示六个个体实