T)与雄激素受体结合后，雄激素受体可以进入细胞核 与转录激活域相结合从而启动下游基因表达。目前临床使用的雄激素受体拮抗剂如比卡鲁 胺（Bicalutamide)及MDV3100 (Enzalutamide)都是与雄激素受体的配体结合区（LBD)结 合而抑制了其转录活性。
[0067] 雄激素受体的转录活性：雄激素受体是典型的核受体转录因子，通过介导雄激素 的作用调控多种真核基因的表达。其具体功能为通过转录激活的方式调控其下游靶基因的 转录与表达，在配体依赖性途径与配体非依赖性途径下均能发挥转录活性。
[0068] 缺失配体结构域的雄激素受体：雄激素受体LBD区由12段不连续的a螺旋组成， 形成一个配体结合口袋，具有结合配体的功能。雄激素受体在突变的情况下可能缺失LBD 区，缺失了LBD区的雄激素受体具有与完整雄激素受体相同的组成性转录激活功能。
[0069] 焚光素酶报告基因检测（Luciferaseassay):焚光素酶（Luciferase,Luc) 报告基因检测系统是以荧光素（Luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase)活性的一种报告系统。焚光素酶可以催化Luciferin氧化成Oxy-luciferin， 在Luciferin氧化的过程中，会发出生物焚光（Bioluminescence)。然后可以通过焚光测定 仪也称化学发光仪（Luminometer)或液闪测定仪测定Luciferin氧化过程中释放的生物焚 光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达，是检测 转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。
【附图说明】
[0070] 图1所示为本发明中药复方组合物对各株前列腺癌细胞增殖活性的抑制效果。
[0071] 图I(A)表示本发明中药复方组合物对各株前列腺癌细胞增殖的抑制及在正常前 列腺上皮细胞上的选择性效果。
[0072] 图I(B)表示本发明中药复方组合物对LNCaP细胞的增殖抑制效果呈时间梯度及 浓度梯度依赖性。
[0073] 图I(C)表示本发明中药复方组合物对22RV1细胞的增殖抑制效果呈时间梯度及 浓度梯度依赖性。
[0074] 图I(D)表示本发明中药复方组合物对PC-3细胞的增殖抑制效果呈时间梯度及浓 度梯度依赖性。
[0075] 图I(E)表示本发明中药复方组合物对病人肿瘤组织源性原代分离的前列腺癌细 胞的增殖抑制效果呈时间梯度及浓度梯度依赖性。
[0076] 图2所示为本发明中药复方组合物对各株前列腺癌细胞的克隆形成的抑制效果。
[0077] 图2左边表示本发明中药复方组合物分别对LNCaP，22RV1的克隆形成抑制效果的 白光照片。
[0078] 图2右边表示本发明中药复方组合物分别对LNCaP，22RV1的克隆形成抑制效果的 统计结果。
[0079] 图3所示为本发明中药复方组合物对前列腺癌细胞的诱导凋亡作用。
[0080] 图3 (A)表示本发明中药复方组合物对LNCaP细胞的诱导凋亡作用。
[0081] 图3(B)表示本发明中药复方组合物对22RV1细胞的诱导凋亡作用。
[0082] 图3(C)表示本发明中药复方组合物对LNCaP，22RVl的诱导凋亡作用的统计结果。
[0083] 图4所示为本发明中药复方组合物对前列腺癌细胞迀移、侵袭的抑制效果。
[0084] 图4上表示本发明中药复方组合物对PC-3细胞横向迀移过程的抑制作用。
[0085] 图4中表示本发明中药复方组合物对LNCaP细胞纵向迀移过程的抑制作用。
[0086] 图4下表示本发明中药复方组合物对22RV1细胞侵袭过程的抑制作用。
[0087]图5所示为本发明中药复方组合物通过影响雄激素受体信号通路从而抑制前列 腺癌的分子机理。
[0088] 图5 (A)表示本发明中药复方组合物对LNCaP细胞中在双氢睾酮（DHT)诱导下检 测雄激素受体转录活性的荧光素酶报告基因表达的抑制效果。
[0089] 图5 (B)表示本发明中药复方组合物对22RV1细胞中在双氢睾酮（DHT)诱导下检 测雄激素受体转录活性的荧光素酶报告基因表达的抑制效果。
[0090] 图5 (C)表示本发明中药复方组合物对PC-3细胞中在双氢睾酮（DHT)诱导下外源 转染野生型雄激素受体（AR)后检测雄激素受体转录活性的荧光素酶报告基因表达的抑制 效果。
[0091] 图5 (D)表示本发明中药复方组合物不影响LNCaP细胞中雄激素受体（AR)基因自 身的转录水平。
[0092] 图5 (E)表示本发明中药复方组合物下调LNCaP细胞中雄激素受体（AR)蛋白的表 达水平。
[0093] 图5 (F)表示本发明中药复方组合物抑制雄激素受体（AR)对其三个经典下游靶基 因TMPRSS2,FKBP5,PSA的转录激活。
[0094] 图6所示为本发明中药复方组合物在裸鼠皮下荷瘤体内动物模型中抑制22RV1异 种移植肿瘤的生长。
[0095] 图6(A)表示本发明中药复方组合物对22RV1异种移植肿瘤生长模型中剥离的肿 瘤体积抑制效果的白光照片。
[0096] 图6(B)表示本发明中药复方组合物对22RV1异种移植肿瘤生长模型中肿瘤体积 随天数增长的抑制效果的统计结果。
[0097] 图6(C)表示本发明中药复方组合物对22RV1异种移植肿瘤生长模型中剥离的肿 瘤重量抑制效果的白光照片。
[0098] 图7所示为本发明中药复方组合物在裸鼠原位异种移植肿瘤生长转移体内动物 模型中抑制22RV1-1UC异种移植肿瘤的生长与转移。
[0099] 图7(A)表示本发明中药复方组合物对22RV1-1UC异种移植肿瘤生长转移模型中 肿瘤荧光强度抑制效果的活体成像结果。
[0100] 图7(B)表示本发明中药复方组合物对22RV1-1UC异种移植肿瘤生长转移模型中 原位肿瘤转移到全身脏器形成转移结节的抑制效果的统计结果。
[0101] 图7(c)表示本发明中药复方组合物对22RV1-1UC异种移植肿瘤生长转移模型中 全身肿瘤荧光强度随天数增长的抑制效果的统计结果。
[0102] 图7(D)表示本发明中药复方组合物在灌胃给药方式下对裸鼠体重的影响。
【具体实施方式】
[0103] 结合以下具体实施例和附图，对本发明的技术作进一步的详细说明。本发明的保 护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想 到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施例所描 述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要 求书中所详细描述的本发明。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及 的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
[0104] 实施例1 :本发明中药复方组合物的制备
[0105] 本实施例中具有抗前列腺癌作用的中药复方组合物，由以下原料制成：取臭椿皮 9份，白花蛇舌草30份，莪术15份，丹参30份，夏枯草15份，甘草9份，加入中药复方组合 物药材量的15倍体积蒸馏水浸泡3小时；于中药自动煎药器内煎煮，煎煮次数为2次，每次 煎煮1小时；制备得到的中药粗提物于中药自动煎药器上开盖蒸发浓缩至终体积浓缩为70 毫升；浓缩得到的中药水煎剂母液终浓度约为1. 5克生药/毫升。将所得到的中药浓缩液 通过0. 22微米微孔滤膜过滤除菌后得到中药水煎剂母液，于4摄氏度冰箱保存备用。
[0106] 以下实施例2-7中所采用的中药复方组合物为实施例1所制备
[0107] 实施例2 :本发明中药复方组合物对不同前列腺癌细胞的增殖活性、克隆形成的 抑制作用及对不同前列腺癌细胞的诱导凋亡作用 [0108] 技术方法：
[0109] 1.细胞的培养
[0110] 本实验中所用的细胞（LNCaP，22RVl，PC-3,PNT1A)均购于中科院上海细胞库； 另一株细胞来自于上海市长海医院前列腺癌病人肿瘤组织源性原代分离的前列腺癌细胞 (PCa原代细胞），细胞培养于37摄氏度恒温培养箱（湿度95 %，CO2浓度5 % )中，培养基 为含10%胎牛血清（?1〇拉）的1^]\〇-1640(6让(3〇)〇
[0111] 2.SRB(磺酰罗丹明）法测定细胞增殖
[0112] 不同的前列腺癌细胞株以5XIO3个/孔密度接种至96孔板（Corning)，24小时 后，加入不同浓度本发明中药复方组合物，对照组加入等量的PBS，各组设6个复孔。药物 处理48小时后，加入预冷却的TCA(三氯乙酸，50%，w/v)于4摄氏度孵育60分钟固定细 胞。固定后，流水冲洗5遍，风干。每孔加入50微升SRB染液（4%，w/v)，室温孵育10分 钟染色。将染液吸出，每孔加入1 %醋酸100微升洗5遍，除去未结合染料。风干后，每孔 加入浓度为10毫摩尔Tris溶液100微升，震荡溶解结合的SRB染料。将96孔板置于酶标 仪（SPECTRAMAX190)中，在515纳米波长下测定OD值。统计分析中药复方组合物对于细 胞增殖水平的影响。为检测本发明中药复方组合物对前列腺癌细胞株的抑制作用是否呈浓 度梯度依赖性及时间浓度梯度依赖性，接种不同的前列腺癌细胞株以5XIO3个/孔密度至 96孔板，24小时后，加入不同浓度本发明中药复方组合物，对照组加入等量的PBS，各组设6 个复孔。分别继续培养24小时，48小时和72小时后，用上述同样的方法检测中药复方组 合物对于细胞增殖水平的影响。
[0113]
[0114] 3.克隆形成实验
[0115] 克隆形成法（Colonyformation)可用来检测肿瘤细胞体外形成克隆的增殖和成 瘤能力。肿瘤细胞在体内可以通过自身分裂增殖最终形成肉眼可见的实体瘤，在体外实验 时，可以根据肿瘤细胞的克隆形成能力来反映其在体内生成实体瘤能力的强弱。将1000个 前列腺癌细胞接入到6孔板中，待细胞贴壁后加入不同浓度本发明中药复方组合物，一周 后用多聚甲醛将细胞固定，然后用结晶紫染色，拍照并统计克隆数，每组实验重复三次。
[0116] 4.流式细胞术检测细胞凋亡
[0117] 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS)只分布在细胞膜脂质 双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS)由脂膜内侧翻向外侧。 AnnexinV是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度 亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被当作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将AnnexinV进行荧光素（EGFP、FITC等） 标记，以标记了的AnnexinV作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡 的发生。碘化丙啶（Propidiumiodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但 对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将AnnexinV与 PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。具体操作步骤如下：不同前列 腺癌细胞经过本发明中药复方组合物不同浓度的药液处理36小时后，收集悬浮细胞离心 (2000转/分钟，离心5分钟）；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集；用PBS洗涤细胞二 次（2000转/分钟，离心5分钟）收集1~