r>[0292] ?生化：钠，钾，氯，碳酸氢盐，葡萄糖，肌酸酐，钙，镁，磷酸盐，总蛋白，白蛋白，总 胆红素，天冬氨酸转氨酶（AST)，丙氨酸转氨酶（ALT)，γ-谷氨酰转肽酶（GGT)。
[0293] ?细胞因子检测：细胞因子（TNF-α和IFN-γ)。
[0294] 通过标准酶联免疫吸附试验（ELISA)检测第49天，第63天和第91天采集的血清 样品中IgE的存在
[0295] 通过利用光学纤维支气管镜输注10mL生理盐水至左肺并回收BAL细胞和液体来 采集支气管-肺泡灌洗（BAL)细胞。用HaemKwik(HDScientificPtyLtd.)染色剂差异 染色BAL细胞，以确定不同白细胞存在的百分比。第7天（研究进入基线）和BHR检测之 后24小时（第2, 51，72,93天）进行BAL。·
[0296] 使用过量戊巴比妥钠（至少200mg/kg;即每40kg绵羊20mL400mg/mL溶液）使 动物无痛致死。
[0297] 对死亡或无痛致死的所有动物都进行尸体剖检和组织采集。
[0298] 组织样品在尸体剖检时（第93天）采集自左侧近后部的肺区域，并冷冻于浮于液 氮的铝盘上的模具中的0CT包埋介质中，用于免疫组织化学。每个绵羊的肺冷冻两份组织 块。使用抗绵羊细胞表面分子⑶4、⑶8、⑶45R、yδ和IgE的mAbs染色冷冻切片（5μm)。 嗜酸性粒细胞用内源性过氧化物酶进行组织染色后鉴定，并用苏木精和伊红-y复染。在每 只绵羊的实质、气道固有层（laminapropria)和外气道壁中检测并计数单独的细胞，并表 示为每平方毫米（_2)所检测的组织的细胞数目。对于高密度的细胞类型，以200倍放大 率在各自区域内计数至少一百个细胞来确定细胞密度。对于低密度细胞类型，由取自完整 切片全部相关区域内的非重叠视野来计算密度。所有细胞鉴定、计数和密度计算都由对处 理组不了解的观察者进行。
[0299] 3. 2 结果
[0300] 在处理前、单次静脉输沣oMPC或牛理盐水后1周和4周时HDM-致敏的哮喘绵羊 早期哮喘反应（EAR)
[0301] 在oMPC处理后4周的时间点过敏原激发后那小时期间，接受15000万oMPCs的绵 羊具有显著改善的肺功能（图4A，B和C)。oMPC处理后4周的时间点，肺功能的改善显示 为与oMPC处理前的EAR相比时，过敏原激发后EAR降低57. 1 % (p〈0. 05 (图4A和C)。
[0302] 在处理前、单次静脉输沣oMPC或牛理盐水后1周和4周时HDM-致敏的哮喘绵羊 的晚期讨敏反应（LAR)
[0303] 与处理前数值相比时，当在1周和4周的时间点进行评估时，过敏原激发后6小时 时，生理盐水对照组显示LAR增加的倾向（图5A)。与处理前数值相比，2500万oMPC处理 组与1周时的6小时LAR的显著下降有关（图5A)。与处理前数值相比，在处理后1周和4 周的时间点，7500万和15000万oMPC处理组全部都经历6小时LAR下降的倾向。显示处 理组之间6小时LAR的比较变化的总结图显示于图5B中。通过从处理前到后续处理的百 分比变化评估LAR的相对变化时，与1周的时间点时的对照相比，2500万oMPC剂量组中的 LAR的百分比变化显著改善（p〈0. 05,图5B)。oMPC处理后4周的时间点时的6小时LAR显 示相似的趋势（图5C)。
[0304] 在处理前、单次静脉输沣oMPC或牛理盐水后1周和4周时哮喘绵羊的支气管高反 应件（MIR)
[0305] 在1周和4周的时间点时，接受代替oMPCs的生理盐水介质处理的对照组未经历 显著的BHR变化（图6A，B，C和D)。与oMPC处理之前所测量的BHR相比，在oMPC处理后1 周和4周的时间点时，接受7500万oMPCs的绵羊组都具有显著改善的BHR指数（图6A)。 将所有处理组合并在一起的事后分析中，处理前与1周和4周的时间点之间的差异是统计 上显著的（图6D)。
[0306] |气管肺泡灌洗（BAL)液分析：在处理前、单次静脉输沣oMPC或牛理盐水后1周 和4周时哮喘绵羊的BAL液中的炎症细朐谱
[0307] oMPC或生理盐水对照处理后1周和4周时过敏原激发之后2天，进行支气管肺泡 灌洗（BAL)取样。在本试验使用的所有绵羊中，过敏原激发和干细胞治疗之前，所取样的总 BAL细胞中嗜酸性粒细胞的平均基线百分比为4. 5%。过敏原激发后2天且干细胞或生理 盐水处理之前，所取样的所有绵羊BAL中的嗜酸性粒细胞的平均百分比（即BAL嗜酸性粒 细胞的处理前平均百分比）为15. 0%。过敏原激发之后2天且oMPC处理后，由试验绵羊回 收的BAL液中的嗜酸性粒细胞分析显示，治疗前与用2500万oMPCs输注的绵羊1周的时间 点之间有显著差异（图7A和B)。对于7500万和15000万oMPC处理的组，处理前与1周 和4周的时间点之间的BAL液中嗜酸性粒细胞的差异未达到统计显著性。然而，在事后分 析中将全部三组处理值合并在一起时，处理前与处理后BAL嗜酸性粒细胞在1周和4周的 时间点的差异都是统计上显著的（图7E)。
[0308] 在本试验使用的所有绵羊中，过敏原激发之后2天且干细胞或生理盐水处理前取 样的总BAL细胞中的嗜中性粒细胞的平均百分比相对低，为0. 89%。与处理前数值相比，对 于2500万和15000万oMPC处理的绵羊，oMPC后1周的时间点时BAL液中的嗜中性粒细胞 的百分比显著更低（图8A)。对于7500万oMPC组，与处理前的值相比，oMPC后4周的时间 点时BAL液中的嗜中性粒细胞的百分比显著更低（图8A)。
[0309] 过敏原激发之后2天，从所有试验绵羊回收的BAL液中的淋巴细胞和巨噬细胞的 Cytospot分析显示，BAL液中的这些细胞类型中的任何一种在各组之间没有显著差异（图 9-10)〇
[0310] 在处理前、单次静脉输沣oMPC或牛理盐水后1周和4周时哮喘绵羊血清中的 HDM-特异件IgE
[0311] 由于过敏原诱发的哮喘与过敏原特异性IgE有关，在oMPC给予之前以及oMPC处 理后1周和4周的两个时间点时，评估所有绵羊血清中循环的HDM-特异性IgE水平（图11A)。结果显示，与处理前HDM-特异性IgE水平相比，oMPC处理后1周时，15000万oMPC 剂量对于显著降低HDM-特异性IgE是有效的（图11A)。与处理前HDM-特异性IgE水平相 比，oMPC处理后4周时，2500万和7500万oMPC处理显著减少HDM-特异性IgE水平。与处 理前数值相比，1周和4周的时间点时，生理盐水处理的对照组绵羊中的HDM-特异性IgE水 平轻微下降；然而，该差异并不显著（图11A)。对照绵羊与输注不同剂量oMPCs的绵羊之 间的比较示于图11B和C中，该比较评估了处理前和处理后1周和4周的血清中的IgE水 平的百分比变化。
[0312] 肺组织的免痔组织学分析：单次静脉输沣oMPC或牛理盐水之后4周时哮喘绵羊肺 部的炎症细朐谱
[0313] 对来自试验绵羊左侧肺后叶的尸体剖检取样的肺组织进行免疫组织化学分析。 将一组细胞表面抗体标志物用于组织切片来鉴定⑶4,⑶8和γδ-阳性T细胞亚群， CD45R-阳性细胞，和IgE-阳性细胞（鉴定肥大细胞）。嗜酸性粒细胞被鉴定为过氧化物 酶阳性染色的细胞。这些细胞类型的相对密度在三个单独的肺部位评估，包括：肺实质，包 括诸如肺泡腔和肺泡壁的非气道组织；气道壁固有层，其将细胞密度分析限制于腔上皮与 气道平滑肌束的内边界之间的气道壁区域；以及整个气道壁，其包括气道腔上皮与毗邻肺 泡的外部外膜之间的密度计数。
[0314] 对取样自哮喘绵羊的肺组织切片的过氧化物酶阳性嗜酸性粒细胞的分析表明，用 15000万oMPC处理的绵羊气道壁中的嗜酸性粒细胞密度显著低于生理盐水处理的对照绵 羊气道壁中的嗜酸性粒细胞密度（P〈〇. 05)。总之，这些数据表明，在尸检前4周给予15000 万oMPC剂量处理与暴露于过敏原的气道中过氧化物酶阳性嗜酸性粒细胞的较低密度有 关。
[0315] 组织病理学分析：单次静脉输沣oMPC或牛理盐水后4周以及用HDM再次激发后24 小时嗜酸件粒细朐在哮喘绵羊肺部中的浔润
[0316] 用Luna组织学法染色肺部组织，其中在染蓝色的背景组织中，通过将嗜酸性粒细 胞颗粒染成明显的红色来鉴定嗜酸性粒细胞。
[0317] 对在肺前部和后部中发现的细支气管腔碎片/嗜酸性粒细胞和具有嗜酸性粒细 胞的肺不张的分析没有在对照和处理动物之间揭示任何显著差异。对在肺前叶和肺后叶中 的发现进行分析显示，在组C的动物（即用15000万oMPC处理的绵羊）中Luna-阳性的嗜 酸性粒细胞呈现降低趋势。在左侧肺前叶中，显示Luna-阳性的嗜酸性粒细胞的绵羊出现 数目由对照组中的5只降低至15000万oMPC组中的3只。在右侧肺前叶中，显示Luna-阳 性的嗜酸性粒细胞的绵羊出现数目由对照组中的5只降低至15000万oMPC处理组中的4 只。在左侧肺后叶中，具有Luna-阳性的嗜酸性粒细胞的绵羊出现数目由对照组中的5只 降低至15000万oMPC处理组中的3只。在右侧肺后叶中，具有Luna-阳性的嗜酸性粒细胞 的绵羊出现数目由对照组中的4只降低至15000万oMPC处理组中的2只。2500万和7500 万oMPC剂量组与对照组之间显示Luna-阳性嗜酸性粒细胞的绵羊发生率没有差异。
[0318] 进行事后（Post-hoc)分析评估相比对照绵羊，15000万oMPC剂量对于减少阳性嗜 酸性粒细胞的存在是否整体上更为有效。该分析通过增加绵羊数目来进行，所述绵羊对所 检查的四个肺叶中的每一个都显示显著的Luna-阳性嗜酸性粒细胞染色。该分析表明，与 生理盐水处理的对照组相比，在15000万oMPC组中显示Luna-阳性嗜酸性粒细胞病理学的 绵羊数目较少。
[0319] 3. 3 讨论
[0320] 本研究评估了oMPC疗法在哮喘绵羊模型中的安全性和功效。相比免疫前水平，在 其血清中具有高水平HDM-特异性IgE抗体的绵羊在6-周的时间被给予三次整个肺部HDM 气溶胶激发，以使它们的气道对HDM敏感。将绵羊随机分配成四组并通过静脉输注给予生 理盐水（对照），或三种剂量的oMPC处理（2500万、7500万或15000万oMPC)中的一种。然 后在各自oMPC或生理盐水处理之后7天和28天时，用HDM再次激发绵羊。在之前显示的 时间点时HDM再次激发之后不久评估肺功能和BAL细胞分析。2500万、7500万或15000万 oMPC的IV输注被良好耐受而没有与给予这些细胞有关的不良反应。
[0321] 在当前的研究中，相比对照绵羊，经静脉输注单剂量的oMPC通常与对过敏原激发 较不严重的生理应答有关。例如，用15000万oMPC处理之后四周时，EAR肺功能应答出现统 计学上显著的减弱。有趣的是，EAR的显著减弱在MPC处理后4周时在15000万oMPC处理 组中被延迟并被观测到。不受任何理论和作用方式的限制，该延迟效应可能是由于结合膜 的肥大细胞过敏原特异性IgE的长半衰期导致的。这可表明，过敏原特异性IgE最终由肥 大细胞脱落之后，MPC能够减少肥大细胞脱颗粒，这最终导致oMPC处理后4周时EAR减少。
[0322] 相比对照，全部三个oMPC处理组在oMPC处理后1周时普遍使LAR肺功能指数变 弱。对来自三个不同oMPC剂量的数据合并分析显示，相比输注生理盐水的对照绵羊，在处 理后1周和4周的时间点，oMPC处理在统计学上显著改善BHR肺功能指数。因而，看起来， oMPC-处理绵羊的BHR肺功能指数的改善在oMPC输注之后持续4周。这与来自15000万剂 量组的EAR数据的解释相一致，所述EAR数据表明在4周时间点时oMPC输注的显著治疗效 应是明显的。
[0323] 不受任何理论或作用方式的限制，oMPC改善具有实验性哮喘的绵羊肺功能的效 应可能至少部分与在这些oMPC处理的动物的气道壁中嗜酸性粒细胞的稍微较低的密度相 关。气道壁中的嗜酸性粒细胞组织密度的盲式形态测定分析显示，与生理盐水处理的对照 绵羊相比，15000万oMPC处理组具有显著更低的组织嗜酸性粒细胞密度。此外，在4周的研 究期间，最高剂量的oMPC有效减少气道嗜酸性粒细胞密度，考虑到在单次给予oMPC后四周 尸检时收集用于分析的所有形态测定数据。
[0324] 该结果表明，oMPC处理与BAL液中较低水平的嗜中性粒细胞有关。过敏原激发之 后两天，在处理前的所有测试绵羊中，总BAL细胞中的嗜中性粒细胞平均百分比为0. 89%。 从该相对低的百分比，在oMPC后1周的时间点，2500万和15000万oMPC处理组有效减少 BAL中的嗜中性粒细胞百分比超过50%。在给予oMPC之后随后4周的时间点，用7500万 oMPCs处理显著减少BAL中的嗜中性粒细胞。BAL液和气道壁中的嗜中性粒细胞的存在与 哮喘某些表型的病理学有关。
[0325] 本研究中所使用的全部绵羊基于用HDM外周免疫接种完成之后7天在其血浆中高 水平的HDM-特异性抗体而选入试验，因而在本研究中仅使用被致敏的绵羊。值得注意的 是，结果表明，oMPC处理使过敏原-特异性IgE抗体变弱，并且该效应在单次输注2500万 或7500万oMPC之后持续四周。在15000万oMPC组中，IgE的抑制在oMPC后1周显著，在 四周取样时间点时减弱。与处理之前的值相比，生理盐水处理的对照绵羊在1周或4周的 时间点时未显示血清HDM-特异性IgE水平的显著降低。
【主权项】
1. 治疗或预防呼吸病症和/或用于治疗IgE-介导的过敏症和/或用于降低对过敏原 的过敏反应和/或用于诱导个体对过敏原无反应性和/或改善患有过敏症的个体的肺功能 的方法，所述方法包括向个体给予富集STRO-Γ细胞的细胞群和/或其后代和/或源自它 们的可溶性因子。2. 如权利要求1所述的方法，其中所述呼吸病症为急性呼吸病症或慢性呼吸病症。3. 如权利要求1或2所述的方法，其中所述呼吸病症为炎症性呼吸病症，阻塞性呼吸病 症或限制性呼吸病症。4. 如权利要求3所述的方法，其中所述呼吸病症或过敏症为阻塞性呼吸病症或过敏症 或者炎症性肺部病症或过敏症。5. 如权利要求4所述的方法，其中所述呼吸病症为哮喘。6. 如权利要求5所述的方法，其中所述哮喘为急性哮喘、慢性哮喘、重度哮喘和/或难 治性哮P而。7. 如权利要求6所述的方法，其中所述哮喘为长效β激动剂（LABA)难治性哮喘或类 固醇难治性哮喘。8. 如权利要求3所述的方法，其中所述呼吸病症为限制性呼吸病症。9. 如权利要求8所述的方法，其中所述呼吸病症为特发性肺纤维化。10. 如权利要求1所述的方法，其中所述病症为针对屋尘螨过敏原（HDM)的过敏症，或 所述过敏原为HDM。11. 如权利要求1至10中任一项所述的方法，其包括给予富集STR0-116细胞的细胞群 和/或其后代和/或源自它们的可溶性因子。12. 如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中全身给予所述富集STR0-1 +细胞的 细胞群和/或其后代和/或源自它们的可溶性因子。13. 如权利要求12所述的方法，其中经静脉内或鼻内给予所述富集STRO-Γ细胞的细 胞群和/或其后代和/或源自它们的可溶性因子。14. 如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中多次给予所述细胞群和/或所述后 代和/或所述可溶性因子。15. 如权利要求1至14中任一项所述的方法，其包括出现以下一种或多种时向所述个 体给予另外剂量的所述细胞群和/或所述后代和/或所述可溶性因子： (i) 个体开始持续喘息和/或咳嗽和/或具有胸闷和/或呼吸困难； (ii) 通过肺活量计评估时个体显示以下的一种或多种： a) 持续至少2周，每周至少三天20%的差异； b) 用以下治疗之后最大流量提尚多20% 吸入β-激动剂10分钟； 吸入皮质类固醇6周； 30mg氢化泼尼松14天； c) 暴露于触发剂之后最大流量降低多20% (iii) 支气管镜检显示个体呼吸道中异常细胞和/或外源物质和/或阻塞；或者 (iv) 胸部CT扫描显示肺部血管畸形、肺部血液或流体聚集、支气管扩张、胸腔积液或 肺炎。16. 如权利要求1至15中任一项所述的方法，其包括给予足以实现以下的一种或多种 的剂量的所述细胞群和/或所述后代和/或所述可溶性因子： (i) 改善支气管高反应性； (ii) 减少肺或支气管肺泡灌洗液的嗜酸性粒细胞浸润； (iii) 减少肺或支气管肺泡灌洗液的嗜中性粒细胞浸润； (iv) 降低晚期哮喘反应； (v) 降低早期哮喘反应；和/或 (vi) 减少肺重塑/纤维化。17. 如权利要求1至16中任一项所述的方法，其包括给予IX10 6个至150X10 6个 STRO-Γ细胞和/或其后代。18. 如权利要求1至17中任一项所述的方法，其包括给予全身剂量的STR0-1 +细胞和 /或其后代和/或源自它们的可溶性因子。19. 如权利要求18所述的方法，其包括向个体给予在10mL中的150X106个STRO-Γ细 胞和/或其后代。20. 如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述富集STR0-1 +细胞的细胞群和 /或后代细胞为自体或同种异体的，和/或所述可溶性因子源自自体或同种异体细胞。21. 如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述富集STR0-1 +细胞的细胞群和 /或后代细胞在给药之前和/或在获得所述可溶性因子之前经过培养扩增。22. 如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述富集STR0-1 +细胞的细胞群为 STR〇-lto1，和/或表达非组织特异性的碱性磷酸酶（TNAP)，和/或所述后代细胞和/或可溶 性因子源自为STR〇-lbfl和/或表达TNAP的STR0-1 +细胞。23. 如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中将所述STRO-Γ细胞和/或其后代 细胞和/或源自它们的可溶性因子以组合物的形式给药，所述组合物包含所述STRO-Γ细 胞和/或其后代细胞和/或源自它们的可溶性因子以及载体和/或赋形剂。24. 用于治疗或预防呼吸病症和/或用于治疗IgE-介导的过敏症和/或用于降低对过 敏原的过敏反应和/或用于诱导对过敏原的无反应性和/或改善患有过敏症的个体肺功能 的富集STRO-Γ细胞的细胞群和/或其后代和/或源自它们的可溶性因子。25. 富集STR0-1 +细胞的细胞群和/或其后代和/或源自它们的可溶性因子在制备用 于治疗或预防个体的呼吸病症和/或用于治疗IgE-介导的过敏症和/或用于降低对过敏 原的过敏反应和/或用于诱导对过敏原的无反应性和/或改善患有过敏症的个体肺功能的 药物中的用途。
【专利摘要】本公开提供用于治疗或预防呼吸病症和/或用于治疗IgE-介导的呼吸过敏症和/或用于降低对呼吸过敏原的过敏反应和/或用于诱导个体对呼吸过敏原无反应性和/或用于改善患有过敏症的个体肺功能的方法，其包括给予个体富集STRO-1+细胞的细胞群体和/或其后代和/或源自它们的可溶性因子。
【IPC分类】A61P11/06, C12N5/0789, C12N5/0775, A61K35/28, A61P11/00
【公开号】CN105377274
【申请号】CN201380072492
【发明人】西尔维乌·伊泰斯库, 拉维·克里希南, 皮特·高希
【申请人】麦瑟布莱斯特公司
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2013年12月12日
【公告号】CA2893951A1, EP2931373A1, EP2931373A4, US20150306146, WO2014089625A1