种植体材料2-B (实验组）两组牙种植体材 料各3片置于灭菌湿润平皿中。分别取50 μ L牙龈卟啉单胞菌P. g含量为I X 106cfu/mL的 菌悬液滴加在试件表面，盖玻片覆盖，以使试验菌液散开而无溢出，厌氧培养箱中培养12h 后向各平皿中加入5mL BHI液体培养基后漩涡振荡并加入无菌水进行10倍稀释，分别得 到牙种植体材料2-BCK组的稀释液和牙种植体材料2-B组的稀释液。分别取100 μ L牙种 植体材料2-BCK组的稀释液和牙种植体材料2-Β组的稀释液在BHI平板上均匀推开，厌氧 培养12h后平板计数。
[0106] 抗菌率=(对照组菌落数-实验组菌落数）/对照组菌落数X100%。
[0107] 结果如表1所示，经过12h厌氧培养后，牙种植体材料2-B对牙龈卟啉单胞菌P. g 的抗菌率达到92. 26 %，说明牙种植体材料2-B对种植体周围炎的敏感菌有较好的抑制作 用。
[0108] 表1、材料表面菌落计数及抗菌率
[0110] 2、Actin免疫荧光染色实验
[0111] 成骨细胞的分离、培养：取鼠颅顶骨，种植于培养瓶，进行培养、传代和鉴定，获得 成骨细胞的纯培养物。
[0112] 将上述分离培养的纯成骨细胞接种于牙种植体材料2-B(改性组）和未涂层的牙 种植体材料纯钛（对照组）表面，分别培养不同的时间段，通过细胞骨架蛋白（actin)的 免疫荧光染色来观察细胞的粘附、铺展和形态。具体如下：分别将改性组和对照组的牙种植 体材料放入24孔板中，每孔1片，设2个时间点（24h和3d)，每组每个时间点设4孔。将第 3代成骨细胞悬液接种于孔板中，每孔的细胞密度为I X IO4个/mL，每孔lmL，将培养板放入 培养箱中继续培养。分别于接种后24h，3d进行如下处理：室温下用4%的多聚甲醛固定贴 壁的成骨细胞30min，用PBS缓冲液漂洗3次洗去残留固定液，然后用0. 3% Triton X-100 溶液作用30min，37°C条件下用5%的山羊血清封闭半小时，加一抗4°C孵育过夜。一抗孵育 结束，洗去多余一抗，加荧光二抗FITC-山羊抗兔IgG，室温条件下避光孵育2h。二抗孵育 结束，洗去多余二抗，用PBS缓冲液漂洗，滴加50%缓冲甘油封片，最后荧光显微镜下观察。
[0113] 结果如图1所示，相对于牙种植体材料纯钛（对照组），Actin免疫荧光染色表明 牙种植体材料2-B(改性组）表面的细胞黏附更多，细胞骨架蛋白表达更多，更利于细胞的 黏附和伸展。
[0114] 3、成骨细胞增殖实验
[0115] 将牙种植体材料纯钛（对照组）和牙种植体材料2-B (改性组）两组牙种植体材 料置于24孔板中，每孔1片，设3个时间点（ld、4d和7d)，每组每个时间点设4孔。将第3 代成骨细胞悬液接种于孔板中，每孔的细胞密度为IX IO4个/mL，每孔lmL，培养板放入培 养箱中继续培养。每隔三天换一次细胞培养液。
[0116] 分别在接种的第1、4和7天进行MTT检测，即每次检测8孔（对照组4孔，改性组 4孔）。具体方法为：采用PBS缓冲液洗涤后，每孔重新加入ImL新鲜培养基和40 μ L的MTT 液，放入培养箱中继续培养4小时。孵育结束后，小心吸弃孔中液体，每孔加入420 μ L的二 甲基亚砜（DMSO)，培养箱中培养0. 5小时，加样枪吹打使结晶物充分溶解，将24孔板内的 液体转移至96孔板中，24孔板的1孔转移为96孔板的2孔，96孔板中的每孔200 μ L液体 (严格保证量相等），用HTS 7000plus多孔板高效分析仪在570nm波长处测其吸光光度值 (0D值）并进行统计分析。
[0117] 结果如图2所示，在成骨细胞接种的第4天和第7天，相对于牙种植体材料纯钛， 牙种植体材料2-B(改性组）表面细胞增殖情况明显优于纯钛组，在成骨细胞接种的第7 天，改性组的表面细胞增殖率是对照组的1. 2倍，差异有统计学意义（P〈0. 05)，说明具有更 强的增殖活性。
[0118] 上述结果表明，牙种植体材料2-B具有良好的生物相容性、抗凋亡和促血管生成 活性，能够支持成骨细胞、软骨细胞的粘附、存活、生长与分化，促进血管内皮细胞的存活、 增殖、迀移和形成毛细管样的管腔结构。同时该种植体能够抑制牙周常见致病菌的粘附和 存活，具有持久、高效的杀菌能力，能够加速种植体周骨创的愈合并实现种植体一骨界面的 化学结合，提高口腔种植的治疗效果，缩短治疗时间。
[0119] 实施例3、制备牙种植体材料3
[0120] 一、制备牙种植体材料3-A
[0121] 牙种植体材料3-A由钛片（基体）、涂覆于钛片表面的聚-L-赖氨酸层（阳离子聚 合物层）、涂覆于聚-L-赖氨酸层表面的硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合 层（阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层）、涂覆于硫酸软骨素层-氯化壳 聚糖-多肽A偶联物层复合层表面的硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层（阴离子多糖层-抗 菌肽层复合层）组成，硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层由硫酸软骨素 层和氯化壳聚糖-多肽A偶联物层组成，氯化壳聚糖-多肽A偶联物层位于硫酸软骨素层 的表面；硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层由硫酸软骨素层和抗菌肽层组成，抗菌肽层位于 硫酸软骨素层的表面。
[0122] 其制备方法如下：
[0123] 1、称取0. 0463g多肽A，将其溶解于IOmL超纯水中，制备成浓度为4. 63mg/mL的多 肽A溶液，备用。
[0124] 2、称取0. 024g碳二亚胺，将其溶解于IOmL超纯水中，制备成浓度为2. 4mg/mL的 碳二亚胺溶液，备用。
[0125] 3、向步骤1制备的IOmL浓度为4. 63mg/mL的多肽A溶液中加入0. 0055g N-羟基 琥珀酰亚胺，将多肽A活化0. 5h，获得活化后的多肽A溶液。
[0126] 4、将步骤3的活化后的IOmL多肽A溶液加入到30mL pH值为6,浓度为16. 67mg/ mL的氯化壳聚糖溶液中，继续搅拌30min，获得氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液。
[0127] 5、将步骤将2制备的IOmL浓度为2. 4mg/mL的碳二亚胺溶液加入到步骤4的氯化 壳聚糖-多肽A的混合溶液中，获得碳二亚胺溶液和氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液，将碳 二亚胺溶液和氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液机械搅拌6h，获得反应后的溶液；将反应后 的溶液装入截留分子量为8000的透析袋中，在去离子水中透析48h，每隔6h换水一次，收集 透析袋中的溶液，获得透析后的溶液。
[0128] 6、将步骤5获得的透析后的溶液，在_70°C冷冻干燥，获得氯化壳聚糖-多肽A偶 联物。
[0129] 7、将钛片抛光后浸入浓度为I. 4M的H3PO4溶液中，在60°C温度条件下浸泡4h，然 后用去离子水冲洗3次，60°C真空干燥，获得磷酸处理后的钛片，备用。
[0130] 8、将步骤7获得的磷酸处理后的钛片先置于pH值为7,浓度为2. Omg/mL的 聚-L-赖氨酸盐酸盐溶液（阳离子聚合物溶液）中浸泡30min，然后在双蒸水浸洗lmin，最 后在20-30°C自然干燥，获得表面涂覆有聚-L-赖氨酸的材料（涂覆有阳离子聚合物的材 料），备用。
[0131] 9、称取20mg步骤6获得的氯化壳聚糖-多肽A偶联物，将其溶解于IOmL去离子 水中，制备成氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液。该氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液由溶质 和溶剂组成，溶质为氯化壳聚糖-多肽A偶联物，溶剂为水，氯化壳聚糖-多肽A偶联物在 氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中的浓度为2mg/mL，氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液的pH 值为6。
[0132] 10、首先将步骤8制备的表面涂覆有聚-L-赖氨酸的材料在pH值为6，浓度为2mg/ mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液（阴离子多糖溶液）中浸泡15min，用去离子水冲洗3次后， 20-30°C自然干燥，获得涂覆有硫酸软骨素的材料（涂覆有第一层阴离子多糖的材料）；然 后再将该涂覆有硫酸软骨素的材料浸泡于步骤9制备的pH值为6,浓度为2mg/mL氯化壳聚 糖-多肽A偶联物溶液中15min，用去离子水冲洗3次，20-30°C自然干燥，获得涂覆有氯化 壳聚糖-多肽A偶联物的材料。
[0133] 11、首先将步骤10制备的涂覆有氯化壳聚糖-多肽A偶联物层的材料在pH值为 6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液（阴离子多糖溶液）中浸泡15min，用去离子 水冲洗3次后，20-30°C自然干燥，获得涂覆有硫酸软骨素的材料（涂覆有第二层阴离子多 糖的材料）；将该涂覆有硫酸软骨素的材料浸泡于pH值为7,浓度为2mg/mL的抗菌肽溶液 中15min，用去离子水冲洗3次，20-30°C自然干燥，获得涂覆有抗菌肽的材料，即为牙种植 体材料3-A。
[0134] 二、制备牙种植体材料3-B
[0135] 牙种植体材料3-B由钛片（基体）、包覆在基体表面的1层聚-L-赖氨酸层（阳 离子聚合物层）、18层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层（阴离子多糖 层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层）和4层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层（阴离 子多糖层-抗菌肽层复合层）组成，硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层 由硫酸软骨素层和氯化壳聚糖-多肽A偶联物层组成，氯化壳聚糖-多肽A偶联物层位于 硫酸软骨素层的表面；硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层由硫酸软骨素层和抗菌肽层组成， 抗菌肽层位于硫酸软骨素层的表面。
[0136] 牙种植体材料3-B是在步骤一制备的牙种植体材料3-A的表面重复操作A四次， 得到在牙种植体材料3-A表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合 层的牙种植体材料，将该牙种植体材料称为牙种植体材料3-A4，在牙种植体材料3-A4的表 面进行操作B -次，得到在牙种植体材料3-~表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合 层的牙种植体材料，将该牙种植体材料称为牙种植体材料3-A4B ;在牙种植体材料3-A4B的 表面重复操作A四次，得到在牙种植体材料3-A4B表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚 糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料，将该牙种植体材料称为牙种植体材料3-A4BA4， 在牙种植体材料3-A4BAj^表面进行操作B -次，得到在牙种植体材料3^#44表面包覆I 层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料，将该牙种植体材料称为牙种植体材料 3-(A4B) 2;在牙种植体材料3-(A 4B) 2的表面重复操作A四次，得到在牙种植体材料3 (A 4B) 2表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料，将该 牙种植体材料称为牙种植体材料3- (A4B) 2A4，在牙种植体材料3- (A4B) 2A4的表面进行操作B 一次，得到在牙种植体材料3-(A4B)2A4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙 种植体材料，将该牙种植体材料称为牙种植体材料3- (A4B) 3;在牙种植体材料3- (A 4B) 3的表 面重复操作A五次，得到在牙种植体材料3- (A4B) 3表面包覆5层硫酸软骨素层-氯化壳聚 糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料，将该牙种植体材料称为牙种植体材料3-B。其 制备方法如下：
[0137] 上述操作A均为将相应的牙种植体材料（第一次重复操作A中的相应的牙种植 体材料为牙种植体材料3-A)在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液（阴 离子多糖溶液）中浸泡15min，用去离子水冲洗3次后，20-30°C自然干燥，获得涂覆有硫酸 软骨素的材料（涂覆有阴离子多糖的材料），然后再将该涂覆有硫酸软骨素的材料浸泡于 pH值为6,浓度为2mg/mL氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中15min，用去离子水冲洗3次， 20-30°C自然干燥，获得涂覆有硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的材料 (涂覆有阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的材料），共进行17次重复 操作A。
[0138] 上述操作B均为将相应的牙种植体材料（第一次重复操作B中的相应的牙种植体 材料为为牙种植体材料3-A4)在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液（阴 离子多糖溶液）中浸泡15min，用去离子水冲洗3次后，20-30°C自然干燥，获得涂覆有硫酸 软骨素的材料（涂覆有阴离子多糖的材料）；将涂覆该有硫酸软骨素的材料浸泡于PH值为 7,浓度为2mg/mL的抗菌肽溶液中15min，用去离子水冲洗3次，20-30°C自然干燥，获得涂 覆有硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的材料（涂覆有阴离子多糖层-抗菌肽层复合层的材 料），共进行3次重复操作B。
[0139] 实施例4、制备牙种植体材料4
[0140] 一、制备牙种植体材料4-A
[0141] 牙种植体材料4-A由钛片（基体）、涂覆于钛片表面的聚-L-赖氨酸层（阳离子聚 合物层）、涂覆于聚-L-赖氨酸层表面的硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合 层（阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层）、涂覆于硫酸软骨素层-氯化壳 聚糖-多肽A偶联物层复合层表面的硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层（阴离子多糖层-抗 菌肽层复合层）组成