切面红色土茯苓的有效部位及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及切面红色土茯苓的有效部位及其应用，属于中药技术的领域。 技术背景
[0002] 土茯苳为百合科植物光叶菝葜（Smilax glabra Roxb.)的干燥根莖，土茯苳的应 用广泛，是药食同源的传统药材，具有解毒，除湿，通利关节等功效。市售土茯苓切面均为 白色，，而产于贵州的土茯苓切面却为红色，故贵州苗族称之"红土茯苓"，是具有贵州地域 特点的苗族常用大宗传统药材，蕴藏量大并有资源优势。《土茯苓的生药学研究》（贵阳中 医学院学报，第33卷第3期，第18-20页，2011年5月。）对切面为红色（文中也称红棕 色）的土伏苓作了药材性状鉴别、粉末显微鉴别以及薄层鉴别，鉴别结果见《土茯苓的生药 学研究》一文，研究结果表明断面红色与断面白色的土茯苓（即普通土茯苓）在性状、显微 特征上均有较大的差异；该文参照2010版药典方法改进后进行了薄层鉴别研究，断面红色 或白色的土茯苓在斑点数量、颜色及亮度上有较大的区别，表明二者所含成分有较大差异。 《断面红棕色及类白色土茯苓抗炎作用的比较研究》（中药药理与临床，2012 ;28 (6)，第103 页-105页，2012年）对断面红棕色及类白色土茯苓抗炎作用进行了比较研究。研究结果表 明，在一般抗炎作用中，与白色土茯苓相比，断面红棕色土茯苓显示了其对渗出型炎症模型 (小鼠毛细血管通透性）、增殖型炎症模型（小鼠棉球肉芽肿）、炎症物质N0浓度测定（大 鼠急性炎症）均有更为优异的抑制作用。但是，目前尚未有关于切面红色土茯苓在抗炎等 功能中有效部位的确定、该有效部位的提取工艺及其它应用的研究和报道。
【发明内容】
[0003] 本发明目的在于，提供一种切面红色土茯苓的有效部位。此外本发明还提供了它 在治疗或预防类风湿性关节炎药物中的新应用。
[0004] 本发明的技术方案：切面红色土茯苓有效部位，为切面红色土茯苓的总黄酮部 位。
[0005] 上述的切面红色土茯苓有效部位中，所述的总黄酮部位为总黄酮的乙酸乙酯部 位。
[0006] 前述的切面红色土茯苓有效部位中，所述的总黄酮部位是黄酮类成分占总黄酮部 位固体的比例超过90 %。
[0007] 前述的切面红色土茯苓有效部位中，通过高效液相分析，所得图谱中含有以下7 个峰：
[0008] 峰1 (5-0-咖啡酰基莽草酸）：保留时间7. 14min，峰面积409455 ;
[0009] 峰2 (黄酮类成分）：保留时间10. 204min，峰面积211285 ;
[0010] 峰3 (新落新妇苷）：保留时间12. 786min，峰面积343899;
[0011] 峰4 (落新妇苷）：保留时间13. 569min，峰面积3238258;
[0012] 峰5 (新异落新妇苷）：保留时间15. 844min，峰面积632227 ;
[0013] 峰6 (异落新妇苷）：保留时间16. 556min，峰面积297982 ;
[0014] 峰7 (黄杞苷）：保留时间18. 083min，峰面积328977 ;
[0015] 色谱条件：
[0016] Hypersil 0DS2 C18色谱柱流动相：A为0? 05%磷酸水，B为乙腈，梯度洗脱：0~ 2〇1^11，10%~24%;梯度曲线均为直线；流速 ：0.811117111111;柱温：25°(：;检测波长 ：29111111;进 样量10 y L。
[0017] 前述的切面红色土茯苓有效部位中，该有效部位的制备方法依次包括以下步骤；
[0018] a、提取工艺：称取一定量的切面红色土茯苓药材粗粉，第一次加入10倍量的70% 的乙醇浸泡过夜，回流提取1. 5h(冷凝管有液滴滴出，并微沸后开始计时），过滤，得滤液； 第二次加入8倍量的70%的乙醇，回流提取lh(冷凝管有液滴滴出，并微沸后开始计时）， 过滤，得滤液；第三次加入8倍量的70 %的乙醇，回流提取lh(冷凝管有液滴滴出，并微沸 后开始计时），过滤，得滤液，合并3次滤液，60°C减压回收乙醇；
[0019] b、除糖工艺：将70%的乙醇提取物60°C减压回收乙醇，浓缩至与原药材的比例为 1. 5:1时，取出，放冷至室温后。量取浓缩液的体积，再缓慢加入一定量的95%的乙醇，使含 醇量达到85%，缓慢搅匀，于4°C的冰箱中放置过夜，第二日取出，过滤沉淀，再用95%的乙 醇洗涤沉淀3~5次，直至洗涤液颜色清淡为止，过滤沉淀，合并滤液，55°C减压回收乙醇， 得除糖中间物；
[0020] c、除鞣工艺：将除糖中间物加入一定量的蒸馏水，使其呈良好的流动状态，以流浸 膏完全溶解且不粘壁为宜，取出，放冷至室温，倒入适宜容器中，再加入4%的明胶水溶液， 两者体积比约为1: 1，加入明胶水溶液后，缓慢摇动使其充分混匀，不可用力搅拌，室温静置 lh，待其完全沉淀后，再加入一定量的95 %的乙醇，使其含醇量为85 %，缓慢摇动使其充分 混匀，不可用力搅拌，再室温静置lh后，用玻璃棒沿内壁缓慢搅拌使其充分混匀，让鞣质成 良好的沉淀状态，封口，室温下放置过夜，第二日取出，过滤沉淀，再用95%的乙醇洗涤沉淀 3~5次，直至洗涤液颜色清淡为止，过滤沉淀，合并所有滤液，50°C减压回收乙醇，得除鞣 中间物；
[0021] d、萃取工艺：将除鞣中间物加入一定量的甲醇溶液，使其充分溶解，除去甲醇不溶 物（即过量明胶），过滤，合并滤液，50°C减压回收甲醇至干。再加入一定量的蒸馏水，使其 充分溶解。取出，放冷，用乙酸乙酯进行萃取，静置分层得到下层水溶液，同法乙酸乙酯反复 萃取数次，直至乙酸乙酯层颜色清淡为止，合并乙酸乙酯萃取液，50°C减压回收溶剂至干， 使旋转蒸发瓶内形成良好的结晶状态，得成品。
[0022] 前述的切面红色土茯苓有效部位中，该有效部位的使用剂量为0. 05g/kg~ 0?25g/kg。
[0023] 前述的切面红色土茯苓有效部位中，该有效部位的使用剂量为0. lg/kg或0. 2g/ kg〇
[0024] 前述的切面红色土茯苓有效部位中，该有效部位可制成任何一种临床上或药学上 可接受的制剂。
[0025] 前述的切面红色土茯苓有效部位在制备治疗或预防类风湿性关节炎的药物中的 应用。
[0026] 前述的切面红色土茯苓有效部位在制备治疗或预防类风湿性关节炎的保健品或 者其它功能性食品的应用。
[0027] 前述的切面红色土茯苓有效部位中，切面红色土茯苓总黄酮部位对大鼠佐剂性关 节炎预防性给药实验中，所述的大鼠佐剂性关节炎的实验模型造模方法是：
[0028] a、第一次免疫刺激：取卡介苗冻干粉，80°C灭活lh后，与液体石蜡于研钵内研磨 混匀，制备成含卡介苗浓度3mg/ml的混悬液，即弗氏完全佐剂，备用；将大鼠使用乙醚麻醉 后，以75%酒精常规消毒，然后在右足足趾皮下以0. lml/只注射弗氏完全佐剂，达到刺激 机体免疫的目的；
[0029] b、正式造模：第一次免疫刺激7天后，取卡介苗冻干粉，80°C灭活lh后，与液体 石蜡于研钵内研磨混匀，制备成含卡介苗浓度15mg/ml的混悬液，即弗氏完全佐剂，备用； 将大鼠使用乙醚麻醉后，剔掉尾根部的毛发，以75%酒精消毒，然后在尾根部经皮内以 0. lml/只注射弗氏完全佐剂，以诱导大鼠佐剂性关节炎模型。
[0030] 与现有技术比较，本发明的有益效果如下：
[0031] 1、本发明切面红色土茯苓的有效部位为总黄酮部位，试验表明总黄酮部位在渗出 型炎症模型（小鼠腹腔毛细血管通透性）、增生型炎症模型（小鼠棉球肉芽肿）中的抑制率 优于其它部位，说明总黄酮部位确实为切面红色土茯苓抗炎有效部位。
[0032] 2、申请人经过反复试验、筛选、比较和总结，确定了切面红色土茯苓有效部位总 黄酮部位的制备方法（也即提取方法），试验结果以切面红色土茯苓中主要化学成分落新 妇苷峰面积计，其含量占总量的59. 8%，以总黄酮各成分的峰面积和计，其含量占总量的 94. 2%，表明该制备方法制得的总黄酮部位纯度高、效果好。试验结果还表明该制备方法重 复性、稳定性较好。
[0033] 3、动物急毒实验表明，本发明经口给药的安全范围很大、无毒性，安全性较高。
[0034] 4、本发明的总黄酮部位在低、中剂量（0. 05g/kg_0. 25g/kg)时，特别是剂量为 0. lg/kg时，该部位供试药对于小鼠慢性增殖型炎症的抑制率均高于其他剂量，且增大或减 小该最优剂量（〇. lg/kg)都使得切面红色土茯苓总黄酮对于增殖型炎症的抑制率降低，因 此本发明的总黄酮部位的最优剂量系0. lg/kg。同时，该有效部位还能下调胸腺、脾脏及 肾上腺指数，并且能够抑制关节滑膜TNF-a及脾脏中IL-6的表达。在三个剂量中，低剂 量（0. 1/kg)略优于中剂量（0. 2/kg)与高剂量（0.4/kg)。重复实验的结果也表明，低剂量 (0. 1/kg)对大鼠AA模型具有明显预防作用同时对于机体的物质代谢影响较小。
[0035] 5、本发明经试验表明，切面红色土茯苓有效部位具有治疗或预防类风湿性关节炎 的功能。
【附图说明】：
[0036] 图1是对二甲苯致小鼠腹部毛细血管通透性抑制率柱状图；
[0037] 图2是重复实验中对二甲苯致小鼠腹部毛细血管通透性抑制率柱状图；
[0038] 图3是贵州产切面红色土茯苓中精制总黄酮部位HPLC色谱图；
[0039] 图4是总黄酮部位HPLC特征性图谱图；
[0040] 图5是第1次实验对小鼠棉球肉芽肿抑制率柱状图；
[0041] 图6是第2次实验对小鼠棉球肉芽肿抑制率柱状图；
[0042] 图7是第3次实验对小鼠棉球肉芽肿抑制率柱状图；
[0043] 图8是AA大鼠原发性足肿胀度变化趋势图；
[0044] 图9是对AA大鼠原发性病变血清N0动态含量趋势图；
[0045] 图10是大鼠佐剂性关节炎预防性给药实验中AA大鼠体质量变化趋势图；
[0046] 图11是大鼠佐剂性关节炎预防性给药实验中AA大鼠足肿胀度变化趋势图；
[0047] 图12是大鼠佐剂性关节炎预防性给药实验中AA大鼠AI变化趋势图；
[0048] 图13是大鼠佐剂性关节炎预防性给药实验中AA大鼠脏器指数柱状图；
[0049] 图14是AA大鼠滑膜TNF-及脾脏IL-6mRNA相对表达量图；
[0050] 图15是大鼠佐剂性关节炎预防性给药重复实验中AA大鼠体质量变化趋势图；
[0051] 图16是大鼠佐剂性关节炎预防性给药重复实验中AA大鼠足肿胀度变化趋势图；
[0052] 图17是大鼠佐剂性关节炎预防性给药重复实验中AA大鼠AI变化趋势图；
[0053] 图18是大鼠佐剂性关节炎预防性给药重复实验中AA大鼠脏器（脾脏）指数柱状 图；
[0054] 图19是大鼠佐剂性关节炎预防性给