具有因子Xa衍生物的组织因子途径抑制剂的抑制的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用 本申请根据35U.S.C. 119(e)要求2013年1月24日提交的美国临时申请号 61/756, 359的权益，所述临时申请的内容以引用的方式整体并入本文。
技术领域
[0002] 本公开涉及通过抑制组织因子途径抑制剂（TFPI)来治疗出血病症的方法。
[0003] 背景 止血过程依赖于复杂的凝血级联，其中由凝血因子介导的一系列事件导致凝血酶原转 化成凝血酶。因子X(fX)活化是凝血级联的内在和外在途径的关键事件。已提议将外在 途径作为凝血级联的主要活化剂。当血管受损时，暴露的组织因子（TF)与活化的因子VII (fVIIa)相互作用以形成"外在复合物"，其介导fX的活化。凝血级联通过内在途径放大，在 此期间因子XII、XI、IX以及VIII的连续活化导致同样介导fX活化的"内在"fIXa-fVIIIa 复合物的形成。活化的fX促进凝血酶形成，其是身体产生纤维蛋白和有效地抑制出血所需 的。
[0004] 出血病症如血友病是由血液凝血级联的破坏所致。血友病A，最常见的血友病类 型，是由因子VIII的缺乏引起，而血友病B与因子IX(flX)的缺乏有关。目前对于血友病 及其他凝血疾病没有治愈方法。因子置换疗法是对于血液凝结病症最常见的治疗。然而， 凝血因子通常在施用之后不久就会从血流中清除。为了达到效果，患者必须接受来源于血 浆或重组因子浓缩物的频繁静脉内输注，这不舒服，需要临床环境，昂贵而且费时。另外，因 子置换疗法的治疗效能一旦抑制性抗体形成便会急剧降低。
[0005] 组织因子途径抑制剂（TFPI)是一种内源性蛋白酶抑制剂，其调节血液凝结的外 在途径。TFPI含有三个Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域，第二Kunitz结构域是fXa的直接 抑制剂。负反馈机制的调节涉及最初形成的fXa-TFPI复合物，其又使用第一Kunitz结构 域以结合至fVIIa/TF复合物并且进一步阻止因子X的活化。因此，调节TFPI功能可为血 友病病症提供一种替代治疗。事实上，已经公开了通过利用RNA适体、非抗凝的硫酸多糖 (NASP)、mAb抑制TFPI功能来治疗血友病的几种方法。
【发明内容】
[0006] 在一个实施方案中，本公开提供一种用于在有需要的受试者中治疗出血病症的方 法，其包括对所述受试者施用有效量的多肽因子Xa(fXa)衍生物，所述衍生物（a)包含在 活性位点处含有修饰的fXa重链，以及（b)不包含轻链或含有Gla-缺乏或脱-GlafXa轻 链。在一些方面，所述出血病症选自由以下各项组成的组：血友病A、血友病B、冯威勒布兰 特（vWF)病、因子XII缺乏及其组合。
[0007] 在一个实施方案中，还提供一种用于改善有需要的受试者中的血液凝结的方法， 其包括对所述受试者施用有效量的多肽因子Xa(fXa)衍生物，所述衍生物（a)包含在活性 位点处含有修饰的fXa重链，以及（b)不包含轻链或含有Gla-缺乏或脱-GlafXa轻链。
[0008] 本公开的另一实施方案提供一种用于降低有需要的受试者中的循环组织因子途 径抑制剂（TFPI)的浓度的方法，其包括对所述受试者施用有效量的多肽因子Xa(fXa)衍生 物，所述衍生物（a)包含在活性位点处含有修饰的fXa重链，以及（b)不包含轻链或含有 Gla-缺乏或脱-GlafXa轻链。
[0009] 在一些方面，所述受试者患有出血病症。一方面，所述受试者经历或有经历出血发 作的风险。
[0010] 在一些方面，在活性位点处的修饰包括用脱水丙氨酸或丙氨酸取代Ser379。在一 些方面，所述修饰包括用丙氨酸取代His236和/或用丙氨酸或天冬酰胺取代Asp282。
[0011] 在一些方面，fXa重链还包含在氨基酸位置Arg306、Glu310、Arg347、Lys351、 Lys414或Arg424处的至少一个氨基酸取代。
[0012] 在一些方面，所述多肽包含在轻链与重链之间的肽接头。在一些方面，所述多肽为 双链多肽。
[0013] 在一些方面，所述多肽包含氨基酸序列SEQIDN0. 3或7、或与SEQIDN0. 3或7 具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽（a)与野生型因子Xa相比具有降低 的促凝血活性并且（b)不组装成凝血酶原酶复合物。
[0014] 在所公开方法的一个方面，所述方法还包括对所述受试者施用选自由以下各项组 成的组的试剂：BAX499、ARC19499、mAb2021、NASP及其组合。一方面，所述方法还包括对所 述受试者施用重组fVIII或fIX。在一些方面，所述衍生物与能够延长衍生物的循环半衰期 的部分缀合。
[0015] 附图简述 附图是作为本公开的实施方案而提供，其是通过例证来说明而非限制，其中： 图1A-D示出了fXa衍生物（SEQIDN0:3)以亚纳米分子亲和力结合至组织因子途径 抑制剂（TFPI)。TFPI的存在剂量依赖性地降低了因子Xa(fXa)的活性（图1A) ;fXa活性 的TFPI抑制通过提高fXa衍生物的浓度来逆转，对于fXa的两个不同浓度（0. 5和1nM) (图1B)以及对于TFPI的两个不同浓度（1和4nM)(图1C);用不同浓度的TFPI和fXa衍 生物来研究抑制动力学（图1D); 图2示出fXa衍生物（SEQIDN0:3)在fVIIa-TF/PCPS存在下对TFPI介导的fXa抑 制的作用； 图3示出TFPI或fXa衍生物（SEQIDN0:3)对fVIIa/TF活性的作用，如通过fXa形 成所测量； 图4A-B示出fXa衍生物（SEQIDN0:3)在TFPI存在下对fVIIa/TF的fX活化的作用； (A)在增加浓度的fXa衍生物存在下fXa形成的代表性进展曲线。（B)在TFPI不存在和存 在下孵育15分钟之后（在图A中的最后数据点）随fXa衍生物浓度的而变化的因子Xa形 成； 图5示出在人血浆或含有37. 5nMEGR-fXa的人血浆中fXa衍生物（SEQIDN0:3)对 凝血酶产生的作用。fXa衍生物对凝血酶产生的作用可在EGR-fXa(-种用于凝血酶原酶复 合物的fXa的竞争性抑制剂）的背景下观察到；以及 图6示出fXa衍生物（SEQIDN0: 3)在正常人血浆或fIX免疫去除的人血浆中对由 低TF(10pMTF)引发的凝血酶产生的作用。由于在这些实验中相对标准测定条件来说使 用较低浓度的TF，所以添加PCPS以维持磷脂浓度。fXa衍生物对凝血酶形成的作用可在正 常的血浆和fix缺乏的血浆中观察。
[0016] 详述 I.定义 所有数字表示，例如，pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，是以0. 1的增量来（+) 或（_)变化的近似值。尽管不总是明确地陈述，但是应当理解所有数字表示的前面都加了 术语"约"。尽管不总是明确地陈述，但是还应当理解本文描述的试剂仅是示例性的，并且所 述试剂的等效物是本领域已知的。
[0017] 除非上下文另外明确规定，否则如在本说明书和权利要求书中所用，单数形式 "一"和"所述"包括复数个提及物。例如，术语"药学上可接受的载体"包括多个药学上可 接受的载体，包括其混合物。
[0018] 如本文所用，术语"包含"意图是指组合物和方法包括所述要素，但不排除其他要 素。"基本上由……组成"在用于定义组合物和方法时将意味着排除对于针对预定用途的 组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本由本文定义的要素构成的组合物应当不排 除来自分离和纯化方法的痕量杂质和药物上可接受的载体，如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等 等。"由…组成"意味着排除对于施用本公开组合物的其他超过微量成分的元素，及实质性 的方法步骤。由这些过渡术语各自定义的实施方案在本发明的范围内。
[0019] "出血病症"是指具有降低至消失的形成血凝块能力的受试者的疾病或病况。凝血 在组织损伤的情况下是需要的因此减少的凝结状况可威到胁生命。出血病症的非限制性实 例包括血友病A、血友病B、冯威勒布兰特（vWF)病、因子XII缺乏症或及其组合。在一些方 面，具有出血病症的受试者没有经历抗凝血疗法。在一些方面，具有出血病症的受试者没有 接受因子Xa抑制剂的施用。
[0020] "组合物"意图是指活性剂与另一惰性（例如可检测的试剂或标记）或活性（如助 剂）化合物或组合物的组合。
[0021] "药物组合物"意在包括活性剂与惰性或活性载体的组合，从而使该组合物适于体 内或体外或离体的诊断或治疗用途。
[0022] 术语"蛋白质"和"多肽"可互换使用，并且在其最广泛的意义下，是指两个或更多 个亚单位氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚单位可通过肽键连接。在另一实 施方案中，亚单位可通过其他键连接，如酯、醚、氨基，等等。蛋白质或肽必须含有至少两种 氨基酸并且对于可构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目没有设限。如本文所用的术语 "氨基酸"是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸及D和L光学异构体、氨基酸 类似物和肽模拟物。
[0023] 无需明确叙述并且除非另有规定，否则可推断当本公开涉及一种多肽、蛋白质、多 核苷酸或抗体时，这类物质的等效物或生物等效物意欲在本公开的范围之内。如本文所用 的术语"其生物等效物"在涉及参考蛋白质、抗体、多肽或核酸时，意欲与"其等效物"同义， 希望那些物质具有最小同源性，同时仍保持所需结构或功能。在替代实施方案中，术语多核 苷酸的"生物等效物"是指在严格条件下与参考多核苷酸或其补体杂交的物质。除非本文 中具体叙述，否则预期本文提及的任何多核苷酸、多肽或蛋白质也包括其等效物。例如，等 效物意指至少约80%同源性或同一性并且替代地至少约85%或者至少约90%，