铜离子制剂在制备促进皮肤角质形成细胞增殖药物或敷料中的用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及微量元素的应用领域，具体是微摩尔浓度的铜离子制剂对促进皮肤角质形成细胞增殖的用途。
【背景技术】
[0002]铜作为抗菌材料在公元前2600年古埃及人所著的Edwin Smith纸草文稿中就有记载，并应用于饮水消毒及创面治疗。长期以来，因兼具抗菌、抗病毒、抗寄生虫等诸多特性，各种铜制品及铜化合物在医药卫生及农业种植养殖等领域得到了广泛应用。众所周知，铜作为人体重要的必需微量元素，是铜蓝蛋白、细胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶等众多酶系的辅基，参与了包括铁代谢、能量代谢、氧化还原等关键生理过程。尽管5% (0.200mol/L)硫酸铜、5% (0.157mol/L)枸橼酸铜都曾被用于治疗股藓及结膜炎，然而大量的体外实验均证实Cu2+对大多数细胞的毒性浓度约在I X 10 4mol/L水平。尽管众多研究认为铜及其复合材料在以离子状态释放后对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等具有明确的抗菌作用，然而也存在大量关于高浓度Cu2+细胞毒性的报道。随着抗生素及银、锌等抗菌药物的不断推陈出新，铜类制剂已经基本淡出了创面修复治疗领域。然而，本课题组通过实验证实特定浓度的Cu2+能够促进角质形成细胞增殖，加速小鼠创面愈合。综上内容所述，铜作为人体必需微量元素，同时兼具抗菌、促细胞增殖的特性，可用作促进创面愈合的新药物。
【发明内容】
[0003]针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供铜离子制剂对促进人皮肤角质形成细胞增殖的用途，继而使铜离子制剂在有效防止感染的同时加速创面愈合。
[0004]为实现上述目的，本发明采取如下方案:本发明提供的铜离子制剂在制备促进皮肤角质形成细胞增殖药物或敷料中的用途，其中所述铜离子制剂中铜离子的浓度为10 8?10411101/1，优选0.5\105?5\10 5mol/L和10 7?5 X 10 mo I/L0该促进皮肤角质形成细胞增殖的铜离子制剂为外用药或创口敷料。
[0005]具体地，所述铜离子制剂为溶液、凝胶、霜剂、洗剂、擦剂、膏剂或敷料。
[0006]更进一步，所述溶液、凝胶、霜剂、洗剂、擦剂、膏剂和敷料中的铜离子均以离子形式存在。
[0007]为了更好地实现本发明的目的，所述溶液是用蒸馏水、生理盐水或细胞培养基将可溶性铜盐(如硝酸铜)粉末配制成可溶性铜盐(如硝酸铜)溶液；所述凝胶是用凝胶基质(如聚乙烯醇)与可溶性铜盐(如硝酸铜溶液)配制成可溶性铜盐水凝胶(如硝酸铜水凝胶)。
[0008]本发明对所述10 8?10 4mol/L铜离子制剂进行了细胞水平实验和小鼠动物实验，证实所述10 8?10 4mol/L铜离子制剂具有促进人皮肤角质形成细胞增殖的作用，在有效防止感染的同时可加速创面愈合。
[0009]本发明所述的10 8?10 4mol/L铜离子制剂具有促进人皮肤角质形成细胞增殖的作用，继而在有效预防感染的同时加速创面愈合。
【附图说明】
[0010]图1是蒸馏水配置的10 8?lmol/L浓度铜离子溶液；
图2是10%聚乙烯醇配置10 8?lmol/L浓度铜离子凝胶；
图3是10 8?10 3mol/L铜离子溶液对人角质形成细胞增殖的影响；
图4是10 7?10 3mol/L铜离子溶液处理人角质形成细胞48h后细胞照片；
图4中，大图为40倍细胞照片，左下角小图为200倍细胞照片；
图5是10 8?10 4mol/L铜离子水凝胶对小鼠皮肤创面愈合的影响；
图5中，A-G:第O天至12天小鼠皮肤创面愈合情况；H:小鼠皮肤创面分组示意图。
【具体实施方式】
[0011]下面结合【具体实施方式】对本发明的
【发明内容】
作进一步的详细描述。应理解，本发明的实施例只用于说明本发明而非限制本发明，在不脱离本发明技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出的各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
[0012]实施例1铜离子溶液的制备方法
(I)称取一定量的硝酸铜粉末分别用蒸馏水、生理盐水、细胞培养基等配制成相应的硝酸铜溶液，浓度范围为10 8?lmol/L。
[0013]实验结果如图1所示，在lmol/L浓度下硝酸铜的蒸馏水溶液为蓝色，随溶液浓度降低，颜色逐渐变淡，在10 3mol/L浓度时肉眼观察为透明无色。
[0014]实施例2铜离子水凝胶的制备方法按10%配比称取聚乙烯醇(PVA)，量取去离子水，把PVA在搅拌条件下，置85°C恒温油浴中溶解完全，分别加入硝酸铜溶液使终浓度为10 8?lmol/L，水凝胶浸入Icm2正方形小纱布块后，放入_20°C的冰箱里，冷冻24h，在室温下解冻，称一次冷冻融溶循环，待PVA溶解后，再用这种冷冻融溶方法循环5次，制备不同浓度的铜离子水凝胶。
[0015]实验结果如图2所示，lmol/L浓度铜离子水凝胶为蓝色，随铜离子浓度降低，颜色逐渐变淡，在10 2mol/L浓度时肉眼观察铜离子水凝胶透明无色。
[0016]实施例3铜离子溶液促进人角质形成细胞的增殖反应
人角质形成细胞株(HaCaT)使用含10%灭活胎牛血清、100U/mL青霉素，100 μ g/mL链霉素的DMEM培养基，37°C 5% CO2培养至70%?80%融合度时，经消化、离心、计数等步骤后，按5000个/孔(200 μ L)接种于96孔板，每种Cu2+浓度实验组设3个重复孔，孵育5h贴壁后，更换Cu2+终浓度为O (阴性对照组)、10 8、10 7、10 6、10 5、10 4、10 3mol/L的培养基。然后每24小时更换培养基I次，48h后将CCK-8 (CK04, Do jindo)与培养基按1:10混合后加入96孔板，其中每孔110 μ L (10 μ L CCK-8+100 μ L培养基)，37°C再孵育4h，无细胞的培养基中加入CCK-8作为空白对照。相应时间点置于倒置显微镜(1X71，Olympus，Japan)下采集40倍及200倍细胞照片，并用多功能酶标仪(Var1skan flash, Thermo Scientific)检测波长为450nm的光密度值[D(450)]。细胞的相对增殖活性按如下公式计算:相对细胞增殖百分率=[D (450) exp- D (450) blk] + [D (450) ctr- D (450) blk] X 100%式中，D (450) exp:各实验处理组(细胞+含Cu2+培养基)，D (450) ctr:阴性对照组(细胞+无Cu 2+培养基)，D (450)blk:空白对照组(无Cu2+培养基)。共进行3次独立重复实验，结果取均数，以分组为横轴，相对细胞增殖百分率为纵轴绘制条形图。
[0017]实验结果如图3、4所示，不同浓度的Cu2+对HaCaT细胞增殖的影响是完全不同的。图3可见阴性对照及10 8MUO 7M两组细胞均表现出角质形成细胞典型的多角形态，细胞融合度大致相当，10 6MUO 5M两组多角形细胞更多，且融合度更高；10 4M组细胞融合度低，多呈圆形、椭圆形；10 3M组大量细胞脱落后仅有少量的残留细胞，其细胞变小、结构消失。图4显示，与阴性对照相比，10 8、10 7mol/L两组对HaCaT细胞的增殖略有增强，但无统计学意义；而10 6、10 5mol/L组均表现出明显的促增殖效应，但两组之间无明显差别。当浓度上升至10 4、10 3mol/L时，Cu2+即表现出明显的细胞毒性，表明铜离子存在剂量-效应关系的双向作用，在10 6?10 5mol/L范围内能够促进人角质形成细胞增殖。
[0018]实施例4铜离子水凝胶加速小鼠全层皮肤缺损创面愈合
选取雄性BALB/C小鼠5只，体重25g，将小鼠背部皮肤去毛，用4.5mm打孔器于脊柱两侧共打4个孔，立即照相，为O天照片，对照组将浸泡于水凝胶基质(Omol/L铜离子敷料)中的敷贴放于左上创面，实验组将浸泡于10 4、10 6、10 8mol/L实施例2制备的铜离子水凝胶敷料分别放置于右上、右下、左下创面，隔天换药并照相。
[0019]实验结果如图5所示，是10 8?10 4mol/L铜离子水凝胶敷料于O天、2天、4天、6天、8天、10天、12天拍摄的照片，左上创面为对照组，右上创面为10 4mol/L组，右下创面为10 6mol/L组，左下创面为10 8mol/L组。由图5中D可知，10 8?10 4mol/L铜离子水凝胶敷料作用于小鼠创面6天后，伤口愈合的程度与对照组比较有明显的差异，继续作用至10天后，实验组小鼠创面已基本愈合，表明10 8?10 4mol/L铜离子水凝胶敷料在有效预防感染的同时加速创面愈合。
【主权项】
1.铜离子制剂在制备促进皮肤角质形成细胞增殖药物或敷料中的用途，其中所述铜离子制剂中铜离子的浓度为10 8?10 4mol/Lo2.根据权利要求1所述铜离子制剂在制备促进皮肤角质形成细胞增殖药物或敷料中的用途，其特征在于:所述促进皮肤角质形成细胞增殖药物或敷料为外用药或伤口敷料。3.根据权利要求1所述铜离子制剂在制备促进皮肤角质形成细胞增殖药物或敷料中的用途，其特征在于:所述铜离子制剂中铜离子的浓度为0.5X 10 5?5X 10 5 mol/Lo4.根据权利要求1所述铜离子制剂在制备促进皮肤角质形成细胞增殖药物或敷料中的用途，其特征在于:所述铜离子制剂中铜离子的浓度为10 7?5X10 6mol/L。5.根据权利要求1到4任一项所述铜离子制剂在制备促进皮肤角质形成细胞增殖药物或敷料中的用途，其特征在于:所述铜离子制剂为溶液、凝胶、霜剂、洗剂、擦剂、膏剂或敷料。6.根据权利要求5所述铜离子制剂在制备促进皮肤角质形成细胞增殖药物或敷料中的用途，其特征在于:所述溶液、凝胶、霜剂、洗剂、擦剂、膏剂和敷料中的铜离子均以离子形式存在。7.根据权利要求1到4任一项所述铜离子制剂在制备促进皮肤角质形成细胞增殖药物或敷料中的用途，其特征在于:所述溶液是用蒸馏水、生理盐水或细胞培养基将可溶性铜盐粉末配制成铜盐溶液；所述凝胶是用凝胶基质与可溶性铜盐溶液配制成铜盐水凝胶。8.根据权利要求7所述铜离子制剂在制备促进皮肤角质形成细胞增殖药物或敷料中的用途，其特征在于:所述溶性铜盐选用硝酸铜，所述凝胶基质选用聚乙烯醇。
【专利摘要】本发明公开了一种铜离子制剂在制备促进皮肤角质形成细胞增殖药物或敷料中的用途，其中所述铜离子制剂中铜离子的浓度为10-8～10-4？mol/L。该铜离子制剂具有促进人皮肤角质形成细胞增殖的作用，在有效防止感染的同时可加速创面愈合。
【IPC分类】A61K33/34, A61P17/00, A61P17/02, A61L15/44
【公开号】CN105055448
【申请号】CN201510269566
【发明人】彭代智, 段小冬, 张宜澜, 黄亚兰
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年5月25日