态分布资料 用均数土标准差（J土S )表示，行单因素方差分析，组间比较采用LSD检验或S-N-K检 验；非正态分布资料以中位数（M)表示，行非参数检验，采用Kruskal-WallisH检验和 Mann-WhitneyU检验，检验结果均以P< 0. 05有统计学意义。
[0106] 四、试验结果
[0107]1、小鼠一般状况及肿瘤大小、体重的监测
[0108] 抑瘤实验开始时，所有动物给予自由饮食、饮水，每天观察动物活动、毛发及其他 一般状况，每周测量1次肿瘤长、短径及动物体重，肿瘤大小的估计采用公式V=ab2/2,a、 b分别代表肿瘤的长径和与之垂直的短径。
[0109] 试验结果：
[0110](1)小鼠一般状况的观察：所有小鼠接种4T1乳腺癌细胞株后7天均可触及皮下 瘤结节，成瘤率100 %，开始时小鼠精神好，活动状态无明显变化，开始时肿瘤多为圆形或椭 圆形，大小均一，后期药物干预后种植瘤开始逐渐不规则，且大小不一。开始抑瘤时5组小 鼠体重及种植瘤体积之间比较无统计学意义（P> 0.05)。3周后荷瘤小鼠开始出现颈背部 皮毛毛糙，毛色发暗，稀疏，活动迟缓，消瘦，药物干预后期B、C、D及E组小鼠主动摄食较A 组少，考虑为化疗毒副反应所致。处死前5组小鼠肉眼观察一般状况均无明显差别。处死 时小鼠各组小鼠体重均服从正态分布，各组小鼠体重用均数土标准差表示。结果见下表： [0川]表1小鼠体重的变化（，N= 8,单位：g)
[0112]
[0113] 结果可见，所有药物干预组小鼠体重均较A组为轻，但只有D组、E组与A组比较 有统计学差异（P〈〇. 05)，虽然B组、C组小鼠体重较D组为重，但组间比较无统计学差异（P > 0. 05)。从给药3周期间小鼠体重变化可看出B组及A组体重有上升趋势，D组下降趋势 明显，E组也有下降趋势，但下降趋势较D组不明显。
[0114] (2)荷瘤小鼠种植瘤大小的比较：各组小鼠种植瘤体积均服从正态分布，用均数 土标准差表示。所有药物干预组小鼠种植瘤体积较A组为小，差异均有统计学意义（P均 〈0. 05) ;C组与D组均较E组种植瘤体积为小，差异无统计学意义（P均> 0. 05)，B组种植 瘤体积与E组相当，差异无统计学意义（P>0. 05)。从小鼠种植瘤生长曲线（见附图2)可 以看出A组小鼠种植瘤生长迅速，生长曲线较陡直；B组、C组、D组及E组小鼠肿瘤在治疗 初期肿瘤生长较迅速，后期肿瘤生长延缓，且四线几乎重叠。
[0115] 表2的小鼠模型植入肿瘤体积的变化（？土5 ,N= 8,单位：mm3)
[0116]
[0117] 2、应用Pearlimager成像系统检测种植瘤荧光密度值
[0118] 处死小鼠前2天，用氯胺酮将各组小鼠麻醉，然后尾静脉注射EGF荧光探针，然后 上机检测成像，选择channe为800nm时，小鼠全身发出绿色焚光，全身焚光均勾分布；然后 于24h后再次相同方法、条件下成像，荧光于种植瘤部位、肾脏、膀胱位置处较强，其他部位 荧光较弱；48h后，再次相同方法、条件下成像，可见小鼠荧光分布大部分集中于种植瘤部 位、膀胱位置（EGF探针经泌尿系统代谢排出体外，并非转移灶），其他部位荧光微弱；此时 认为EGF探针已代谢完全，只有种植瘤部位与其特异性结合，此时记录肿瘤荧光密度值。
[0119] 结果：各组小鼠种植瘤荧光密度值均服从正态分布，所有药物干预组小鼠种植瘤 荧光密度值较A组为低，差异均有有统计学意义（P均〈0.05) ;C组与D组均较E组为低，差 异有统计学意义（P均〈〇. 05)，B组虽低于D组，但差异无统计学意义（P> 0. 05)。
[0120] 表3中的小鼠模型的植入肿瘤荧光密集价值（[土s,N= 8)
[0121]
[0122] 5、小鼠标本的收集与观察指标的测定
[0123] 用药干预完3周后全部脱颈法处死小鼠，将肿瘤完整剥离，一部分肿瘤中性福尔 马林（10%)固定，用于HE染色；另一部分肿瘤固定于70%酒精，制备成单细胞悬液用于流 式细胞仪分析细胞凋亡率；
[0124] 将取出的小鼠新鲜双肺经生理盐水冲洗干净，体式显微镜下计数双肺表面转移灶 数目。体式显微镜下可见所有标本均有转移性结节，A组较多，结节色发白，圆形或椭圆形， 计数转移灶数目完毕后，然后将双肺固定于中性福尔马林（10% )中待染色备用。
[0125] 试验结果：
[0126] (1)将所有肿瘤标本及双肺结节进行HE染色：将所有肿瘤标本及双肺常规石蜡包 埋后，4-6um切片，HE染色，显微镜下证实肿瘤为乳腺浸润性癌，双肺结节证实为乳腺癌转 移。（2)荷瘤小鼠双肺转移灶数目的比较：小鼠双肺转移灶数目均服从正态分布，用均数土 标准差表示。通过统计学比较，所有药物干预组小鼠双肺转移灶数目较A组为低，差异均有 有统计学意义（P均〈0.05);B组与C组与较E组相当，差异无统计学意义（P均>0.05)，D 组低于E组，但差异有统计学意义（P〈0. 05)。
[0127] 表4小鼠模型的肺转移结节数（I士.v,N= 8)
[0128]
[0129]五、总结：本发明研究阿那曲唑外用制剂与乳腺癌晚期动物模型的抑瘤作用，国内 外鲜有报道。本实验采用鼠源4T1高侵袭细胞株接种BALB/C小鼠构建晚期转移性乳腺癌 模型，未用药物开始干预时肿瘤成长速度较一致，个体差异小，易于观察对照。
[0130] 本实验采用肿瘤体积大小和Pearlimager成像系统检测肿瘤荧光密度值来同时 评价药物抑瘤效果：两者结果一致，可信度较高。本实验无论从测量种植瘤体积大小或是评 价原位种植瘤荧光密度值，均得出一致的结果：阿那曲唑口服给药以及本发明的阿那曲唑 的三个剂量组（〇? 3mg/cm2、i. 〇mg/cm2、2. 〇mg/cm2)的贴片均有较好的抗肿瘤作用。
[0131] 本实验发现D组、E组小鼠体重较前减轻，余3组体重较前略有增加，通过观察小鼠 一般状况发现，D组和E组小鼠在治疗后期主动摄食较少，通过统计学比较，除D组、E组与 A组之间有统计学差异之外，其余组间比较均无统计学差异，证实阿那曲唑副作用反应程度 与给药量（B组=E组〈C组〈D组）成正比，而在同等剂量条件下，本发明的阿那曲唑外用 制剂的副作用较口服给药的副作用要轻。
【主权项】
1. 一种含有阿那曲唑的外用贴剂，其特征在于，所述外用贴剂的有效成分为阿那曲唑， 每平方厘米含阿那曲唑的量为0. 2~2. Omg，其中优选0. 3~1. Omg，更优选0. 3~0. 5mg ;所述外 用贴剂应用于人体皮肤的透皮量为每日0. 3~2. Omg，优选0. 3~1. 5 mg ;该贴剂一贴可以持 续透皮1~7天；所述外用贴剂可以为骨架型贴剂，也可以为储库型贴剂；所述的外用贴剂 还包括适量的医学上可接受的赋形剂。2. 根据权利要求1所述的阿那曲唑骨架型贴剂，其制备方法为：将阿那曲唑与适宜 的高分子黏性材料或压敏胶混合，涂于背衬材料上，加热烘干，再覆盖上保护层，按需要尺 寸切割，包装，即制成含阿那曲唑的骨架型透皮贴剂；其特征在于：阿那曲唑占外用贴剂的 4. 0%-25. 0%(W/W)，更优选 5. 0%~20. 0%(W/W)。3. 根据权利要求2所述的阿那曲唑骨架型贴剂，其特征在于：其中所述高分子黏性材 料或压敏胶，可以为丙烯酸压敏胶，也可以为有机硅类压敏胶，还可以为聚异丁烯压敏胶。4. 根据权利要求1所述的阿那曲唑储库型贴剂，其制备方法为：将阿那曲唑与适宜的 高分子材料或聚合物混合，形成药物贮库；另将胶黏剂涂布于保护层上，加热干燥，覆以控 释膜，制成复合膜材；调整复合膜材的控释膜面向上，将上述药物贮库置于控释膜上，覆以 背衬层，将药物贮库通过热合封闭于控释膜层与保护层之间，按需要尺寸切割，包装，即制 成含阿那曲唑的储库型透皮贴剂；其特征在于阿那曲唑占所述药物贮库的0. 5°/p30. 0%(W/ W)，更优选 〇? 5%~20. 0%(W/W)。5. 根据权利要求1至4之一所述的含有阿那曲唑的外用贴剂通过皮肤给药的新的给药 方法。6. 依照权利要求5所述，该新的给药方法用于治疗乳腺癌的用途。
【专利摘要】本发明涉及阿那曲唑的外用贴剂及其制备方法。该外用制剂以阿那曲唑为主药，用于治疗乳腺癌。本发明提供的阿那曲唑外用贴剂通过透皮吸收，释药均匀，作用温和而持久，一贴可连续使用七天。直接作用于皮肤，不通过胃肠道，避免了肝脏的首过效应，降低了不良反应并减少了不良反应的发生率。患者顺应性好，使用方便，携带方便。
【IPC分类】A61K31/4196, A61K9/70, A61P35/00
【公开号】CN105055379
【申请号】CN201510599979
【发明人】徐静, 张艳红, 杨洋, 徐光昳
【申请人】徐静, 哈尔滨健迪医药科技开发有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年9月19日