5XIO5细胞；加入500微升的Bindingbuffer 悬浮细胞；加入5微升AnnexinV-FTIC混匀后，加入5微升PI，混匀；室温、避光、反应5~ 15分钟；在1小时内，进行流式细胞仪的上机检测。
[0118] 实验结果：
[0119] 如图1所示，本发明中药复方组合物对各株前列癌细胞，包括病人组织来源的原 代前列腺癌细胞的增殖都有很显著的抑制效果，其48小时半数抑制浓度约为5微克/毫 升。本发明中药复方组合物除了对常用前列腺癌细胞株及病人组织来源的原代前列腺癌 细胞的增殖抑制效果显著之外，对正常前列腺上皮细胞株PNTlA虽然在高浓度下（100微克 /毫升）也有轻微的抑制，但在低浓度下抑制效果很小，显示出其对正常细胞和前列腺癌细 胞之间具有很好的选择性。同时，本发明中药复方组合物对各株前列腺癌细胞增殖的抑制 效果呈现浓度梯度依赖性及时间梯度依赖性。另外，如图2所示，本发明中药复方组合物也 强烈抑制各株前列腺癌细胞的克隆形成。图3显示本发明中药复方组合物显著促进前列腺 癌细胞LNCaP，22RVl的凋亡。实验结果提示本发明中药复方组合物可以作为抗前列腺癌生 长的潜在药物。
[0120] 实施例3 :本发明中药复方组合物对前列腺癌细胞迀移、侵袭能力的抑制作用
[0121] 技术方法：
[0122] 1.划线迀移实验
[0123] 为研究本发明中药复方组合物是否抑制前列腺癌细胞的横向迀移，将PC-3细胞 接种至6孔板，在37摄氏度5%CO2培养箱中常规培养24小时，至细胞长至100%满。更 换无血清培养基，继续培养12小时。在长满细胞的培养孔中，用200微升的灭菌枪头进行 划痕，划痕后用PBS洗细胞两次，将浮起的细胞吸去，每孔中加入1毫升完全培养基。分别 向细胞培养孔中加入不同浓度中药复方组合物，将培养板放入〇) 2培养箱，37摄氏度继续常 规培养24小时。显微镜下观察细胞向划线部分运动的情况，拍照。统计分析不同剂量药物 组迀移进入划线区域的细胞数量，确定药物对细胞迀移能力的影响。
[0124] 2.Transwell小室迀移实验
[0125] Transwell小室底部所铺的透水聚碳酸酯薄膜上有大量直径8微米的微孔，实验 时，将Transwell小室放入24孔板中，聚碳酸酯薄膜将24孔板的每个孔分别分为上、下两 室，Transwe11小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培 养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。将细胞接种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性， 下层培养液中的成分可以诱导到上室内的细胞向下室迀移，使得细胞从薄膜的上室面移动 到下室面，因此本实验是研究细胞运动的经典实验。为研究本发明中药复方组合物是否抑 制前列腺癌细胞的纵向迀移，利用Transwell小室，在上室接入过量的LNCaP细胞，这样 细胞就会向下室迀移；同时加入不同浓度的中药复方组合物，12小时后拍照统计细胞迀移 率。
[0126]
[0127] 3.Transwell法检测细胞侵袭
[0128] 将Transwell小室放入24孔板中，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养 液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，Transwell小室上室预先铺一层胶原基质Matrigel， 再将细胞接种其中。由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以诱导上室内的细 胞向下迀移，使得细胞从薄膜的上室面移动到下室面。但是，肿瘤细胞若要运动至下室，即 必须先利用自身释放的各种化学物质溶解胶原基质，再通过溶解出的空洞运动，这一过程， 与肿瘤细胞在体内的浸润过程相似，可以用来反映肿瘤细胞的侵袭浸润能力。因此本实验 是研究细胞侵袭的经典实验。取对数生长期的肿瘤细胞以5XIO4个/孔接种到Transwell 小室的上室中，加药组分别加入相应浓度的中药复方组合物，对照组加入等量的PBS。下室 中分别各加入完全培养基。37摄氏度5%CO2培养箱中培养12小时。取出Transwell小 室，用棉签蘸水擦拭Transwell小室的上室一面，将未穿膜的细胞擦掉。将Transwell小室 在4%多聚甲醛中室温固定10分钟，经1%结晶紫染色10分钟后用自来水冲洗。显微镜下 拍照，计数每孔内上下左右中5个视野的细胞数目。每组平均设3个复孔。统计比较不同剂 量中药复方组合物加药组的穿膜细胞数量，确定中药复方组合物对细胞侵袭能力的影响。
[0129]
[0130] 实验结果：
[0131] 结果如图4所示，本发明中药复方组合物在较低剂量下（2.5微克/毫升）就可以 有效抑制PC-3的横向迀移、LNCaP的纵向迀移及22RV1的侵袭能力。图4左边分别是三种 细胞的实验白光照片结果，图4右边分别是三种细胞的统计结果。实验结果提示本发明中 药复方组合物可以作为抗前列腺癌转移的潜在药物。
[0132] 实施例4 :本发明中药复方组合物体外抑制雄激素受体的转录活性
[0133] 技术方法：双荧光素酶报告基因检测
[0134] 本实验所用质粒为MMTV-LUC和Renila。MMTV-LUC是带有雄激素受体转录激活元 件（ARresponseelements)和荧光素酶的报告基因质粒，雄激素受体与雄激素结合后可以 启动该质粒表达出荧光素酶，荧光素酶可以催化其底物荧光素发出荧光，通过检测荧光的 强度便能检测雄激素受体激活的程度；Renila内参报告基因带有海肾荧光素酶的启动子 区域，能表达海肾荧光素酶，通过该质粒可以确定每组细胞的转染效率是否一致，雄激素对 Renila内参报告基因质粒没有影响。为初步探究本发明中药复方组合物能否抑制雄激素 受体（Androgenrec印tor,AR)的转录活性，我们分别在前列腺癌细胞株22RV1和LNCaP中 用脂质体 2000(Lipofectamine2000Reagent)转染MMTV-LUC和Renila两种质粒，此外还 在不表达AR的PC-3细胞中转入外源野生型AR;细胞转染24小时后加入雄激素双氢睾酮 (Dihydrotestosterone，DHT)激活MMTV-LUC报告基因表达萤火虫荧光素酶；在加入DHT的 同时再加入不同浓度中药复方组合物，处理12小时后裂解细胞并测定两种报告基因的荧 光表达强度，最终结果用MMTV-LUC的活性与内参质粒Renila的活性相比表示，每组实验重 复三次。
[0135] 实验结果：
[0136] 如图5A、5B、5C所示，本发明中药复方组合物在不同前列腺癌细胞株中都能够剂 量依赖性地降低雄激素（DHT)诱导的MMTV-LUC报告基因的活性，并且在低浓度（约2. 5微 克/毫升）就能够达到半数抑制率（IC5。)，证明本发明中药复方组合物可以体外抑制雄激 素受体的转录活性。
[0137] 实施例5 :本发明中药复方组合物显著下调雄激素受体蛋白水平及其靶基因的转 录水平
[0138] 技术方法：
[0139] 1?聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction，PCR)实验
[0140] LNCaP细胞经不同浓度中药复方组合物处理后，用TRIzol分离提取RNA，RNA经反 转录后得到cDNA，用AR特异性引物通过反转录PCR(RT-PCR)定性检测AR基因的mRNA表 达水平；用不同的AR下游靶基因特异性引物（TMPRSS2,FKBP5和PSA)通过荧光实时定量 PCR(Q-PCR)检测三者的mRNA的表达水平。
[0141] 2.免疫印迹（Westernblot)实验
[0142] LNCaP细胞经加不同浓度中药复方组合物处理后，细胞经裂解提取蛋白，蛋白经 煮沸变性后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品，然后转移到硝酸纤维素薄膜上，首先 用雄激素受体AR的抗体孵育两小时，再用带有荧光标记的二抗孵育一小时，最后用Licor Odyssey双色红外激光成像系统检测本发明中药复方组合物对AR蛋白表达水平的影响。
[0143] 实验结果：
[0144] 如图5E所示，免疫印迹实验（Westernblot)证明本发明中药复方组合物能够显 著抑制雄激素受体的蛋白表达水平；随着加药浓度的增大，AR的蛋白表达量随之明显降 低，提示本发明中药复方组合物对前列腺癌肿瘤细胞增殖和迀移的抑制作用可能是通过抑 制雄激素受体信号通路实现的。RT-PCR实验发现在一定浓度下本发明中药复方组合物并没 有影响AR的mRNA水平（图f5D)，但显著抑制了其下游靶基因的转录激活（图5F)。Q-PCR 实验显示AR下游的三个经典代表性靶基因TMPRSS2,FKBP5和PSA的转录水平均受到本发 明中药复方组合物的显著抑制。以上实验结果从多个角度证明了本发明中药复方组合物对 前列腺癌生长与转移的抑制是通过抑制雄激素受体信号通路活性而实现的。
[0145] 实施例6 :本发明中药复方组合物在裸鼠前列腺癌皮下荷瘤生长模型及前列腺癌 原位生长转移模型中的抑制效果
[0146] 技术方法：
[0147] 1.本发明中药复方组合物对裸鼠前列腺癌皮下荷瘤生长模型的抑制作用
[0148] 利用人前列腺癌细胞22RV1建立裸鼠前列腺癌皮下荷瘤生长模型。将500万个 22RV1细胞皮下注射到7周龄雄性免疫缺陷小鼠（BLAB/c-nude，裸鼠）右侧背部皮下，待皮 下肿瘤长到100立方毫米左右时，将小鼠分为8组（平均肿瘤体积相同），依次为模型组， 对照组，中药复方（不含臭椿皮）组，中药复方低剂量组，中药复方高剂量组，复方苦参注射 液组，环磷酰胺（Cycl〇ph〇Sphamide，CTX)组，CTX+中药复方高剂量组。给药途径及给药剂 量依次如下所述：模型组小鼠不做任何处理，对照组小鼠每天给予等量的PBS灌胃（0. 1毫 升），中药复方（不含臭椿皮）组小鼠每天给予等量的不含臭椿皮的中药复方（〇. 1毫升，具 体煎制方法与本发明中药复方一致，不加臭椿皮生药即可，相应减少浓缩终体积，实际剂 量15克/千克/天），中药复方低剂量组小鼠每天给予1/2量的中药复方母液灌胃（0. 05毫 升，实际剂量7. 5克/千克/天），中药复方高剂量组小鼠每天给予中药复方母液灌胃（0. 1 毫升，母液浓度1. 5克生药/毫升，实际剂量15克/千克/天），复方苦参注射液组小鼠每 天给予〇. 1毫升复方苦参注射液腹腔注射（实际剂量〇. 6克/千克/天），CTX组小鼠每天 给予0. 05毫升CTX腹腔注射（实际剂量0. 05克/千克/天），CTX+中药复方高剂量组小 鼠每天给予0. 05毫升CTX腹腔注射及0. 1毫升中药复方母液灌胃（实际剂量0. 05克/千 克/天+15克/千克/天）。每隔2天量取一次小鼠背部皮下荷瘤的肿瘤体积，按照公式体 积=长X宽2XO. 52计算，统计肿瘤体积。每隔2天量取一次小鼠体重。施药14天后处 死小鼠，取皮下肿瘤，拍照。
[0149] 2.本发明中药复方组合物对裸鼠前列腺癌原位荷瘤生长转移模型的抑制作用
[0150] 将转移性前列腺癌细胞22RV1转入萤火虫荧光素酶（Luciferase)表达质粒（该 质粒带有G418抗性筛选标记），并用G418筛选稳转细胞系，稳转细胞可以表达荧光素酶，荧 光素酶与其底物荧光素接触后会发出荧光，荧光的范围和强度与肿瘤的位置和体积呈正相 关性，这样即可以通过动物活体成像系统检测到肿瘤细胞的数量和位置。构建好的稳转细 胞系命名为22RV1-1UC，将22RV1-1UC细胞用基质胶混匀注射到小鼠前列腺背侧叶，待肿瘤 异种移植成功后通过活体成像技术可以检测到小鼠体内的22RV1-1UC细胞的生长和转移 情况。具体操作过程为：7周龄雄性免疫缺陷型小鼠麻醉后，行