氧化铁纳米颗粒用于制备改善厄洛替尼耐药性药物的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及物质的新的制药用途，具体涉及氧化铁纳米颗粒在制备改善药物耐药性中的应用。
【背景技术】
[0002]肺癌是我国最常见的恶性肿瘤，分子靶向治疗是治疗肺癌的新途径。厄洛替尼(英文:Erlotinib )是目前晚期非小细胞肺癌的一线革El向治疗药物，显著地延长了患者的生存期。厄洛替尼在不同的患者有不同的治疗效果，其关键的分子标志物是表皮生长因子受体(EGFR)。在一项被称为IPASS (EGFR抑制剂泛亚洲研究)的研究中，EGFR小分子抑制剂在晚期EGFR突变阳性肺腺癌患者的一线治疗中明显优于标准的化疗，而EGFR突变阴性患者使用抑制剂的疗效就差得多，这提示EGFR突变是一个治疗的分子标志物。然而尽管有EGFR激活突变的肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂的反应更好，但几乎所有的患者都会发生耐药，引起肿瘤复发。研究表明=EGFR基因中的新突变以及EGFR下游的信号分子以及其他信号通路仍处于激活状态是耐药产生的原因。对于厄洛替尼耐药的肺癌患者并无很好的治疗方法，目前主要是采用联合用药对抗这种耐药性。因此，研究逆转厄洛替尼耐药的解决方法和机制，对于小细胞肺癌的治疗具有重要意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于寻找到一种改善厄洛替尼耐药性的物质，发现该物质与厄洛替尼联合应用显著抑制肿瘤的生长，从而了解到该物质新的医药用途，从而解决厄洛替尼小细胞肺癌治疗时产生耐药的问题。
本发明的发明人团队经过大量研究证实:氧化铁纳米颗粒可能通过ERBB2，ERBB3，ERBB4下游的信号通路，从而增强肺癌细胞对于厄洛替尼的敏感性。因此，本发明提出:氧化铁纳米颗粒可以用于制备改善厄洛替尼耐药性的药物。
[0004]氧化铁纳米颗粒用于制备改善厄洛替尼耐药性的药物时，氧化铁纳米颗粒与厄洛替尼的质量配比一般为:1~40:1，氧化铁纳米颗粒每日用量不大于10mg/kg。
[0005]氧化铁纳米颗粒具备超顺磁性，生物安全度高，广泛应用于人体磁共振成像的研究。而本发明人团队发现在体外培养的肺癌细胞H358和耐药细胞株A549中同时用氧化铁纳米颗粒和厄洛替尼处理，可以显著增强抗肿瘤细胞增殖的作用。在裸鼠实验中，用耐药细胞株A549皮下成瘤构建移植瘤模型，氧化铁纳米颗粒和厄洛替尼联合应用也可以显著抑制肿瘤的生长，提示氧化铁纳米颗粒和厄洛替尼有协同作用，可以促进肺癌细胞对厄洛替尼的敏感性。本发明为厄洛替尼抵抗的肺癌患者的临床治疗提供了强有力的技术支持和分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。
【附图说明】
[0006] 图1:不同浓度的氧化铁纳米颗粒对肺癌A549细胞的增殖抑制作用；
图2:氧化铁纳米颗粒与厄洛替尼联用对人非小细胞肺癌A549细胞的增殖抑制作用；图3:氧化铁纳米颗粒与厄洛替尼联用对人非小细胞肺癌H358细胞的增殖抑制作用；图4:裸鼠的皮下移植瘤抑制率实验中剥除后的瘤体对照图；其中A为NC组，B为厄洛替尼组，C为氧化铁纳米颗粒组，D为氧化铁纳米颗粒+厄洛替尼组；
图5:裸鼠的皮下移植瘤抑制率实验中体内成瘤生长曲线图；
图6:A549和H358 EGFR磷酸化抗体芯片表达结果图；
图7:A549EGFR磷酸化抗体芯片表达水平柱状图；
图8:H358EGFR磷酸化抗体芯片表达水平柱状图。
【具体实施方式】
[0007]
实施例1:氧化铁纳米颗粒的制作
将葡聚糖、氯化亚铁、氯化铁按质量比39.6:1:2.7的比例混合，60°C混合反应I h，反应过程中缓慢滴加等体积的氨水。反应产物12 000 r/ min离心15 min,取上清，用0.22um滤膜过滤。继续12 000 r/ min，去除上清，用150 mmol/L NaCl溶液洗涤后重悬。
[0008]生成物的检测:生成物氧化铁纳米颗粒的直径在1nm以下。在酸性条件时，纳米颗粒的zeta电位为正电性；在中性和碱性条件下，纳米颗粒的zeta电位为负电性。
[0009]实施例2:氧化铁纳米颗粒对人非小细胞肺癌A549增殖抑制实验
第一天每孔加入10ul 5000个小细胞肺癌A549细胞，加培基至体积200ul，第二天待细胞贴壁后，分别给予不同浓度(2mM、200uM、20uM、2uM、200nM、20nM、2nM、0.2nM、0.02nM、
0.002nM)氧化铁纳米颗粒处理。在处理后2天，每孔加入20微升CCK-8溶液。在细胞培养箱内继续孵育0.5-4小时，在450nm测定吸光度。
[0010]如图1所示，不同浓度的氧化铁纳米颗粒处理肺癌A549细胞，结果显示2mM和200uM的氧化铁纳米颗粒对肺癌A549细胞有明显的抑制作用。
[0011]实施例3:氧化铁纳米颗粒和厄洛替尼联合用药对人非小细胞肺癌A549、H358细胞增殖实验
第一天每孔加入10ul 5000个细胞非小细胞肺癌A549、H358细胞，加培基至体积200ul，第二天待细胞贴壁后，给予不同浓度的厄洛替尼(5uM、10uM、20uM、40uM)和200uM氧化铁纳米颗粒处理。在处理后的相应的天数，每孔加入20微升CCK-8溶液。在细胞培养箱内继续孵育0.5-4小时，在450nm测定吸光度。
[0012]如图2和图3所示，氧化铁纳米颗粒和厄洛替尼联合用药对人非小细胞肺癌A549、H358细胞增殖抑制实验。结果显示氧化铁纳米颗粒可以明显增强厄洛替尼的抑制肺癌细胞A549 (见图2)和H358 (见图3)增殖的作用。
实施例4:裸鼠的皮下移植瘤抑制率实验
BALB/C裸鼠，雌性，20-25克，SPF级；A549细胞浓度至17/毫升；将16总数的A549细胞注射至BALB/C裸鼠皮下，等大约一个月后裸鼠皮下成瘤。
[0013]将成瘤后小鼠分成4组，分别为生理盐水注射组(NC组)、厄洛替尼2.5mg/kg)注射组，氧化铁纳米颗粒(10mg/kg)注射组，厄洛替尼2.5mg/kg) +氧化铁(10mg/kg)纳米颗粒注射组。注射方式为腹腔注射荷瘤小鼠，每两天给药一次。分别于不同的时间点测量皮下瘤的大小。最后一次测量大小后，引颈法处死小鼠，称体重，剥取瘤块。
[0014]图4为剥除后的瘤体；图5体内成瘤生长曲线。如图4和图5所示，氧化铁纳米颗粒和厄洛替尼联合用药对人非小细胞肺癌A549裸鼠模型的肿瘤抑制作用。结果显示氧化铁纳米颗粒可以明显增强厄洛替尼的抑制裸鼠成瘤。
[0015]实施例5:氧化铁纳米颗粒引起EGFR下游的信号分子变化的细胞实验
在50ml培养瓶中培养A549和H358细胞，待细胞长满培养瓶的80%时，将细胞用空白对照、厄洛替尼(20uM )、200uM氧化铁纳米颗粒、厄洛替尼(20uM )+200uM氧化铁纳米颗粒分四组进行分别处理。处理48小时后，用RayB1tech公司人类表皮生长因子受体磷酸化抗体芯片试剂盒做EGFR下游的信号分子表达水平变化。结果如图6-8所示:图6为A549细胞和H358细胞的EGFR磷酸化抗体芯片表达结果图，图7为A549细胞EGFR磷酸化抗体芯片表达水平柱状图，图8为H358细胞EGFR磷酸化抗体芯片表达水平柱状图。
【主权项】
1.氧化铁纳米颗粒用于制备改善厄洛替尼耐药性药物的应用，所述氧化铁纳米颗粒与厄洛替尼的质量配比为1~40:1，氧化铁纳米颗粒每日剂量不大于10mg/kg。2.如权利要求1所述的氧化铁纳米颗粒用于制备改善厄洛替尼耐药性药物的应用，所述氧化铁纳米颗粒直径不大于10nm。3.如权利要求2所述的氧化铁纳米颗粒用于制备改善厄洛替尼耐药性药物的应用，所述氧化铁纳米颗粒的制备方法为:将葡聚糖、氯化亚铁、氯化铁按质量比39.6:1:2.7的比例混合，60°C混合反应I h，反应过程中缓慢滴加等体积的氨水；反应产物12000 r/ min离心15 min，取上清，用0.22um滤膜过滤；继续12000 r/ min离心，去除上清，用150 mmol/L NaCl溶液洗涤后重悬，得到所述氧化铁纳米颗粒。
【专利摘要】本发明公开了氧化铁纳米颗粒用于制备改善厄洛替尼耐药性药物的应用，氧化铁纳米颗粒用于制备改善厄洛替尼耐药性的药物时，氧化铁纳米颗粒与厄洛替尼的质量配比一般为：1~40：1，氧化铁纳米颗粒每日用量不大于10mg/kg。本发明发现在体外培养的肺癌细胞H358和耐药细胞株A549中同时用氧化铁纳米颗粒和厄洛替尼处理，结果显示可以显著增强抗肿瘤细胞增殖的作用。进一步的实验发现氧化铁纳米颗粒和厄洛替尼联合应用可以显著抑制肿瘤的生长，提示氧化铁纳米颗粒可能通过ERBB2，ERBB3，ERBB4下游的信号通路，从而增强肺癌细胞对于厄洛替尼的敏感性。本发明为厄洛替尼抵抗的肺癌患者的临床治疗提供了解决方案。
【IPC分类】A61K9/16, A61K31/517, A61P35/00, A61K33/26
【公开号】CN105055447
【申请号】CN201510344993
【发明人】唐敬群, 张美丽, 喻风雷, 向娟娟, 李桂源, 李征
【申请人】中南大学湘雅二医院
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年6月23日