a-Aldrich公司生产货号：T5648_1G
[0037] PBS由KH2P04，Na2HP04，NaCl，KCl粉末用超纯水配制，粉末均为Sigma公司生产；
[0038] DMSO为索来宝公司生产，细胞培养级别，货号：D8371规格50ml/瓶；
[0039] 4%多聚甲醛为索莱宝公司生产，货号：P1110规格500ml/瓶；
[0040] TritonX-IOO为索莱宝公司生产货号T8200规格IOOrnl/瓶；
[0041] Tween-20为索莱宝公司生产货号：T8220规格IOOrnl;
[0042]仪器：HighScreeningAssay(Operetta)在PerkinElmer公司购买；
[0043] C02培养箱IL-161HI为STIK公司生产；
[0044] 可调速可定时漩涡混合器（SI-T256)
[0045] 电热式恒温水浴锅为天津欧诺仪器公司生产；
[0046] 移液枪为Eppendorf公司生产；
[0047] 尼康ECLIPSETi-U倒置生物显微镜
[0048] I. 6R台式多用离心机为Thermo公司生产；
[0049] 制水机为美国密理博Milli-QCentury超纯水系统，型号为 Milli-QAcademic,Milli-QGrandient,Milli-QBiocel,Milli-QSynthesis；
[0050] 4°C海尔冰箱；
[0051] -20 °C海尔冰箱；
[0052]样品配制：用称取的样品质量m除以该样品的相对分子质量M，得到该样品的物质 的量n，然后加入10*n体积的DMSO,得到10 1Hi0VL的初始浓度。取IOul体积的10 1Hi0VL的 药物，用DMSO稀释至IOOul，得到浓度为10 2mol/L浓度的药物，以此类推，稀释至10 4m〇l/ L，分装为IOul每管，-20°C保存。
[0053] 采用间接免疫荧光的方法筛选能够选择性激活雌激素受体入核的化合物。
[0054] 1、细胞及其培养
[0055]MCF-7 细胞（ATCC?Number:HTB-22?)购自ATCC并由本室传代培养；MCF-7 细 胞在37°C，5%C02的细胞培养箱中，用10%FBS/DMEM(4500mg/LD-葡萄糖、L-谷氨酰和 110mg/L丙酮酸钠，lOOU/ml青霉素，100yg/ml链霉素）培养。
[0056] 2、核迀移实验步骤
[0057] 在37°C，5% 0)2的条件下，在细胞培养箱中使用含有10%活性炭吸附的胎牛血清 和1 %双抗的无酚红DMEM/F12培养液培养MCF-7细胞。72h后，细胞密度为80 %左右，将 细胞按7000/孔的密度铺于96孔黑板中，中间60孔为实验孔，每孔中加入含1 %活性炭吸 附的血清及1 %双抗的无酚红DMEM/F12培养液IOOul，周围孔用100mLPBS填充，培养过夜， 待细胞完全贴壁。用无酚红DMEM/F12培基稀释药品（药品是用DMSO稀释至10 4M,分装保 存于-20°C冰箱）至10 7M。96孔板中实验孔每孔IOOul浓度10 7M的药物溶液，阳性药为 他莫昔芬，空白对照加入含有1%。DMSO的无酚红DMEM/F12培养基，每种药物设三个复孔。 给药完成后，在37°C，5%CO2的条件下孵育半小时，用4%的多聚甲醛固定细胞半小时（室 温）。用PBS洗细胞三遍，每孔200ul，每遍一分钟。加入0. 2 %的TritonX-IOO打孔半小 时（室温），用PBS洗细胞三遍，每孔200ul，每遍一分钟。加入5 %的胎牛血清（Hyclone小 牛血清，用PBS稀释）封闭2小时（室温），加入一抗（0? 01 %Tween-20+0. 5%Hyclone胎 牛血清+1 %-抗+PBS，一抗为ERa)，4°C孵育过夜，PBST(PBS+0. 05 %Tween-20)洗细胞三 遍，每孔200ul，每遍5分钟，然后再用PBS洗三遍，每孔200ul，每遍一分钟。避光加入二 抗（0? 01 %Tween-20+0. 5%Hyclone胎牛血清+万分之一的Hochest+二百分之一的二抗 +PBS，二抗为Alex488，），室温孵育两小时。PBST(PBS+0. 05%Tween-20)洗细胞三遍，每孔 200ul,每遍5分钟，然后再用PBS洗三遍，每孔200ul,每遍一分钟，最后孔内加入lOOulPBS 上高内涵。高内涵拍照完成后，用高内涵自动处理数据，即得核内的荧光值比细胞质内的荧 光值，取三个空的平均值。用Graphpad作图，SPSS处理数据，确定药物组与空白组对比是 否有统计学意义。
[0058] 实验结果为：2, 3, 4, 6, 7-五甲氧基-菲的ERa(核内荧光值/胞质荧光值）为 (1. 〇27384)，具有显著性差异（p〈0. 001)
[0059] 从上述的活性实验可以看出，从淫羊藿中分离出的化合物2, 3, 4, 6, 7-五甲氧 基-菲能够与雌激素受体ERa结合，提高其转录活性，证实了化合物2, 3, 4, 6, 7-五甲氧 基-菲具有雌激素样作用。因此，可用于防治更年期综合征、绝经后骨质疏松症、乳腺癌、子 宫癌、前列腺癌和结肠癌，且其药理作用在心血管系统、生殖系统和免疫调节等领域得到扩 展。
[0060] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在 本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围 内。
【主权项】
1. 通式（I)的化合物在制备用于治疗和/或预防雌激素相关性疾病的药物中的用 途；其中，R代表氢、C1-C4烷基、C「C4烷氧基或C2-C4烯基。2. 如权利要求1所述通式（I)的化合物的用途，其中，R代表氢或(^-(：4烷氧基。3. 如权利要求1所述通式（I)的化合物的用途，其中，R代表甲氧基。4. 如权利要求1-3中任一权利要求所述的通式（I)的化合物的用途，其中，所述雌激 素相关性疾病为：由雌激素水平低于正常水平而引起的疾病。5. 如权利要求4所述通式（I)的化合物的用途，其中，所述由雌激素水平低于正常水 平而引起的疾病包括：女性更年期综合征、前列腺癌、骨质疏松症和心血管疾病。6. 如权利要求1-3中任一权利要求所述通式（I)的化合物的用途，其中，所述雌激素 相关性疾病为：由雌激素水平高于正常水平而引起的疾病。7. 如权利要求6所述通式（I)的化合物的用途，其中，所述由雌激素水平高于正常水 平而引起的疾病，包括：乳腺增生、子宫肌瘤。8. -种包含如权利要求1-3所述的通式（I)的化合物的淫羊藿提取物。
【专利摘要】本发明实施例提供了如通式(Ⅰ)的化合物在制备用于治疗和/或预防雌激素相关性疾病的药物中的用途；本发明实施例还提供了通式(Ⅰ)的化合物及包含通式(Ⅰ)的化合物的淫羊藿提取物。
【IPC分类】A61P15/12, A61K31/09, A61P35/00, A61P15/14, A61P19/10, A61P9/00, A61P15/00, A61K36/296
【公开号】CN105030738
【申请号】CN201510355520
【发明人】高秀梅, 王彧, 苗琳, 朱彦, 王雪妮, 刘二伟, 韩立峰, 张祎, 王虹
【申请人】天津中医药大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月24日