er,NY；ffeinerand Kotkoskie(2000)ExcipientToxicityandSafety,MarcelDekker,Inc. ,NewYork,N.Y〇
[0241] 治疗性组合物在生产和存储条件下通常应当为无菌且稳定的。可以将组合物配制 为溶液、微乳剂、脂质体或其他有序结构。载体可以为溶剂或分散介质，其含有例如，水、乙 醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和聚乙二醇液体等），以及它们的合适混合物。例如，通过使 用包衣层如卵磷脂、通过维持分散情形下所需粒径，以及通过使用表面活性剂，可以维持合 适的流动性。在一些情形下，所述组合物中包含有等渗剂，例如，糖类、多元醇如甘露醇、山 梨醇或氯化钠。可以通过将延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶包含在组合物中，达到 可注射组合物的延长吸收。此外，可以在时间释放制剂中给予可溶性因子，例如在包含有缓 释性聚合物的组合物中。可以将活性化合物与防止化合物快速释放的载体一起制备，如控 释制剂，包括埋植剂和微胶囊化的递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物， 如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物 (PLG)。用于制备此类制剂的许多方法已获得专利，或为本领域技术人员熟知。
[0242] 上清液或可溶性因子可以与合适的基质相组合给药，例如，以提供可溶性因子的 缓慢释放。
[0243] 组合物的其他组分
[0244] 源自STRO-Γ细胞的上清液或可溶性因子、STR0-1 +细胞或其后代可以与其他有 利的药物或生物分子（生长因子、营养因子）一起给药。当与其他试剂一起给药时，它们 可以按单一药物组合物或分别的药物组合物，与其他药剂同时或依次（在给予其他试剂之 前或之后）一起给药。可以共给药的生物活性因子包括抗凋亡剂（例如，ΕΡ0、ΕΡ0模拟体 (mimetibody)、TPO、IGF-I和IGF-II、HGF、半胱天冬酶抑制剂）；抗炎剂（例如，p38MAPK 抑制剂、TGF-β抑制剂、他汀类、IL-6 和IL-1 抑制剂、PEMIROLAST、TRANILAST、REMICADE、 SIR0UMUS和NSAIDs(非甾族抗炎药；例如，TEPOXALIN、TOLMETIN、SUPR0FEN);免疫抑制 剂/免疫调节剂（例如，钙调神经磷酸酶抑制剂如环孢霉素、他克莫司；mTOR抑制剂（例 如，SIROUMUS、EVER0UMUS);抗-增殖剂（例如，咪唑硫嘌呤（azathioprine)、霉酚酸酯 (mycophenolatemofetil));皮质类固醇（例如，氢化泼尼松（prednisolone)、氢化可的松 (hydrocortisone));抗体如单克隆抗-IL_2Ra受体抗体（例如，巴利昔单抗、达利珠单抗 (dac1izumab))、多克隆抗-T-细胞抗体（例如，抗-胸腺细胞球蛋白（ATG);抗-淋巴细胞 球蛋白（ALG);单克隆抗-T细胞抗体0KT3));抗-血栓形成剂（例如，肝素、肝素衍生物、 尿激酶、PPack(右旋苯丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮）、抗凝血酶化合物、血小板受体拮抗 剂、抗-凝血酶抗体、抗-血小板受体抗体、阿司匹林、双嘧达莫、鱼精蛋白、水蛭素、前列腺 素抑制剂和血小板抑制剂）；以及抗-氧化剂（例如，普罗布考、维生素A、抗坏血酸、生育 酚、辅酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸）以及局部麻醉剂。
[0245] 在一个实例中，本文根据任一实例所述的组合物包含抗炎剂、免疫调节剂、免疫抑 制剂、止痛药或抗生素。在一个实例中，第二治疗剂是免疫调节剂。在另一实例中，第二治 疗剂是抗-⑶3抗体（如，0KT3,鼠源单克隆抗体（muronomab))，抗-IL-2受体抗体（如，巴 利普单抗和达利珠单抗），抗T细胞受体抗体（如鼠源CD3单克隆抗体），硫唑嘌呤，神经钙 调蛋白抑制剂，皮质类固醇，环孢霉素，甲氨蝶呤，巯嘌呤，霉酚酸酯，他克莫西或雷帕霉素。
[0246] 可选择地或另外地，本文根据任一实例所述的细胞、分泌的因子和/或组合物与 呼吸病症的已知治疗如类固醇或LABA相组合。
[0247] 在一实例中，本文根据任一实例所述的药物组合物包含用于治疗呼吸病症的化合 物。可选地，本文根据任一实例所述的治疗/预防方法还包括给予用于治疗呼吸病症的化 合物。示例性化合物在本文中有描述，并且应当理解为加以必要的修改适用于本公开的这 些实例。
[0248] 在另一实例中，本文根据任一实例所述的组合物还包含诱导或促进祖细胞分化 为血管细胞的因子。示例性因子包括血管内皮生长因子（VEGF)、源自血小板的生长因子 (PDGF;例如，PDGF-BB)和FGF。
[0249] 在另一实例中，本文根据任一实例所述的组合物还包含组织特异性定型细胞 (TSCC)。在这方面，国际专利申请第PCT/AU2005/001445号表明，给予TSCC和STRO-Γ细 胞可导致TSCC增殖的增加。在一个实例中，TSCC为血管细胞。将此类组合物给予个体可 以使血管生成增加，例如，引起被递送至受影响组织的营养物增加。
[0250] 医疗设备
[0251] 本公开还提供了用于或当被使用于本文根据任一实例所述的方法的医疗设备。例 如，本公开提供了注射器或导管或吸入器或其他合适的递送装置，其包含STRO-Γ细胞和/ 或其后代细胞和/或源自它们的可溶性因子和/或本文根据任一实例所述的组合物。任选 地，所述注射器或导管或吸入器包装有用于本文根据任一实例所述方法的使用说明书。
[0252] 在另一个实例中，本公开提供了植入物，其包含STRO-Γ细胞和/或其后代细胞和 /或源自它们的可溶性因子和/或本文根据任一实例所述的组合物。任选地，所述植入物包 装有用于本文根据任一实例所述方法的使用说明书。合适的植入物可以由例如，如上文所 述的支架以及STRO-Γ细胞和/或其后代细胞和/或源自它们的可溶性因子组成。
[0253] 给药方式
[0254] 可将源自STRO-Γ细胞的上清液或可溶性因子、STR0-1 +细胞或其后代手术植入、 注射、吸入、递送（如通过导管或注射器），或以其他方式直接或间接地给予至需要修复或 增加的部位，如肺中。
[0255] 在一实例中，可将源自STRO-Γ细胞的上清液或可溶性因子、STRO-Γ细胞或其后 代递送至个体的血流。例如，源自STRO-Γ细胞的上清液或可溶性因子、STR0_1+细胞或其 后代经肠胃外递送。示例性肠胃外给药途径包括但不限于腹膜内、心室内、脑室内、囊内或 静脉内。在一实例中，所述源自STRO-Γ细胞的上清液或可溶性因子、STRO-Γ细胞或其后 代经动脉内递送至主动脉、心脏心房或心室中，或例如经静脉内至血管中。在这方面，已显 示STRO-Γ细胞迀移至受伤部位和/或肺。
[0256] 在递送细胞至心脏的心房或心室情形下，可将细胞给予至左心房或左心室，以避 免可能由快速递送细胞至肺引起的并发症。
[0257] 在一个实例中，源自STRO-Γ细胞的上清液或可溶性因子、STR0-1 +细胞或其后代 经静脉内递送。
[0258] 在一个实例中，源自STRO-Γ细胞的上清液或可溶性因子、STR0-1 +细胞或其后代 被注射入递送部位，例如，利用注射器或通过导管或中心线。
[0259] 在一实例中，源自STRO-Γ细胞的上清液或可溶性因子、STR0-1 +细胞或其后代经 鼻内或通过吸入递送。
[0260] 治疗制剂给药方案的选择取决于几种因素，包括实体的血清或组织更新率、症状 水平和实体的免疫原性。在一实例中，给药方案将递送至个体的细胞和/或因子的量最大 化，并符合可接受的副作用水平。因此，所递送细胞和/或因子的量部分取决于特定实体和 所治疗病症的严重度。
[0261] 在一实例中，源自STRO-Γ细胞的上清液或可溶性因子、STR0-1 +细胞或其后代作 为单次快速灌注剂量递送。可选择地，源自STRO-Γ细胞的上清液或可溶性因子、STR0-1 + 细胞或其后代通过连续输注给予，或通过以例如每隔一天、一周或每周1-7次的剂量给予。 示例性剂量方案涉及避免明显的不良副作用的最大剂量或剂量频率。总的每周剂量取决于 所用化合物/细胞的类型和活性。合适剂量的确定由临床医生进行，例如，利用本领域已知 的或者怀疑影响治疗或预期影响治疗的参数或因素。通常，剂量以稍微低于最佳剂量的量 开始，并在其后以小的增量增加，直到相对于任何不利副作用达到所需的或最佳的效应。
[0262] 本发明的发明人已显示，由STRO-Γ细胞和/或其后代和/或源自它们的可溶性因 子提供的疗效在个体内观察至少可到4周。因此，在一些实例中，将所述细胞每周、每两周、 每三周一次或每四周一次给药。
[0263] 根据本公开的涉及治疗或延缓呼吸病症进程的实例，在病症诊断后，给予STRO-Γ 细胞和/或其后代细胞和/或源自它们的可溶性因子，例如，利用本领域已知的和/或本文 描述的标准方法。
[0264] 对于涉及预防或延缓呼吸病症发作的那些实例，可在该病症的临床诊断前，给予 STRO-Γ细胞和/或其后代细胞和/或源自它们的可溶性因子。
[0265] 在一实例中，本公开的治疗方法包括评估受治疗的个体在给药之后（如7天至30 天之后）一种或多种肺功能参数的改善，其中所述肺功能参数为一秒钟用力呼气量（FEVD; 用力肺活量（FVC)iFEVi/FVC;呼气峰流量（PEF);用力呼气流量的25% -50%或25% 75% (呼气中段空气流出肺的平均流量）；用力呼气时间（FET);肺总容量（TLC);一氧化碳弥散 量（DLC0);最大随意通气量；在胸部X射线、CT扫描、MRI、支气管镜检查或类似扫描中的一 种或多种可检测的改善（如，肺外观的可见改善）；或者血液中可检测的二氧化碳水平的可 检测的改善（如，〇) 2水平变动至正常范围内）。在一实例中，给药导致一种或多种肺功能 参数⑴提高至预期的80%或以上；或者⑵提高了至少2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、 9 %、50 %。在一个实例中，所述方法包括在给药之前，鉴定小于相同身高和体重的个体预期 值80%的任何参数，以及在治疗之后评估所述参数，其中治疗导致所述肺功能参数的一种 或多种（1)提高至预期的80%或以上；或者（2)提高了至少2%、3%、4%、5%、6%、7%、 8%、9%、50%〇
[0266] 本公开包括以下非限制性实施例。 实施例
[0267] 实施例1 :通讨诜择STRCH^细朐对MPC讲行免痔诜择
[0268] 骨髓（BM)获自健康正常成人志愿者（20-35岁）。简单地说，从臀部髂后嵴吸取 40mlBM至含肝素锂抗凝剂的管中。
[0269] 如先前所述（Zannettino，A.C.etal. (1998)Blood92:2613-2628)，利用 Lymphoprep?(NycomedPharma,Oslo,Norway)通过密度梯度分离来制备BMMNC。4°C下以 400Xg离心30分钟后，用移液管去除棕黄层（buffylayer)，并在"HHF"中洗涤3次，所述 "HHF"由Hank's平衡盐溶液（HBSS;LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)组成，含有 5% 的胎牛血清（FCS，CSLLimited,Victoria,Australia)。
[0270] 随后按照先前所述（Gronthosetal. (2003)JournalofCellScience 116:1827-1835 ;Gronthos，S.andSimmons，P.J. (1995)Blood85:929-940)，通过磁力活化 的细胞分选分离STR0-3+ (或TNAP+)细胞。简单地说，将约1-3X10s个BMMNC在封闭缓冲 液中于冰上孵育20分钟，所述缓冲液由HHF中的10% (v/v)正常兔血清组成。将细胞与 200μ1的10μg/mlSTR0-3mAb溶液一起在封闭缓冲液中于冰上孵育1小时。随后通过 400Xg离心，将细胞在HHF中洗涤两次。加入HHF缓冲液中以1/50稀释的山羊抗-小鼠 y-生物素（SouthernBiotechnologyAssociates,Birmingham,UK)，并将细胞在冰上孵育 1小时。按如上所述将细胞在MACS缓冲液（无Ca2+和Mn2+的PBS，补充有l%BSA、5mMEDTA 和0. 01 %叠氮化钠）中洗涤两次，并重悬在0. 9ml终体积的MACS缓冲液中。
[0271] 将 100μ1 链霉亲和素微珠（MiltenyiBiotec;BergischGladbach,Germany)加 入细胞悬液中，并在冰上孵育15分钟。将细胞悬液洗涤两次，并重悬在0. 5mlMACS缓冲液 中，然后上样至小型MACS柱（MSColumns，MiltenyiBiotec)，并用0.5mlMACS缓冲液洗涤 3次，以回收未结合STR0-3mAb的细胞（于2005年12月19日保藏在美国典型培养物保藏 中心（ATCC)，登录号为PTA-7282-参见国际公开第W0 2006/108229号）。加入另外的lml MACS缓冲液后，从磁体移走柱子，并通过正压分离TNAP+细胞。来自每个级分的细胞等分试 样可用链霉亲和素-FITC进行染色，并通过流式细胞术评估纯度。
[0272] 实施例2 :通讨STR0_3mAb诜择的细朐为STRO-1^细朐
[0273] 设计了实验以验证利用STR0_3mAb作为单一试剂分离细胞STR0-116细胞的可能 性。
[0274] 考虑到STR0_3(IgGl)与STRO-l(IgM)是不同的同种型，基于其与利用MACS程序 分离的STRO-Γ细胞共表达，通过双色FACS分析评估了STR0-3鉴定克隆性CFU-F的能力 (图1)。点状直方图代表了以列表型数据收集的5X104个事件。垂直线和水平线设定为 小于利用在相同条件下处理的同种型匹配的对照抗彳本lB5(IgG)和1A6. 12(IgM)获得的平 均荧光的1.0%的反应性水平。结果证明，STR0-1*^H胞的较小群体共表达TNAP(右上象 限），而其余STRO-Γ细胞与STR0-3mAb不反应。随后分析来自所有4个象限通过FACS分 离的细胞的CFU-F发生率（表1)。
[0275] 表1 :基于细胞表面标志物STR0-1和TNAP的共表达，通过双色FACS分析人骨髓 细胞的富集（参见图1)。将FACS分选的细胞于标准的克隆形成条件下于补充有20%FCS 的αMEM中培养。数据表示第14天时每接种105细胞的集落形成细胞（CFU-F)的平均数 土SE(n= 3个不同骨髓抽吸物）。这些数据表明，人MPC仅局限于鲜明地共表达STR0-1抗 原的BM的TNAP阳性部分。
[0276]
[0277] 实施例3 :在绵羊哮喘的绵羊樽铟中绵羊MPC的治疗应用
[0278] 3. 1 方法
[0279] 由于其使用与人临床相关的过敏原，过敏性哮喘的屋尘螨（HDM)绵羊模型被选择 用来研究MPCs对哮喘的影响。哮喘的其他模型存在不足。例如，小鼠0VA激发模型使用的 是与人临床不相关的过敏原，肺部炎症的模式和分布与在人体观测到的不一样，肺和实质 组织炎症/重塑都被观测，并且与人慢性哮喘相反，未观测到气道平滑肌大幅增加。类似 地，蛔虫（Ascaris)绵羊哮喘模型未利用临床相关抗原，且对与人通常不接触的过敏原（猪 蛔虫（ascarissuum))具有较强的中性粒细胞应答和相对弱的嗜酸性粒细胞应答。
[0280] 在绵羊中通过相距两周三次皮下注射屋尘螨抗原（50μg)和明矾的给药来启动 哮喘。然后选择通过ELISA检测显示高IgE应答的绵羊，给予抗原之后IgE水平增加1. 5 倍被认为是"高IgE应答"。
[0281] 第7、28和49天，利用与机械呼吸机相连接的喷雾器，绵羊接受含屋尘螨抗原的气 溶胶（5mL包含200μg/mL抗原）激发。机械呼吸机辅助绵羊以每分钟呼吸20次呼吸10 分钟，使得每只绵羊每次激发接受200次呼吸剂量的雾化抗原。之前已表明这种激发足以 在绵羊中诱发哮喘和炎症反应。
[0282] 第7、28和49天，通过计算对浓度渐增的支气管收缩剂卡巴胆碱（carbachol)的 剂量-反应来定量支气管高反应性。该检测的预期剂量范围是lmg/ml雾化卡巴胆碱5至 300次呼吸以产生100%增加的阻力。
[0283] 还测定了早期哮喘反应，与基线（抗原给予前）值相比，预期的反应范围为给予抗 原之后阻力变化50%至900%。
[0284] 然后将绵羊随机分成如表2所示的四组，这样所有组都包含具有生理反应范围相 似的绵羊。将pr〇FreeZe?/DMSO/aMEM中的绵羊MPCs(第5代）稀释于生理盐水中，然后 于第63天（给予第三次雾化抗原激发之后两周）给予相关组。处理方案的总结示于图3 中。
[0285] 表2 :处理组
[0286]
[0287] 绵羊MPC通过静脉输注（100mL/30分钟）至颈静脉给药。然后用屋尘螨过敏原于 第一周和第四周（分别为第70天和第91天）再次激发绵羊。
[0288] 如Koumoundouros等（Exp.LungRes.，32:321-330, 2006)所述，通过评估食管和 气管压力以及肺气流以计算气道阻力来进行基线肺功能的测量（早期哮喘反应[EAR])。在 本方案中，将气囊导管经鼻插入至食管下端来测量食管压力（即外部压力）。为测量内部气 道压力，将气管导管置于经鼻插入的气管内管中。通过附着于气管内管近端的呼吸速度描 计器（pneumotachograph)(HansRudolph,KansasCity,USA)来测量气流。将食管和气管 导管以及呼吸速度描计器连接至差动传感器，这样可测量跨肺压和气流。在定制的Labview PtyLtd软件程序中分析来自这些记录的数字资料，以呼吸-呼吸为基础记录气道阻力。通 过分析用HDM气溶胶激发之后特定时间的气道阻力变化来测定绵羊中过敏原诱导的支气 管收缩。该激发之后立即记录阻力值1小时来评估早期哮喘反应（EAR)，然后在激发之后记 录6小时来评估6小时哮喘反应。EAR的结果表示为从雾化生理盐水激发之后的基线阻力 值至HDM激发之后第1个小时的最大阻力值的气道阻力百分比变化。LAR数据表示为从基 线阻力值至HDM激发之后六小时测量的平均阻力值的气道阻力百分比变化。
[0289] 支气管高反应性（BHR)，又被称为气道高反应性（AHR)，是测量应答非特异性兴奋 剂的气道闭合的反应性。众所周知，哮喘气道为痉挛的，并且对相对低剂量的支气管收缩剂 如胆碱能激动剂卡巴胆碱和乙酰甲胆碱作出反应。在绵羊中，在HDM激发期开始之前和HDM 激发几周之后评估BHR。这通过以下来实现：给予加倍气溶胶剂量范围（0. 25% -4%w/v卡 巴胆碱）的支气管收缩剂卡巴胆碱，以及每次给予卡巴胆碱之后立即测量气道阻力变化。 结果表示为由基线增加气道阻力100%所需的卡巴胆碱气溶胶浓度或者卡巴胆碱已达到的 最大剂量。所给予卡巴胆碱剂量的浓度以呼吸单位（BUs)来测定；一个BU为l%w/v卡巴 胆碱一次呼吸。肺部已对HDM敏感的绵羊通常用相对低剂量卡巴胆碱引起支气管收缩。
[0290] 第7天（研究进入基线）和BHR检测之后24小时（第2, 51，72, 93天）采集约 20-30mL血液，并进行以下测试：
[0291] ?血液学和凝结：红血细胞计数（RBC)，白血细胞计数（WBC)，血红蛋白（Hb)，血细 胞比容，血小板，嗜中性粒细胞，单核细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，纤维蛋白原。