别取各时间点小鼠主动脉血管置于冰浴试管中，加入冰浴裂解液300?500 μ l(10mmol/L HEPES, pH7.9,0.5mmol/L KC1，0.5mmol/L EDTA, lmmol/L DTT，0.5mmol/L PMSF和5%丙三醇)，DMSF、抑亮肽及抑肽酶各2 μ 1，混匀，冰浴放置15min。采用BCA比色法试剂盒测定裂解液中蛋白质的浓度，调蛋白浓度至1 μ g/μ 1，以Eppendorf管分装，每管35 μ 1保存于-80°C。样品经12%分离胶行SDS-PAGE电泳，每泳道上样30 μ 1。在4°C的循环水浴内以300mA电流将样品转至硝酸纤维素滤膜上，时间2h。用含5%脱脂奶粉的TBS-T缓冲液室温封闭lh。TBS-T洗膜3次，每次15min。加入1:2000稀释的一抗(CREG一抗及GFP —抗)，4°C孵育过夜。TBS-T洗膜3次，每次15min。加入4 μ L HRP标记的二抗(1:2500稀释)室温孵育2h。TBS-T洗膜3次，每次15min。ECL化学发光显色，Kodak黑白胶片成像。
[0049]实验结果显示，尾静脉注射AdCREG后，在2周和3周时间点，主动脉有大量的GFP表达，4周仍有表达，以后外源性GFP表达逐渐消失；而CREG在感染1周即有大量表达，超过正常血管的表达，2周时达高峰，感染3周时仍比正常血管表达高，到感染4周时，表达逐渐减弱至消失。这些结果表明，腺病毒介导CREG感染可以有效地将CREG基因导入动脉粥样硬化斑块组织，恢复CREG表达水平达到甚至超过正常水平(图3B)。
[0050]实施例4.AdCREG治疗动脉粥样硬化效果评价
[0051]采用HE染色、油红染色、ELISA及Western Blot检测炎症指标评价高脂喂养8周，AdCREG治疗后4周的效果。
[0052]对3组小鼠主动脉行常规石蜡切片及HE染色。按照组织学划分，以内外弹力膜为界限，内弹力膜以内为血管内膜，内、外弹力膜之间为血管中膜，外弹力膜以外为血管外膜。在4倍物镜下将完整的血管横切面HE染色图像摄入计算机图像分析系统中，利用Imagepro plus5.0计算机图像分析系统首先进行图像编辑，用鼠标准确勾出外弹力膜、内弹力膜以及管腔的轮廓，逐步测算血管腔面积、内膜及中膜面积，并计算内膜/中膜面积比(I/Μ)。每只动物随机选取5张切面进行图像分析，取平均值。
[0053]实验结果显示，AdCREG治疗组动脉粥样硬化斑块面积明显小于生理盐水对照组和AdGFP对照组。生理盐水对照组和AdGFP组血管中可见脂质核心、胆固醇结晶，而Ad_GFP组缺少胆固醇结晶。经统计分析，AdCREG组动脉粥样硬化斑块面积占中膜面积的比率明显小于生理盐水对照组和AdGFP组(图4A)。
[0054]对3组小鼠主动脉行油红染色观察动脉粥样硬化斑块形成情况。将血管固定于3%多聚甲醛溶液中，30min。PBS洗涤后，浸入PBS过夜。剔除血管外组织，纵切，暴露血管内膜。用60%油红染液(原液60ml加40ml蒸馏水)染色10_15min。用60%异丙醇洗去多余染液。蒸馏水清洗。将动脉放于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下观察并拍照。被油红染成红色的部位为动脉粥样硬化部位。通过Image pro plus软件分析图像，计算红色动脉粥样硬化面积占整个血管面积的比值。
[0055]实验结果显示，红色着色部分为脂质斑块。AdCREG组血管动脉粥样硬化斑块面积明显少于生理盐水对照组和AdGFP组。斑块面积占整个血管的比率明显少于其他两组(图4B)。
[0056]对3组小鼠主动脉行ELISA检测血管组织中TNF_ α含量。采用小鼠TNF_ α检测试剂盒(RD公司)，按试剂盒说明书操作。具体如下:将标准品倍比稀释后，每孔加入50μ 1。稀释标准品的浓度分别为900 μ g/L、600 μ g/L、300 μ g/L、150 μ g/L和75 μ g/L。分别设空白孔和待测样品孔。空白对照孔不加样品及酶标试剂。其余加入不同组别的VSMCs的上清液，阴性对照，100 μ 1/孔。用封板膜封板后置37°C温育30min。小心揭掉封板膜,弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静止30min弃去，反复5次，拍干。每孔加入酶标抗体50 μ 1，空白孔除外。温育同上。同上洗涤5次后，每孔先加入显色液Α50μ1，再加入显色液Β50μ1，轻轻震动，37°C避光显色15min。每孔加终止液50 μ 1，终止反应。酶标仪测450nm处0D值，以0D值为横坐标，标准品浓度为纵坐标绘制标准曲线。以样本0D值计算样本TNF-α浓度。
[0057]实验结果显示，AdCREG组血管中TNF- α表达量明显低于其他两组(图4C)，提示AdCREG治疗能够减轻动脉粥样硬化中的炎症反应。
[0058]对3组小鼠主动脉行Western Blot检测炎性转录因子NF_ κ B和I κ Β α。WesternBlot检测方法同实施例3所述。实验结果显示，对照组和AdGFP感染对照组动脉血管中NF- κ B均呈高表达，表明在动脉粥样硬化进程中NF- κ B呈活化状态，提示血管壁细胞炎症反应处于活跃状态。而AdCREG组NF- κ B表达显著下降(图4D)，说明CREG过表达抑制了动脉粥样硬化血管中部分炎症反应。I κ B的表达趋势与NF- κ B —致(图4E)。
[0059]尽管本发明的【具体实施方式】已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
【主权项】
1.CREG蛋白在制备用于预防和/或治疗动脉粥样硬化或动脉粥样硬化相关疾病(例如冠心病、脑卒中、腹主动脉瘤、外周动脉疾病等)的药物或医用器械中的用途。2.表达CREG蛋白的重组载体或含有该重组载体的重组细胞在制备用于预防和/或治疗动脉粥样硬化或动脉粥样硬化相关疾病(例如冠心病、脑卒中、腹主动脉瘤、外周动脉疾病等)的药物或医用器械中的用途；其中所述重组载体含有编码CREG蛋白的核苷酸序列。3.权利要求2的用途，其中所述的重组载体为重组腺病毒载体。4.权利要求3的用途，其中所述的重组腺病毒载体为人腺病毒5型Ad5- CREG，其于2008年I月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉，武汉大学)，保藏号为CCTCC - V200801。5.能够抑制血管内CREG蛋白表达下调或者能够上调血管内CREG蛋白表达水平的制剂在制备用于预防和/或治疗动脉粥样硬化或动脉粥样硬化相关疾病(例如冠心病、脑卒中、腹主动脉瘤、外周动脉疾病等)的药物或医用器械中的用途。6.组合物，其包含CREG蛋白、表达CREG蛋白的重组载体、含有该重组载体的重组细胞、能够抑制血管内CREG蛋白表达下调或者能够上调血管内CREG蛋白表达水平的制剂，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂，所述组合物用于预防和/或治疗动脉粥样硬化或动脉粥样硬化相关疾病(例如冠心病、脑卒中、腹主动脉瘤、外周动脉疾病等)；其中所述重组载体含有编码CREG蛋白的核苷酸序列。7.医用器械，其包含CREG蛋白、表达CREG蛋白的重组载体、含有该重组载体的重组细胞、能够抑制血管内CREG蛋白表达下调或者能够上调血管内CREG蛋白表达水平的制剂，所述医用器械用于预防和/或治疗动脉粥样硬化或动脉粥样硬化相关疾病(例如冠心病、脑卒中、腹主动脉瘤、外周动脉疾病等);其中所述重组载体含有编码CREG蛋白的核苷酸序列。8.权利要求6的组合物或权利要求7的医用器械在制备用于预防和/或治疗动脉粥样硬化或动脉粥样硬化相关疾病(例如冠心病、脑卒中、腹主动脉瘤、外周动脉疾病等)的产品中的用途。
【专利摘要】本发明涉及CREG蛋白的医药用途，具体涉及CREG蛋白在制备用于预防和/或治疗动脉粥样硬化或动脉粥样硬化相关疾病(例如冠心病、脑卒中、腹主动脉瘤、外周动脉疾病)的药物或医用器械中的用途。本发明还涉及表达CREG蛋白的重组载体、含有该重组载体的重组细胞、能够抑制血管内CREG蛋白表达下调或者能够上调血管内CREG蛋白表达水平的制剂在制备用于预防和/或治疗动脉粥样硬化或动脉粥样硬化相关疾病(例如冠心病、脑卒中)的药物或医用器械中的用途。
【IPC分类】A61P9/10, A61L31/16, A61K48/00, A61K38/17
【公开号】CN105327335
【申请号】CN201410345638
【发明人】韩雅玲, 闫承慧, 田孝祥, 孙鸣宇, 杨桂棠, 陶杰, 康建
【申请人】中国人民解放军沈阳军区总医院
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2014年7月21日