苏合香与细胞浴液混合物及其在抑制Kir2.1内向电流方面的应用
【技术领域】
[0001] 本发明是属于内向整流钾离子通道Kir2. 1调节剂的筛选，具体涉及苏合香与浴 液混合液对Kir2. 1通道内向电流的抑制。
【背景技术】
[0002] 离子通道是细胞膜上只能通透某一种或某几种离子的孔道性蛋白，在维持膜电 位、进行信号传导起着非常重要的作用。内向整流钾通道Kir2. 1是钾离子通道的一种，它 允许钾离子通透这一孔道。在细胞内存在镁离子或者多胺离子的情况下，钾离子较易流入 细胞而不易流出细胞，因此称为"内向整流钾离子通道"。Kir2. 1通道的异常表达会引起很 多的猝死型心脏疾病，比如安德森综合症、短QT3综合症、巴氏综合症等等，其症状都和心 律不齐相关。这些疾病都是因为Kir2.1某些位点的基因突变以至于其电流变化引起。所 以寻找Kir2. 1通道电流的调节剂对于治疗这些疾病意义重大。
[0003] 筛选离子通道调节剂的实验手段通常为荧光的方法和膜片钳记录电流的方法。荧 光的方法是利用渗入工具细胞--人胚肾细胞（HEK293T)内的荧光探针--FluxOR。这种 探针结合铊离子后受460-490纳米可见激光激发后发出的荧光会显著增强，当Kir2. 1通道 打开时，铊离子可以代替钾离子通过此通道进入细胞，进而引起荧光强度的增强。相反，如 果加入了Kir2. 1的抑制剂，则Kir2. 1通道被抑制，也即处于关闭状态，铊离子无法进入细 胞，则荧光强度无法增强。这种方法的优点为效率高，但无法定量。膜片钳可以记录细胞膜 上的电流的大小，这种方法效率低，但能够定量。两种方法结合起来，就能够快速有效的进 行离子通道调节试剂的筛选。
[0004] 中草药是中华五千年的瑰宝，其优点甚多。据此根据《中药大辞典》查找能够治疗 心律不齐的相关中草药，发现中药苏合香在调节心律方面效果显著。苏合香是一种油状液 体，为植物苏合香树的树干渗出的树脂加工精制而成，为一种常用的中药材。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对当前Kir2. 1钾离子通道电流抑制试剂缺乏 的情况下，提供一种苏合香与细胞浴液的混合物，混合物能够对表达于J1EK293T细胞的 Kir2. 1通道的内向电流起到很强的抑制作用。共聚焦显微镜下，苏合香与细胞浴液孵育表 达Kir2. 1通道蛋白的HEK293T细胞，则HEK293T细胞内FluxOR发出的荧光无变化。利用 苏合香与细胞浴液的混合物孵育转染Kir2. 1的HEK293T细胞，则膜片钳记录到的Kir2. 1 的内向电流消失。二者证明了苏合香与细胞浴液对Kir2. 1通道内向电流起到抑制作用，为 Kir2. 1的抑制剂。当再灌流无苏合香的细胞浴液，则Kir2. 1通道电流得到恢复，这证明苏 合香与细胞浴液未破坏Kir2. 1通道蛋白的结构。
[0006] 本发明的技术方案为：
[0007] -种苏合香与细胞浴液混合物，其组成包括苏合香和细胞浴液，体积比为苏合香： 细胞浴液=1 :10~500 ;
[0008] 所述的细胞浴液的pH值为7. 2~7. 4,渗透压为290~300m0sm/L。
[0009] 所述的苏合香与细胞浴液混合物的应用方法，利用该混合物孵育转染有Kir2. 1 通道蛋白的细胞，有效抑制Kir2. 1通道内向电流。
[0010] 所述的苏合香与细胞浴液混合物的应用方法，具体包括以下步骤：
[0011] ⑴配制细胞浴液；
[0012] ⑵将苏合香与细胞浴液混合摇勾，并用0. 22~0. 44微米的滤膜过滤，得到的液 体待用；其中，体积比为苏合香：细胞浴液=1 :500~1 :10 ;
[0013] (3)利用步骤（2)得到的液体孵育转染Kir2. 1质粒的HEK293T细胞，使得抑制剂 苏合香与HEK293T细胞共存。
[0014] 所述的细胞浴液优选为细胞浴液a、细胞浴液b、细胞浴液c、细胞浴液d、细胞浴液 e或细胞浴液f;其中，
[0015] 所述的细胞浴液a的组成包括：美国生命技术公司的（MOLE⑶LARPROBES)的试剂 盒FluxOR?PotassiumIonChannelAssay中的试剂配制而成，所得到每10mL的细胞浴液 中包括1M的HEPES200uL，lmL的试剂B，100uL的试剂D，8. 7mL的去离子水，并用NaOH调 节其pH值为7. 4;
[0016]所述的细胞浴液b的组成包括：116. 88mM的KC1，5mM的MgCl2, 2mM的EDTA，2. 83mM 的KH2P04, 7. 17mM的K2HP04，溶剂为超纯水，K0H调节溶液pH为7. 3,渗透压为300m0sm/L;
[0017] 所述的细胞浴液c的组成或者包括：浓度分别为140mM的KC1，10mM的K-HEPES， ImM的K-EGTA，溶剂为超纯水，K0H调节溶液pH为7. 3,渗透压为300m0sm/L;
[0018] 所述的细胞浴液d的组成包括：浓度分别为110mM的KC1，10mM的KH2P04,2mM 的EDTA，5mM的HEPES，1. 9mM的K2ATP，溶剂为超纯水，K0H调节溶液pH为7. 3,渗透压为 300m0sm/L；
[0019] 所述的细胞浴液e的组成或者包括：浓度分别为123mM的KC1，5mM的 K2EDTA，7. 2mM的K2HP04, 8mM的KH2P04，溶剂为超纯水，K0H调节溶液pH为7. 3,渗透压为 300m0sm/L；
[0020] 所述的细胞浴液f的组成包括：浓度分别为120mM的KC1，4mM的K2EDTA，7. 2mM的 K2HP04, 2. 8mM的KH2P04,溶剂为超纯水，K0H调节溶液pH为7. 3,渗透压为300m0sm/L〇
[0021] 本发明的有益效果是：苏合香与细胞浴液的混合物有效抑制了Kir2. 1的内向电 流，抑制率接近百分之百。
[0022] 迄今为止，Kir2. 1通道的抑制剂有ML133、他莫西芬、氯乙基可乐定，其中，只有ML 133 (N- (4-Methoxybenzyl) -I- (naphthalen-l-yl)methanamine)抑制效果比较明显，其半 数有效抑制浓度只有290nM。但是它是一种化学合成的小分子，其对人体的副作用仍需验 证。另外虽然发现中草药小分子中的南蛇藤醇和藤黄酸对Kir2. 1通道内向电流也有抑制 作用，但不能完全抑制，效果不明显。
[0023]苏合香来自天然苏合香树脂，对人体副作用小，《中药大辞典》第二版1509页，"苏 合香灌胃，能提高小鼠常压下的心肌缺氧能力，显著降低氯仿诱导的小鼠室颤发生率，提高 冠脉流量"。本发明通过其与细胞浴液的混合液体对Kir2. 1内向电流抑制率达98%，半数 有效抑制浓度为0. 0113.这对于研制短QT3综合症的有效治疗药物打开了一扇大门。
【附图说明】
[0024] 图1为实施例1中转染Kir2. 1的HEK293T细胞在共聚焦显微镜下的荧光照片，其 中：
[0025] 图1A为转染Kir2. 1的HEK293T细胞，加入铊离子前的荧光照片；
[0026] 图1B为转染Kir2. 1的HEK293T细胞，加入铊离子后的荧光照片；
[0027] 图1C为转染Kir2. 1的HEK293T细胞在苏合香和细胞浴液下孵育后，加入铊离子 前的荧光照片；
[0028] 图1D为转染Kir2. 1的HEK293T细胞在苏合香和细胞浴液下孵育后，加入铊离子 后的荧光照片。
[0029] 图2为实施例1中，单个细胞荧光变化比较的代表性曲线。
[0030] 图3为实施例1中，未含及含有苏合香的细胞浴液混合液情况下孵育单个转染 Kir2. 1通道的HEK293T细胞时，根据共聚焦显微镜记录，得到的加入铊离子前后的细胞的 荧光强度的变化比例柱状图，其中，1_为加入铊离子后的荧光强度，1_为加入铊离子前 的荧光强度，n= 5。
[0031] 图4为实施例2中，通过膜片钳内向外模式记录到的转染Kir2. 1的HEK293T细胞 上的电流随膜电位的变化，横坐标为电压，纵坐标为电流。其中：
[0032] 图4A，未灌流苏合香的Kir2. 1电流变化；
[0033] 图4B，苏合香与细胞浴液体积比为1 :20的混合液灌流后的Kir2. 1的电流变化；
[0034] 图4C，利用细胞浴液冲掉苏合香后的Kir2. 1的电流变化。
[0035] 图5为实施例3中，苏合香与细胞浴液混合液对Kir2. 1电流的抑制百分比与苏合 香浓度的变化关系，也就是量效曲线。横坐标为苏合香与浴液体积比，纵坐标为抑制Kir2. 1 的百分比。IC5Q= 0.0113。
【具体实施方式】
[0036] 本发明涉及的苏合香来自中国食品药品鉴定研究院（品种编号120931，批号 120931-201003)
[0037] 实施例1
[0038] 采用FluxOR荧光探针方法记录苏合香与细胞浴液混合液对Kir2. 1内向电流抑制 的代表性实验结果。
[0039]FluxOR是一种荧光探针，铊离子与之结合后受460-490纳米可见激光激发后，会 发出525nm波长的绿色荧光。铊离子为一价阳离子，可以像钾离子一样通过Kir2. 1通道。 本实施例所用到的试剂和FluxOR均来自于市售的试剂盒，试剂盒来自美国生命技术公司 的MOLECULARPROBES的FluxOR?PotassiumIonChannelAssay，货号：F10016。
[0040] 本实施例使用的细胞浴液主要由美国生命技术公司（MOLE⑶LARPROBES)的试剂 盒FluxOR?PotassiumIonChannelAssay中的试剂配制而成，具体为：
[0041 ]
[0042] 利用NaOH调节其pH值为7. 4。（其中，"试剂B"和"试剂D"分别为该试剂盒中固 定组成的试剂，配制时按照试剂盒说明书中的说明来进行，得到上述细胞浴液。本实施例中 后续涉及试剂盒中的试剂使用同理。）
[0043] 苏合香与细胞浴液混合物配制方法为：将苏合香与细胞浴液按照体积比：苏合 香：细胞浴液=1 :20混合摇匀，并用0. 22微米的滤膜过滤。
[0044]Kir2. 1质粒转染至HEK293T细胞的方法如下：HEK293T细胞铺板于含有 0. 13-0. 17mm厚度爬片的24孔板，37度5 %二氧化碳无菌培养箱培养24小时后，密 度达40%，利用脂质体方法进行转染Kir2. 1质粒。其中脂质体来自美国罗氏公司的 X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent。脂质体：Kir2. 1 质粒：减血清培养基 (Opti-MEMI，美国生命技术公司）=1. 5微升：0. 5钠克：50微升。上述条件继续培养24 小时后，得到表达有Kir2. 1通道的HEK293T细胞。
[0045] 首先利用荧光探针法验证HEK293T成功表达Kir2. 1通道蛋白，具体实验步骤依据 FluxOR?PotassiumIonChannelAssay说明书：
[0046] 1，移去24孔板中一个孔的培养基，然后中加入400uL上样缓冲液；所述的上样缓 冲液的组成及配比为（试剂A、试剂B、试剂C、试剂D来自试剂盒FluxOR?PotassiumIon Channel