用于诱导细胞自噬的方法及组成物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明关于在患有细胞自噬（autophagy)缺陷的个体诱导细胞自噬的方法，特别 是一种通过对个体投予灵芝萃取物而用于在患有细胞自噬缺陷的个体中诱导细胞自噬的 方法。
【背景技术】
[0002] 细胞自嗤（autophagy)或称"自体消化过程（selfdigestionprocess) "，为一 种重要的生理过程，其靶向细胞质中的成分，诸如要于溶酶体中降解的蛋白质、蛋白质聚集 体（aggregates)和胞器。细胞自噬过程对于维持神经恒定性也是必要的，且其功能失调 (dysfunction)与多种疾病有直接关联。
[0003] 当细胞处在饥饿状态时，细胞自噬的目的在于回收细胞内营养物质來維持细胞代 谢，而当细胞处于压力时，细胞自噬也能将累积的损坏胞器和蛋白质清除。
[0004] 细胞自噬的缺陷是多种疾病的主要成因，这些疾病可以是，但不限于：神经 退行性疾病、肝脏疾病和癌症。许多人类神经退行性疾病与异常突变和/或泛素蛋白 (polyubiquitinatedprotein)的累积以及过度的神经细胞死亡有关。
[0005] 神经生长因子（Nervegrowthfactor,NGF)于1951年被分离出来，且其为是 第一个被分离出来的神经滋养因子。在发育过程及成熟动物个体中，NGF是由星状细胞 (astrocytes)分泌，且对于神经突触可塑性以及建立有功能的神经回路亦扮演重要的角 色。内生性的NGF对于前脑负责学习记忆的胆碱神经元的存活及功能的重要性亦被证实， 此种神经滋养因子的部分去除与可量测的学习和记忆缺陷相关。
[0006] 在许多动物模式中，NGF已显示具有潜在的神经保护效果。此外，在大鼠中，NGF 能保护对抗諸如3-NP和MPTP的线粒体毒素所引起的神经元死亡。因此，在神经退行性 疾病的治疗的药理应用中，NGF被认为扮演关键的角色。然而，NGF的获取受到血脑障壁 (blood-brainbarrier)的限制，且当经由周边投药时又易被代谢掉；因此，使用时它只能 被直接注入至脑部。当NGF经由脑室注射时，其与许多的副作用相关联，因而使该传递途径 不实用。因此，对于神经退行性疾病，调控内生性NGF表达可能是一种崭新的治療策略。
[0007] 神经退行泛指神经元的功能或结构渐进式的丧失。许多神经退行性疾病，包括帕 金森氏症（Parkinson'sdisease,F*D)、阿兹海默症（Alzheimer'sdisease,AD)、亨丁顿氏 舞蹈症（Huntington'sdisease,HD)和肌萎缩性脊髓侧索硬化症（amyotrophiclateral sclerosis，ALS)都是因神经退行的过程所造成。最近，许多神经退行性疾病的类似疾病被 发现，这些疾病彼此之间都有些关联。举例来说，有些神经退行性疾病与错误折叠的蛋白质 的不正常堆积有关，其亦被称为非典型的蛋白质集结（atypicalproteinassemblies)。
[0008] 亨丁顿氏舞蹈症（HD)是一种常染色体显性的神经退行性疾病，其由亨丁顿 (huntingtin,Htt)基因的外显子l(exon1)上CAG三核苷酸重复序列的异常扩张所导 致。HD的主要特征是HD实验动物及病患脑中受影响的纹状体神经元的突变亨丁顿蛋白 Htt(mHtt)聚集体的形成。Htt基因的多谷氨酰胺（polyglutamine，polyQ)延伸大于37个 谷氨酰胺的扩张或编码该polyQ延伸的短N-端片段就足以造成小鼠或该疾病的细胞模型 中的聚集体形成。
[0009] 灵芝（Ganodermalucidum)是亚洲地区使用广泛且歷史悠久的药用植物（真 菌）之一。已有许多研究探讨灵芝在疾病治療上的应用。灵芝的最重要药理活性小 分子成分是三萜类（triterpenoids)，其被报导具有肝脏保护、抗高血压、降胆固醇 (hypocholesterolemic)、抗组织胺（anti-histaminic)、抗癌以及抗血管新生活性。然而， 其增进智能的特性尚未被充分研究。
【发明内容】
[0010] 在一方面，本发明提供一种在患有细胞自噬缺陷的个体中诱导细胞自噬的方法。 根据本发明，该方法包含对该个体投予治疗有效量的灵芝萃取物，其中，该细胞自噬增进该 个体中的蛋白质聚集体的清除。
[0011] 在本发明的一具体实施例中，该细胞自噬缺陷是在该个体的细胞，其表达蛋白质 聚集体，且其中该細胞是神经细胞或神经胶质细胞。在本发明的一具体实施例中，该蛋白质 聚集体是选自下列所组成的群组的聚集体：亨丁顿蛋白、淀粉样蛋白0、a-突触核蛋白、 T蛋白、超氧化物歧化酶1、其变异体和突变形式以及其组合。
[0012] 在本发明的一具体实施例中，该细胞自噬缺陷为选自于由神经退行性疾病、克隆 氏症（Crohn'sdisease)、老化、心脏疾病和肝脏疾病所组成的群组的疾病。在本发明的一 具体实施例中，该神经退行性疾病选自于由亨丁顿氏舞蹈症、阿兹海默症、帕金森氏症、肌 萎缩性脊髓侧索硬化症和致死性家族性失眠症所组成的群组。
[0013] 根据本发明，该灵芝萃取物是经由口服投予至该个体。
[0014] 另一方面，本发明提供一种用于在患有细胞自噬缺陷的个体中活化神经生长因子 (NGF)的方法，其中，该神经生长因子可活化个体的细胞自噬，且其中该细胞自噬可增进个 体的蛋白质聚集体的清除。根据本发明，该方法包含对该个体投予治疗有效量的灵芝萃取 物。
[0015] 在本发明的一具体实施例中，该细胞自噬缺陷是在该个体的细胞，其表达蛋白质 聚集体。
[0016] 在本发明的一具体实施例中，该蛋白质聚集体是亨丁顿蛋白、淀粉样蛋白3、 a-突触核蛋白、t蛋白、超氧化物歧化酶1、其变异体和突变形式以及其组合中的一种或 多种。
[0017] 另一方面，本发明提供一种用于预防个体记忆丧失的方法。根据本发明，该方法包 含对该个体投予治疗有效量的灵芝萃取物，其中，该灵芝萃取物可活化该个体的细胞自噬。
[0018] 在本发明的一具体实施例中，该灵芝萃取物诱导神经生长因子（NGF)以活化该个 体的细胞自噬。在本发明的一具体实施例中，该细胞自噬可增进个体的蛋白质聚集体的清 除。
[0019] 根据本发明，该个体患有细胞自噬缺陷。在本发明的一具体实施例中，该细胞自噬 缺陷为选自于由亨丁顿氏舞蹈症、阿兹海默症、帕金森氏症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症和致 死性家族性失眠症所组成的群组神经退行性疾病
[0020]另一方面，本发明提供一种在患有细胞自噬缺陷的个体中诱导细胞自噬的组合 物，其中，该方法包含灵芝酸和医药上可接受的载剂。在本发明的一具体实施例中，该灵芝 酸是一种或多种选自于由灵芝酸C2、灵芝酸A、灵芝酸H、灵芝烯酸D、灵芝酸D和12-乙酰 氧基灵芝酸F所组成的群组的灵芝酸。
【附图说明】
[0021] 灵芝（Ganodermalucidum)在说明书及附图中缩写为GaLu。图1A至1E显示神 经生长因子（NGF)对表达mHtt-74Q的PC12细胞模型的影响。（A)经NGF处里后的细胞的 荧光平均强度（FMI)比。直方图表示在两次独立实验中测得的FMI的量化（n= 6)。（B) 在表达mHtt-74Q并经50ng/ml的NGF处理的细胞中，荧光分布向左移，代表聚集体减少。X 轴代表测得的绿色荧光幅度，而呈荧光程度绘制的Y轴代表细胞数。数值以平均标准偏差 (mean土SD)方式表示（#P〈0. 01 为与未经Dox处理（NoDox)相比；而 #P〈0. 05、##P〈0. 01 为与经Dox处理（Dox)相比）。（C)NGF促进自嗤小体（autophagosome)的形成，并可促进 mHtt的降解。利用MDC染色以检视细胞内表达自体吞噬泡。在经NGF处理的细胞中可见 MDC染色后的荧光强度增加。白色箭头代表在经NGF处理的细胞中的MDC与EGFP的影像重 迭（co-localization)，而黄色箭头代表在经Dox处理的细胞中的EGFP聚集体和经MDC染 色的点状荧光影像。在Dox细胞中有稀少的EGFP与MDC的影像重迭。（比例尺为10微米 (ym))。（D)MDC染色的量化结果。与控制组（noDox)相比，结果为每细胞中所含的点状 荧光影像。（E)以西方墨点法检视在不同条件下LC3-I与LC3-II的蛋白质浓度（以200nM 的雷帕霉素（Rapamycin)诱导细胞自噬作为正控制组）（n= 3) /P〈0. 05, #P〈0. 01为与No Dox相比，而#P〈0. 05广P〈0. 01为与Dox相比。
[0022] 图2A至2G显示灵芝（GaLu)(为星状细胞NGF诱导物）在PC12细胞中调节粒腺 体的生体合成（biogenesis)与在HD细胞模型中减缓mHtt所诱导的损害。分析初级星状 细胞经GaLu处理六小时的mRNA表达量（A)或二十四小时的蛋白质表达量（B)。（C)显示 NGF于星状细胞经GaLu(GaLu-ACM)处理二十四小时所收集的二十倍浓缩细胞培养液的西 方墨点图示。（D)利用流式细胞仪分析以GaLu-ACM抑制mHtt-74Q聚集体。直方图表示在 两次独立实验中测得的FMI的量化（n= 6)。（E)在表达mHtt-74Q并经100iig/ml的GaLu 处理的细胞中，荧光分布向左移，代表聚集体数目减少。（F)GaLu增加MDC强度。白色箭头 所指为经GaLu处理的细胞有MDC和EGFP的影像重迭。（比例尺为10微米）。与未经处 理的控制组（noDox)相比，将每细胞的点状荧光影像区进行MDC的量化。（G)显示利用西 方墨点法观察LC3-I和LC3-II在每个条件下的蛋白质表达浓度。（使用200nM的雷帕霉 素处理作为诱导细胞自噬的正控制组）（n= 3)。乍〈0. 05，，〈0. 01为与NoDox相比，而 #P〈0. 05, ##P〈0. 01 为与Dox相比。
[0023] 图3显示灵芝萃取物在初级星状细胞中专一性的增加NGFmRNA的表达量。星状细 胞经灵芝萃取物处理6小时后进行RT-PCR，分析神经滋养因子（NGF,IGF-1，bFGF和BDNF) 的表达。
[0024] 图4A至4C显示星状细胞NGF诱导物（灵芝萃取物）在PC12细胞中诱导神经突 触的生长。所使用的培养液为经灵芝（GaLu-ACM)处理或未经灵芝处理24小时后的初级星 状细胞培养液。将PC12细胞以GaLu-ACM或NGF处理后收集。
[0025] 图5A至5J显示区分来自灵芝粗萃物的