一种疫苗佐剂以及包含该佐剂的疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种疫苗佐剂以及包含该佐剂的疫苗。
【背景技术】
[0002] 流感病毒引起的急性呼吸系统疾病传播迅速，具有高发病率和死亡率的特点。根 据核蛋白（NP)和基质蛋白（Ml)的不同可分为甲型、乙型和丙型。上个世纪曾经爆发过多 次全球性流感大流行，最为严重的一次是发生于1918~1919年的西班牙流感，该流感的流 行毒株为最常见的甲型H1N1，至少2千万人死亡。目前，预防流感病毒最有效、最经济的手 段是接种流感疫苗。然而，疫苗的有效性受多种因素影响并且每年不同。流感疫苗主要基 于表面糖蛋白抗原血凝素（HA)的保守区域。HA的抗原漂移具有高塑性，因此需要开发新的 抗原，利用佐剂增强疫苗自身的免疫原性。普通流感疫苗虽然能够激发有效的针对病毒的 抗体，但是对于免疫系统不完善的幼儿、免疫力低下的人，及老年人，长期反复的感染常常 导致严重的、不可逆转的呼吸器官损伤，诱发呼吸系统功能衰竭，后果严重。因此，开发一种 免疫佐剂具有重要的意义。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术中疫苗佐剂的种类不足，提供 一种疫苗佐剂。
[0004] 本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
[0005] 本发明提供一种疫苗佐剂，所述的疫苗佐剂为小分子化合物（命名为SZU-101)， 具有式（I )所示的结构；
[0007] 一种疫苗佐剂，它包含式（I )所示的化合物。
[0008] 优选地，所述的疫苗佐剂为流感疫苗佐剂。
[0009] 更优选地，所述的疫苗佐剂为HlNl流感疫苗佐剂。
[0010] 优选地，所述的疫苗佐剂的剂型为生理上可接受的液体制剂、乳液制剂或冻干制 剂。
[0011] 具有式（I )所示的结构的化合物（命名为SZU-101)作为疫苗佐剂的应用。
[0012] 优选地，所述的疫苗佐剂为流感疫苗佐剂。
[0013] 更优选地，所述的疫苗佐剂为HlNl流感疫苗佐剂。
[0014] 本发明还提供一种疫苗，它包含具有式（I )所示结构的疫苗佐剂。
[0015] 优选地，所述的疫苗，由具有式（I )所示结构的疫苗佐剂和抗原偶联而成。
[0016] 更优选地，所述的疫苗，由具有式（I )所示结构的疫苗佐剂和流感疫苗偶联而 成。
[0017] 最优选地，所述的疫苗，由具有式（I )所示结构的疫苗佐剂和HlNl流感疫苗偶 联而成。
[0018] 以上所述的偶联是采用本领域常规手段而实现。
[0019] 具有式（I )所示的结构的化合物在制备流感疫苗中的应用。
[0020] 有益效果：本发明提供了一种新型的疫苗佐剂，该疫苗佐剂能有效地增强流感病 毒灭活疫苗的免疫效果，并且对小鼠的无毒性；因此，SZU-101可以作为流感病毒灭活疫苗 的一种有效的佐剂。实施例结果显示SZU-101偶联流感疫苗（F1U-T7)能显著增强血清抗 体效价，且高于单独疫苗组，并且促进小鼠特异性Thl型免疫反应，各组小鼠脾脏指数差异 无统计学意义（P>〇. 05)，说明SZU-101作为疫苗佐剂具有良好的安全性及有效性。
【附图说明】
[0021] 图1为Flu-T7激活T细胞诱导细胞因子实验结果图。其中图IA为SZU-101 (T7)的 结构式；图IB为Flu-T7对比于单独Flu组，产生的IL-12细胞因子水平图；图IC为Flu-T7 对比于单独Flu组，产生的IFN-γ细胞因子水平图；图ID为Flu-T7对比于单独Flu组，产 生的TNF-α细胞因子水平图；图IE为Flu-T7对比于单独Flu组，产生的IL-6细胞因子水 平图。
[0022] 图2为免疫小鼠的血清抗体反应实验结果图。图2Α为分别于第7天、21天、35天 尾静脉采血结果图；图2Β为从第二次免疫开始，Flu-T7的抗体效价图；图2C为IgGl亚类 的含量图；图2D为IgG2a亚类的含量图；图2Ε为Ig2a/IgGl的比例图。
[0023] 图3为安全性实验结果图。
【具体实施方式】
[0024] 以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限 定。
[0025] 本实施例中的小鼠为SPF级BALB/c小鼠，雌性，4-6周，购于广东省医学动物实验 中心。
[0026] HlNl流感病毒灭活疫苗（Flu)由北京科兴生物制品有限公司惠赠。
[0027] 具有式（I )所示的结构小分子化合物SZU-101 (简称T7)由本实验室自行合成 纯化；已发表文章，参见：Zhu J，He S，Du J，Wang Z，Li W，Chen X，Jiang W，Zheng D，Jin G.Local administration of a novel Toll-like receptor 7 agonist in combination with doxorubicin induces durable tumouricidal effects in a murine model of T cell lymphoma. J Hematol Oncol. 2015 Mar 4；8(1):21.
[0028] SZU-101偶联流感疫苗（Flu-T7)由本实验室偶联合成；方法参见：Gao D，Liu Y，Li Wj Zhong F，Zhang Xj Diao Y，Gao N，Wang X，Jiang Wj Jin G. Synthesis and immunoregulatory activities of conjugates of a Toll-like receptor 7 inert ligand. Bioorg Med Chem Lett. 2014,24(24):5792-5.
[0029] 实施例1 Flu-T7激活T细胞诱导细胞因子
[0030] 为了评价本发明具有式（I )所示的结构小分子化合物SZU-IOl (简称T7)作为 流感疫苗佐剂的活性。本实施例利用小鼠淋巴细胞分离液，提取小鼠脾脏中的淋巴细胞， 1*105个淋巴细胞/孔种在24孔板中，淋巴细胞分别孵育1 μ g/ml，5 μ g/ml，10 μ g/ml的 Flu或者Flu-T7,细胞培养箱培养24小时。收集上清，利用ELISA试剂盒检测IFN- γ、IL-2、 IL-12、TNF_a细胞因子水平。
[0031] 结果如图1显示，Flu-T7对比于单独Flu组，产生更多的IL-12(图lB)、IFN-y (图 1C)、TNF-a (图ID)、IL-6(图1E)的表达（Ρ〈0· 05)。这些结果表明，SZU-101偶联流感疫 苗（Flu-T7)促进了 Thl型和Th2型免疫应答，诱导了细胞免疫和体液免疫的发生。也说明 SZU-101可以作为流感病毒灭活疫苗的一种有效的佐剂。
[0032] 实施例2免疫小鼠的血清抗体反应
[0033] 为了评价本发明具有式（I )所示的结构小分子化合物SZU-101 (简称T7)作为 流感疫苗佐剂的效果。本实施例采用如下试验：
[0034] 雌性4-6周龄的Balb/c小鼠随机分为4组，每组8只：①生理盐水；②T7组（lmg/ ml);③Flu (3 μ g);④Flu-T7 (3 μ g)。分别于第0天，第14天，第28天免疫3次，每次经腹 腔注射，0.1 ml/只。量效实验分别在第7天，21天，35天采集小鼠尾巴静脉血（如图2A所 示），分离血清，检测抗体效价。
[0035] 用ELISA法检测特异性IgG抗体。首先向96孔酶标板各孔中加入100 μ 1包被液 (含1 μ g/ml的Flu)，4 °C过夜。取出酶标版，弃孔中包被液后，向孔中加入300 μ I PBST洗 涤3次。血清样品I :500稀释，室温孵育2小时。碱性磷酸酶标记的IgG，IgGl，IgG2a抗 体，100 μ 1/孔，室温孵育1小时。加入p-NPP底物溶液显色，100 μ 1/孔，每孔加50 μ I 3M NaOH终止反应，酶标仪测定OD4id5值。
[0036] 结果，图2B显示，从第二次免疫开始，Flu-T7的抗体效价高于对比于Flu对照 组。IgG根据结果和功能的不同包含不同的亚类，IgGl和IgG2a为最主要的IgG亚类。 IgG2a/IgGl的比例结果显示，Flu-T7主要偏属于Thl型，产生IgG2a型抗体。上述结果表 明SZU-101可以作为流感病毒灭活疫苗的一种有效的佐剂。
[0037] 实施例3 T7作为流感疫苗佐剂的安全性实验
[0038] 免疫后第35天，对各组小鼠的脾脏和体重进行称量，计算各组小鼠脾重与体重的 比值，结果比值无统计学意义（P>〇. 05)，见图3。结果表明以T7为佐剂的疫苗对小鼠机体 刺激性较少，对其生长并无显著影响。
【主权项】
1. 一种疫苗佐剂，其特征在于，所述的疫苗佐剂为小分子化合物，具有式（I )所示的 结构；2. -种疫苗佐剂，其特征在于，所述的疫苗佐剂包含权利要求1中式（I )所示的化合 物。3. 根据权利要求1或2所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述的疫苗佐剂为流感疫苗佐 剂；优选地，所述的疫苗佐剂为H1N1流感疫苗佐剂。4. 根据权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述的疫苗佐剂的剂型为生理上可 接受的液体制剂、乳液制剂或冻干制剂。5. 具有式（I )所示的结构的化合物作为疫苗佐剂的应用。6. -种疫苗，其特征在于，包含权利要求1所述的具有式（I )所示结构的疫苗佐剂。7. 根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，由权利要求1所述的具有式（I )所示结 构的疫苗佐剂和抗原偶联而成。8. 根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，由权利要求1所述的具有式（I )所示结 构的疫苗佐剂和流感疫苗偶联而成。9. 优选地，根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，由权利要求1所述的具有式（I ) 所示结构的疫苗佐剂和H1N1流感疫苗偶联而成。10. 根据权利要求7所述的疫苗，具有式（I )所示的结构的化合物在制备流感疫苗中 的应用。
【专利摘要】本发明涉及药物化学技术领域，具体公开了一种疫苗佐剂以及包含该佐剂的疫苗。所述的疫苗佐剂为小分子化合物，具有式(Ⅰ)所示的结构。该疫苗佐剂能有效地增强流感病毒灭活疫苗的免疫效果，并且对小鼠的无毒性；可以作为流感病毒灭活疫苗的一种有效的佐剂。
【IPC分类】A61K39/145, A61K39/39, A61P31/16
【公开号】CN105327345
【申请号】CN201510799624
【发明人】靳广毅, 陈婷婷, 王竹林
【申请人】深圳大学
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月19日