防治骨质疏松的益生菌制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及防治骨质疏松的益生菌制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]骨质疏松(osteoporosis，0P)是以骨量减少和骨组织微结构退化(松质骨骨小梁变细、断裂数量减少，皮质骨多孔、变薄)为特征的，以致骨的脆性增高以及骨折危险增加的一种全身骨骼疾病。发病原因一般认为与钙及维生素缺乏、内分泌失调、营养失调以及运动和光照不足有关。该病女性多于男性，常见于绝经后妇女和老年人。随着我国老年人口的增加，骨质疏松症发病率处于上升趋势，在我国乃至全球都是一个值得关注的健康问题。
[0003]维生素D是激素前体，对维持血液中的正常的钙离子浓度和磷酸化水平至关重要。当人类的皮肤被阳光中的紫外线照射后，会产生足够多的维生素D。由于人生活方式的改变，很多成年人因为不能照射到足够的阳光，而无法产生出足够的VD。因此通过日常饮食来补充维生素D变得越来越重要了。
[0004]近年研究发现，防治骨质疏松不仅需要钙、维生素D，而且还需要维生素K，尤其是VK2。研究确认，维生素K2可作用于成骨细胞，促进骨，组织钙化，同时还能抑制破骨细胞，引起骨吸收，从而增加骨密度，不仅可防还可治骨质疏松。骨钙素是由成骨细胞、成牙本质细胞和肥大的软骨细胞合成并分泌的蛋白质，它主要存在于这三种细胞外的骨基质中，小部分被释放进入血液循环，所以血清骨钙素为骨形成的重要指标。依赖于维生素K的骨组织羧化系统使骨钙素羧化变成具有生物学活性的羧化骨钙素，与钙结合，由无规则线团变成螺旋结构，羟基磷灰石结合，从而促进骨形成。研究表明，维生素K1、K2、K3中，Kl有促进钙化作用，Κ2作用更强，而Κ3则没有这一作用。
[0005]目前市场上预防骨质疏松应用较为广泛的保健品是以碳酸钙为主的超微化处理的含有钙和维生素D的第3代复合制剂，如液体钙+D3软胶囊(液体钙+维生素D);另外还有一些钙与中药复配的保健品如苗岭牌骨立胶囊、灵芝乳酸钙片等。这些产品都以钙为主要成分，希望通过补钙达到防治骨质疏松的结果。但是，摄入的钙并不能保证被有效的吸收，即便有的产品加入维生素D，在机体缺少维生素Κ2的情况下，也不能保证吸收的钙能被有效的利用。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是开发一款以含天然维生素Κ2(ΜΚ_7)的有益菌为原料、同时含有维生素D和钙的安全绿色的防治骨质疏松的产品。
[0007]具体技术方案为:
[0008]防治骨质疏松的益生菌制剂，由以下方法制备所得:
[0009](I)纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)BLCC1-0053菌粉的制备:冻存的纳豆芽孢杆菌BLCC1-0053种经活化后转接到种子液体培养基中，在35?45°C条件下，静置培养12?24h，制得种子液；以I?5%的接种量，将种子液接于液体发酵培养基中，35?45°C，100?180rpm培养12?24h，然后转至40?50°C条件下，静置培养5?7d ;发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，离心条件为5000?10000rpm，5?15min，清洗2?3遍后冷冻干燥，粉碎，即为纳豆芽孢杆菌菌粉。
[0010]纳?芽抱杆菌(Bacillusnatto) BLCC1-0053，已于2014年I月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO M2014028 ;保藏地址为中国武汉的武汉大学，邮编为430072 ;所述的纳豆芽孢杆菌BLCC1-0053产维生素K2，经高效液相色谱(HPLC)检测，MK-7的含量不低于3.68733mg/g0
[0011]其中，种子液体培养基各成分质量含量为:葡萄糖0.2%，蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%,酵母膏0.5%，其余为蒸馏水，pH值7.0。
[0012]液体发酵培养基各成分质量含量为:蛋白胨10%，丙三醇3%、NaCl0.5%,K2HPO40.02%，其余为蒸馏水，pH7.0-7.2。
[0013](2)酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BLCC4-0032 已于 2015 年 3 月 18 日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M2015123，保藏地址为中国武汉的武汉大学，邮编为430072 ;酿酒酵母的发酵生产:酿酒酵母在斜面培养基中经斜面活化后转接到种子液体培养基中，25?35°C条件下，120?200rpm振荡培养18?30h，制得种子液；以I?5%的接种量，将种子液接于液体发酵培养基中，25?35°C，120?200rpm振荡培养18?30ho
[0014]其中，斜面培养基配各成分质量含量为:葡萄糖2 %，酵母膏0.5 %，蛋白胨I %，磷酸二氢钾0.2%，琼脂粉1.5?2.0%，其余为蒸馏水。
[0015]种子液体培养基及液体发酵培养基为不含琼脂的固体培养基，即葡萄糖2%，酵母膏0.5 %，蛋白胨I %，磷酸二氢钾0.2%，其余为蒸馏水。
[0016](3)酿酒酵母紫外照射:离心收集菌体，用发酵液体积30%去离子水重悬菌体，紫外照射2?4h ;
[0017]紫外照射的波长为254?365nm。紫外照射后的酵母菌粉中维生素D (VD)的含量不低于 732.97ug/g，即 2931880IU/100go
[0018](4)离心收集菌体，离心条件为5000?10000rpm，5?15min，冷冻干燥后粉碎，即为酿酒酵母菌菌粉；酿酒酵母菌菌粉中维生素D的含量不低于732.97ug/g ;
[0019](5)产品复配:将纳豆芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙配成益生菌制剂产品，纳豆芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙混合的比例按照有效成分质量比例配制，MK-7:VD:Ca2+= 30 ?300:1 ?10:160。
[0020]本发明提供的防治骨质疏松的益生菌制剂，以含天然维生素K2(MK-7)的有益菌为原料、同时含有维生素D和钙的安全绿色的防治骨质疏松的产品，能有效提高钙质的吸收，可以防治骨质疏松。
【附图说明】
[0021]图1是本发明实施例试验过程中大鼠体重变化；
[0022]图2是本发明实施例饲喂产品后各组大鼠骨矿含量；
[0023]图3是本发明实施例饲喂产品前后骨矿含量增长情况；
[0024]图4是本发明实施例饲喂产品后各组大鼠骨密度；
[0025]图5是本发明实施例饲喂产品后各组大鼠骨密度增长情况；
[0026]图6是本发明实施例中各组大鼠血清中P的含量；
[0027]图7是本发明实施例中各组大鼠血清中Ca的含量。
【具体实施方式】
[0028]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0029]实施例1
[0030](I)纳豆芽孢杆菌BLCC1-0053菌粉的制备
[0031]培养基配方:
[0032]种子液体培养基各成分质量含量为:葡萄糖0.2%，蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%，酵母膏0.5%，其余为蒸馏水，pH值7.00
[0033]液体发酵培养基各成分质量含量为:蛋白胨10%，丙三醇3%、NaCl0.5%,K2HPO40.02%，其余为蒸馏水，pH7.0-7.2。
[0034]冻存的纳豆芽孢杆菌BLCC1-0053种经活化后转接到种子液体培养基中，在37°C条件下，静置培养16h，制得种子液；以5%的接种量，将种子液接于液体发酵培养基中，370C，120rpm培养24h，然后转至42°C条件下，静置培养5?7d ;发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，离心条件为5000?lOOOOrpm，5?15min，清洗2?3遍后冷冻干燥，粉碎，即为纳豆芽孢杆菌菌粉。
[0035]菌粉样品经过处理后，高效液相色谱(HPLC)结果显示MK-7产量高达3.68733mg/
g°
[0036](2)酿酒酵母BLCC4-0032菌粉的制备
[0037]斜面培养基配各成分质量含量为:葡萄糖2%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，磷酸二氢钾0.2%，琼脂粉2.0%，其余为蒸馏水。
[0038]种子液体培养基及液体发酵培养基为不含琼脂的固体培养基，葡萄糖2%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，磷酸二氢钾0.2%，其余为蒸馏水。
[0039]酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BLCC