一种外周血NK细胞体外高效扩增方法与流程

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种外周血nk细胞(naturalkillercell)体外高效扩增方法的培养。

背景技术：

nk细胞即自然杀伤细，1975年被发现，属于非吞噬淋巴细胞，胞浆富含穿孔素和颗粒酶，具有识别和溶解肿瘤细胞的功能。其主要来源于骨髓cd34⁺的淋巴细胞，主要存在于外周血，占外周血淋巴细胞的5％-15％，在脾脏，肝脏，虹膜，淋巴结均有表达。nk细胞的表型为cd3^-cd56⁺，有两种亚型cd56^bright和cd56^dim；cd56^brightnk细胞主要功能是分泌细胞因子，cd56^dimnk细胞有细胞毒性，占外周血nk细胞的90％。nk细胞主要通过天然的细胞毒作用，adcc效应及分泌免疫调节性细胞因子作用诱导杀伤肿瘤细胞及病毒感染细胞，分泌的一些细胞因子还可以调节t细胞，b细胞，dc细胞，m细胞的功能和分化。在机体免疫监视，对抗病原体侵袭和防止细胞恶性转化中发挥重要作用。nk细胞的作用机制：1.直接通过细胞胞吐作用释放穿孔素和颗粒酶，活化caspase途径进而诱导靶细胞凋亡；2.表达fas(cd95)配体与trail分子，诱导靶细胞发生凋亡；3.细胞因子介导的杀伤细胞作用；4.adcc作用。与t细胞相比，nk细胞识别抗原没有mhc限制，可以直接杀伤肿瘤细胞和外来病原体；同时nk细胞还分泌一些调节免疫反应的细胞因子。近些年，临床上将nk细胞用于免疫治疗的例子在不断增多，导致对nk细胞的需求也越来越大。

目前，体外扩增nk系统主要通过以下三种方法：1采用饲养细胞(基因修饰)的方法培养pbmc中的nk细胞；2是采用免疫磁珠的方法从pbmc中将nk细胞分离出来再培养；3单纯的细胞因子组合刺激pbmc中nk细胞的扩增。采用饲养细胞培养nk细胞可以获得高纯度大量的nk细胞，但引入了人源细胞，存在安全隐患；采用免疫磁珠的方法可以快速的获得少量nk细胞，但只能用于nk细胞研究，量少不适用于临床，且成本高，操作复杂；现有的细胞因子组合刺激pbmc中nk细胞的扩增的方法仅能使nk细胞扩增倍数在150倍左右，nk细胞纯度在60％左右，且数量和纯度上都无法满足治疗性的要求。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种外周血nk细胞体外高效扩增方法，即无需对nk细胞进行磁珠纯化，也不需饲养细胞，通过使用本发明的细胞因子组合就可以得到大量高效的nk细胞，操作简单，完全可以满足临床需要。

本发明所提供的外周血nk细胞体外高效扩增方法，是将外周血单核淋巴细胞接种到预先用cd16单抗，cd56单抗和cd3单抗进行包被的培养容器中，并在培养过程中添加细胞因子il-15再次活化nk细胞。

本发明的外周血nk细胞体外高效扩增方法，其具体的操作步骤如下：

1)培养瓶的包被：

将溶有cd3单抗、cd16单抗和cd56单抗的pbs作为包被液，将包被液加入到培养瓶中进行包被；

所述的包被液中，cd3单抗、cd16单抗和cd56单抗的浓度范围分别为；1ng～100ng/ml，1μg～20μg/ml，1μg～20μg/ml。cd3单抗、cd16单抗和cd56单抗的优选浓度分别为10ng/ml，5μg/ml，5μg/ml。

包被的具体条件如下：4℃避光4-24小时或者室温避光2-4个小时或者37℃避光1个小时；

2)细胞接种：用淋巴分离液从外周血中分离获得人外周血单核细胞(pbmc)，将人外周血单核细胞接种到预先包被的培养瓶中，并添加10％的自体血浆和终浓度为500iu/ml的il-2，37℃，5％co2培养；

3)扩大培养：接种后的细胞在培养到第3天时，补充培养基gt-t551h3和终浓度为200iu/ml的il-2，37℃，5％co2培养，

4)二次刺激：第五天补加补充培养基gt-t551h3，终浓度为200iu/ml的il-2和终浓度为50ng/ml的il-15对nk细胞进行二次刺激；

5)扩大培养：每隔2-3天补加培养基gt-t551h3和终浓度为200iu/ml的il-2；

6)收获细胞：在培养的第17天，离心收集全部培养所得细胞。

本发明利用cd16单抗，cd56单抗在低浓度cd3单抗共刺激外周血中单个核细胞的nk细胞扩增，在培养至第五天的时候加入il-15细胞因子，二次刺激nk细胞活化和增殖，此方法可以使nk细胞大量扩增，增强其杀伤能力。本发明得到大量高纯度的nk细胞，满足临床需求。

附图说明

图1为实施例1-3与对比实施例1-3第5-17天细胞增殖曲线的结果图；

图2为实施例1-3与对比实施例1-3得到nk细胞比例结果图。

具体实施方式

本发明所用的试剂和材料描述如下：

cd16单抗：鼠抗人cd16单克隆单抗，购于beckmancoμlter公司

cd56单抗：鼠抗人cd56单克隆单抗，购于biolegend公司

il-15：重组人白细胞介素15，购于上海近岸公司

il-2：重组人白细胞介素2，购于江苏金丝利公司

gt-t551h3培养基：购于taraka有限公司。

本发明方法的总体步骤如下：

1)培养瓶的包被：分别将cd16单抗25微克，cd56单抗25微克，cd3单抗50纳克溶于5毫升的pbs后，加入到底面积为75平方厘米的培养瓶中，4℃避光4-24小时或者室温避光2-4个小时或者37℃避光1个小时；

2)细胞接种：用淋巴分离液从外周血中分离获得单个核细胞(pbmc)，取样计数后，接种到预先包被的培养瓶中，添加10％的自体血浆,il-2浓度为200iu/ml；

3)扩大培养：接种后的细胞在培养到第3天时，补充培养基gt-t551h3和终浓度为200iu/ml的il-2，37℃，5％co2培养，细胞浓度维持在5x10⁵cells/ml左右；

4)二次刺激：第五天补加补充培养基gt-t551h3，终浓度为200iu/ml的il-2和终浓度为50ng/ml的il-15对nk细胞进行二次刺激；

5)扩大培养/转袋培养：以后每隔2-3天补加培养基gt-t551h3和终浓度为200iu/ml的il-2，细胞浓度维持在5x10⁵cells/ml左右；

6)收获细胞：在培养的第17天，取1毫升的细胞悬液进行细胞计数和流式检测，计算nk细胞的增殖倍数和纯度。离心收集全部培养所得细胞。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1

1)培养瓶的包被：分别cd16单抗25微克，cd56单抗25微克，cd3单抗50纳克溶于5毫升的pbs中充分溶解，加入到底面积为75平方厘米的培养瓶中，4℃避光过夜；

2)细胞接种：a外周血40ml，全血700g离心15min；b自体血浆制备：取上层血浆21ml，56℃，灭活30min，4℃，静置15min，900g，离心15min,上清为自体血浆备用；c取中间白膜层(单个核细胞)大概5ml到15mlpbs中，稀释混匀；d然后将稀释的单核细胞缓慢的加到淋巴分离液的表面，使白膜层和篱笆分离液之间有清晰分层，淋巴分离液与单核细胞液的比例为3∶4，800g离心20mim；e洗涤pbmc，用巴斯德吸管将离心后中间白色的pbmc层吸出，在新的50ml离心管中加入30ml左右pbs清洗，1500rpm，8min；f细胞计数；g配制细胞悬液：用gt-t551h3培养基重悬细胞沉淀，配制成细胞浓度为1x10⁶cells/ml的悬液20ml，混匀；h清洗培养瓶：取出包被过的培养瓶，弃包被液，6mlpbs洗一次，然后再用6ml培养基洗一次；i接种细胞：将20ml细胞悬液加入培养瓶，另外再加入2.2ml的自体血浆，终浓度10％。il-2(1000iu/ml)11μl，终浓度为500iu/ml，37℃，5％co2培养；

3)扩大培养：接种后的细胞在培养到第3天时，补充培养基gt-t551h340ml和终浓度为200iu/ml的il-2，37℃，5％co2培养，细胞浓度维持在5x10⁵cells/ml左右；

4)二次刺激：第五天，平分转入两个透气的细胞培养袋中继续培养，每个添加培养基gt-t551h370ml，添加il-2(1000iu/ml)20μl，il-15(1μg/ml)5μl，37℃，5％co2培养；

5)扩大培养：第七天，每袋添加培养基gt-t551h3300ml，il-2(1000iu/ml)80μl，37℃，5％co2培养；第九天，每袋添加培养基gt-t551h3350ml，il-2(1000iu/ml)150μl，37℃，5％co2培养；第十一天，每袋添加培养基gt-t551h3350ml，il-2(1000iu/ml)220μl，37℃，5％co2培养；第十三天，每袋添加培养基gt-t551h3500ml，il-2(1000iu/ml)320μl，37℃，5％co2培养；

6)收获细胞：在培养的第17天，取1毫升的细胞悬液进行细胞计数和流式检测，计算nk细胞的增殖倍数和纯度。离心收集全部培养所得细胞。

检测结果表明第17天nk细胞的纯度为94.55％，细胞扩增倍数为455倍，最后收获细胞量为9.1x10⁹个。

按照上述步骤，重复实验7次，pbmcs细胞增殖倍数的平均值为400倍，nk细胞比例占85％以上，最高比例达94.55％。

实施例2

为了验证较低和较高浓度细胞因子组合是否会影响nk细胞的增殖及其纯度，本实验设置了两组实施例，第一组实施例2中nk细胞诱导培养过程cd3单抗，cd16单抗，cd56单抗浓度不同与实施例1，实施例2中使用的为组合中的较低浓度，其中cd3单抗的终浓度为1ng/ml，cd16单抗的浓度为终5μg/ml，cd56单抗的终浓度为5μg/ml。第二组实施例3中nk细胞诱导培养过程cd3单抗，cd16单抗，cd56单抗浓度也不同与实施例1，实施例3中使用的为组合中的较高浓度，实施例3中cd3单抗的浓度为100ng/ml，cd16单抗的浓度为20μg/ml，cd56单抗的浓度为20μg/ml。

对比例1

为了观察本发明的nk细胞扩增效果，设计了一下3组对比实验。

对比例1按照专利nk细胞培养液和细胞培养方法，专利号：201610905270.6的培养方法培养nk细胞。

对比例2

按照专利一种nk细胞的制备方法，专利号：201610633811.4，的培养方法培养nk细胞。

对比例3

按照专利一种体外扩增nk细胞的方法及其获得的nk细胞，专利号：201610331306.4的培养方法培养nk细胞。

细胞扩增实验

分别对实施例1-2和对比例1-3培养第5天，第9天，第13天和第17天的细胞进行细胞扩增倍数统计，绘制细胞增殖曲线，结果见图1。

结论：本发明实施例1的nk细胞扩增倍数相较实施例2,3和对比例1,3更高，细胞增殖更快。

nk细胞比例实验

分别对实施例1-2和对比例1-3培养的第17天的细胞进行流式检测，统计nk细胞比例，结果见图2。

结论：本发明实施例1的nk细胞比率较实施例2,3和对比例1-3的更高，nk细胞纯度更好。

本发明所制备nk细胞在培养第17天时，纯度达到85％以上，增殖倍数超过400倍，是单纯细胞因子刺激扩增倍数的200％以上；操作简单，没有引入饲养细胞污染，且不需要对nk细胞进行纯化，节约成本，满足临床需求。

以上实施例是对本发明详细描述，但其只是作为范例，且不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何等同修改，替换，改进等，均包含在本发明的保护范围之内。