4-0032在斜面培养基中经斜面活化后转接到种子液体培养基中，30°C条件下，180rpm振荡培养24h，制得种子液；以3%的接种量，将种子液接于液体发酵培养基中，300C，180rpm振荡培养24h，离心收集菌体；
[0040]用发酵液体积30%去离子水重悬菌体，312nm紫外照射4h ；
[0041]离心收集菌体，冷冻干燥后粉碎，即为菌粉成品。
[0042]样品处理后，经HPLC检测，样品中VD含量高达732.97ug/g，即2931880IU/100g。
[0043](3)产品复配:将纳豆芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙配成益生菌制剂产品，纳豆芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙混合的比例按照有效成分质量比例配制，MK-7:VD:Ca2+= 100:5:160。
[0044]实施例2
[0045]产品复配步骤中，纳豆芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙混合的比例按照有效成分质量比例配制，MK-7:VD =Ca2+= 30:1:160。
[0046]其他步骤与实施例1相同。
[0047]实施例3
[0048]产品复配步骤中，纳豆芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙混合的比例按照有效成分质量比例配制，MK-7:VD =Ca2+= 300:10:160。
[0049]其他步骤与实施例1相同。
[0050]产品功效验证
[0051 ] 试验动物:Wistar大鼠，鼠龄6-8周，雌鼠
[0052]试验分组:将购买的大鼠分为7组，第I组，饲喂正常饲料，不做任何处理；第2组，维甲酸70mg/kg+生理盐水，灌胃；第3组，维甲酸+低剂量产品，灌胃；第4组，维甲酸+高剂量产品，灌胃；第5组，生理盐水，灌胃；第6组，生理盐水+低剂量产品，灌胃；第7组，生理盐水+高剂量产品，灌胃。
[0053]试验设计:根据VK2的人体每日摄入推荐量(RDA)，选择实施例1的产品，50ug/kg/d、500ug/kg/d两个用药剂量，分别为低低剂量、高剂量。大鼠购买进实验室首先适应饲喂I周，之后饲喂低钙饲料3周后，DEXA(双能X-线吸收仪)测量骨密度及骨矿物质含量。注射激素造模，同时灌胃产品3周，DEXA测量骨密度及骨矿物质含量，麻醉(戊巴比妥钠)，开膛心脏取血或者腹主动脉取血进行相关血液指标测定。
[0054]实验结果
[0055](I)大鼠体重变化
[0056]因维甲酸副作用导致大鼠死亡，因此2、3、4组灌胃维甲酸一周后停止维甲酸造模，只进行低钙饲喂造模。每天灌胃前称量大鼠体重，一周为一个单位，计算大鼠平均体重，研究6周内大鼠体重变化，结果如图1所示。
[0057]由图可以看出，前3周各组的大鼠体重保持增长，第4周开始，维甲酸造模组体重下降，在停止使用维甲酸后饲喂产品组体重开始增加，而且增长速度要比未饲喂产品组快。而其他低钙饲喂组大鼠的体重与空白对照组一样保持持续增长，说明灌胃产品不会对大鼠的正常生长产生影响。
[0058](2)骨矿含量(BMC)变化
[0059]饲喂产品前后分别使用DEXA(双能X-线吸收仪)测量各组大鼠骨矿物质含量。试验结束后各组大鼠骨矿含量如图2所示；饲喂产品前后大鼠骨矿含量增长情况如图3所示。
[0060]由图可以看出，低钙饲喂组的BMC显著低于空白对照组，说明低钙饲导致大鼠骨质疏松，而产品灌胃组第6组大鼠骨矿含量与空白组无差异，保持正常水平。在对6组、7组大鼠进行产品灌胃后，其BMC的增长量要显著高于未灌胃产品组即第5组，说明灌胃产品能显著增加大鼠的骨矿含量。
[0061]骨密度(BMD)变化
[0062]饲喂产品前后分别使用DEXA(双能X-线吸收仪)测量各组大鼠骨密度。试验结束后各组大鼠密度如图4所示；饲喂产品前后大鼠骨密度增长情况如图5所示。
[0063]由图可以看出，低钙饲喂导致大鼠的BMD显著降低，而在对6、7组大鼠进行K2产品灌胃后，相对于骨密度持续降低的第5组，6组、7组的骨密度显著增加。
[0064](3)血清中磷⑵和钙(Ca)的含量
[0065]试验结束后，用戊巴比妥钠麻醉各组存活大鼠，开膛心脏取血或者腹主动脉取血进行相关血液指标测定。血清中P和Ca含量分别如图6、图7所示。
[0066]由图可以看出，各实验组大鼠血清P含量差异不显著，而钙的的水平有差异，第4组和7组的大鼠的血清钙水平与正常组无差异，而显著高于低钙饲喂且无灌胃产品的对照组，说明产品能够促进机体对钙的吸收，补充机体钙的缺乏症状。实验结论
[0067]通过骨质疏松的关键指标:骨矿含量(BMC)、骨密度(BMD)可以看出通过向大鼠灌胃含VK2菌粉和VD等成分的复合产品，可以显著提高其骨矿含量(BMC)、骨密度(BMD)，改善大鼠的骨质疏松状况，对于促进钙吸收以及骨骼的正常代谢具有一定的作用。
[0068]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.防治骨质疏松的益生菌制剂，其特征在于:由以下方法制备所得: (1)纳豆芽孢杆菌菌粉的制备:冻存的纳豆芽孢杆菌种经活化后转接到种子液体培养基中，在35?45°C条件下，静置培养12?24h，制得种子液；以I?5%的接种量，将种子液接于液体发酵培养基中，35?45°C，100?180rpm培养12?24h，然后转至40?50°C条件下，静置培养5?7d ;发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，离心条件为5000?.10000rpm，5?15min，清洗2?3遍后冷冻干燥，粉碎，即为纳豆芽孢杆菌菌粉； (2)酿酒酵母的发酵生产:酿酒酵母在斜面培养基中经斜面活化后转接到种子液体培养基中，25?35°C条件下，120?200rpm振荡培养18?30h，制得种子液；以I?5%的接种量，将种子液接于液体发酵培养基中，25?35°C，120?200rpm振荡培养18?30h ； (3)酿酒酵母紫外照射:离心收集菌体，用发酵液体积30%去离子水重悬菌体，紫外照射2?4h ;紫外照射的波长为254?365nm ; (4)离心收集菌体，离心条件为5000?10000rpm，5?15min，冷冻干燥后粉碎，即为酿酒酵母菌菌粉；酿酒酵母菌菌粉中维生素D的含量不低于732.97ug/g ; (5)产品复配:将纳豆芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙配成益生菌制剂产品，纳豆芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙混合的比例按照有效成分质量比例配制，MK-7:VD:Ca2+= 30 ?300:1 ?10:160。2.根据权利要求1所述的防治骨质疏松的益生菌制剂，其特征在于:步骤(I)所述的种子液体培养基各成分质量含量为:葡萄糖0.2%，蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%，酵母膏0.5%，其余为蒸馏水，pH值7.0 ; 步骤(I)所述的液体发酵培养基各成分质量含量为:蛋白胨10%，丙三醇3 %、NaCl0.5%, K2HPO40.02%，其余为蒸馏水，ρΗ7.0-7.2。3.根据权利要求1所述的防治骨质疏松的益生菌制剂，其特征在于:步骤(2)所述的斜面培养基配各成分质量含量为:葡萄糖2 %，酵母膏0.5 %，蛋白胨I %，磷酸二氢钾.0.2%，琼脂粉1.5?2.0%，其余为蒸馏水； 步骤(2)所述的种子液体培养基及液体发酵培养基各成分质量含量为:葡萄糖2%，酵母膏0.5 %，蛋白胨I %，磷酸二氢钾0.2%，其余为蒸馏水。
【专利摘要】本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及防治骨质疏松的益生菌制剂由纳豆芽孢杆菌发酵培养后得到纳豆芽孢杆菌菌粉，酿酒酵母养基、紫外照射得到酿酒酵母菌菌粉；纳豆芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙配成。本发明提供的防治骨质疏松的益生菌制剂，以含天然维生素K2(MK-7)的有益菌为原料、同时含有维生素D和钙的安全绿色的防治骨质疏松的产品，能有效提高钙质的吸收，可以防治骨质疏松。CCTCC NO：M 201512320150318
【IPC分类】A61K31/59, A61P19/10, A61K33/10, A61K36/064, A61K35/742
【公开号】CN105055458
【申请号】CN201510330452
【发明人】单宝龙, 约克·杰克毕, 王静, 任宝涛, 张颜廷, 刘虹, 张化朋, 王丽春, 张云静
【申请人】山东凤凰生物有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年6月15日