三棱中抗肿瘤活性组分的提取方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药提取技术领域，具体涉及一种三棱中抗肿瘤活性组分的提取方 法，以及该活性组分在制备抗肝癌、抗肺癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 三棱为黑三棱科植物黑三棱（Sparganiumstolonierum,Buch.-Ham)的干燥块 茎，其味苦、性平、入肝、脾经，具有破血行气、消积止痛等功效。目前三棱一般整个或切片炮 制入药，缺乏必要的药效物质基础和药效研究，缺乏合理的质量控制标准，难以确保临床用 药的有效性、安全性、可持续性。可见，对三棱的化学成分进行进一步提取和研究非常有必 要。
【发明内容】
[0003] 本发明针对以上现有技术，采用高效液相色谱技术，从三棱中提取得到具备抗肝 癌和抗肺癌活性的活性组分，且该分离方法稳定，重复性高，制备量大，适用于大规模工业 化生产需要。
[0004] 本发明所采用的技术方案为：
[0005] -种三棱中抗肿瘤活性组分的提取方法，该方法包括以下步骤：
[0006] (1)超低温粉碎：取干燥的三棱为原料，进行超微粉碎5~20min，得到超微粉；
[0007] (2)乙酸乙酯提取：在超微粉中加入乙酸乙酯，乙酸乙酯的加入体积（L)为超微粉 质量（Kg)的8~10倍，70~75°C加热1~3小时进行提取，离心取沉淀重复1~3次，合 并提取的上清并浓缩干燥，为粗提组分；
[0008] (3)色谱分离：
[0009] (a) -维分离：取粗提组分用40%乙醇-正己烷溶液（乙醇与正己烷按体积比4 : 6配比而成，下同理）20~60°C超声溶解至浓度为60~100mg/ml，过膜后通过高压制备液 相色谱进行分离，采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用A流动相为正己烷、B流动 相为乙醇的二元流动相体系，进样量为100~150mL/针，流动相流速为550~600mL/min， 洗脱方式为B相浓度由0 %至30 % (即0 %乙醇-正己烷溶液至30 %乙醇-正己烷溶液） 梯度洗脱50-60min，检测波长为210~280nm，根据紫外吸收光谱收集10-17. 5min洗脱液 作为目的组分，经浓缩后真空冷冻干燥，得到一维液相组分；
[0010] (b)二维分离：取一维液相组分用40%乙醇-正己烷溶液20~60°C超声溶解至 浓度为60~100mg/ml，过膜后通过高压制备液相色谱进行分离，采用的色谱柱为Silica正 相硅胶色谱柱，采用A流动相为正己烷、B流动相为乙醇的二元流动相体系，进样量为1~ 4mL/针，流动相流速为12~16mL/min，洗脱方式为B相浓度5% (即5%乙醇-正己烷溶 液）等度洗脱25-30min，检测波长为210~280nm，根据紫外吸收光谱收集13. 5-14. 5min 洗脱液作为目的组分，经浓缩后真空冷冻干燥，得到本发明抗肿瘤活性组分。
[0011] 作为优选，所述步骤（1)中超微粉碎时间为12min。
[0012] 作为优选，所述步骤（2)中乙酸乙酯提取的提取温度为72°C。
[0013] 作为优选，所述步骤（2)中超微粉与乙酸乙酯的料液比为1 : 8。
[0014] 作为优选，所述步骤（3) (a)中粗提组分溶解于40%乙醇-正己烷溶液的浓度为 80mg/ml〇
[0015] 作为优选，所述步骤（3) (a) -维分离中色谱柱的直径为150mm，柱长为250mm，其 中娃球粒径为l〇ym，孔径为10nm。
[0016] 作为优选，所述步骤（3) (b)二维分离中一维液相组分溶解于40%乙醇-正己烷溶 液的浓度为80mg/ml。
[0017] 作为优选，所述步骤（3) (b)二维分离中色谱柱的直径为20mm，柱长为250mm，其中 娃球粒径为10μm，孔径为1 〇〇A。
[0018] 本发明进一步提供上述提取得到的抗肿瘤活性组分在制备抗肺癌药物中的应用。 该抗肿瘤活性组分作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的可接受载体或赋形 剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如：片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、 悬浮液、糖浆、口腔含片、舌下含片、注射剂、软膏剂、栓剂、吸入剂等多种剂型。
[0019] 本发明还进一步提供上述提取得到的抗肿瘤活性组分在制备抗肝癌药物中的应 用。该抗肿瘤活性组分作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的可接受载体或 赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如：片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液 剂、悬浮液、糖浆、口腔含片、舌下含片、注射剂、软膏剂、栓剂、吸入剂等多种剂型。
[0020] 本发明原料三棱为黑三棱科植物黑三棱的干燥块茎，其化学成分复杂，所以本发 明先选用乙酸乙酯进行有效组分的粗提，且乙酸乙酯为脂溶性溶剂，与其相似相溶的组分 也应该具备进入生物活性细胞所必需的脂溶性特性，从而具有更高的进入细胞参与细胞内 作用的可能性。
[0021] 其次在色谱分离的选择上选用离线二维液相色谱技术进行有效组分的提取，其优 势在于二维液相色谱不仅具有更高的峰容量，而且二维具有不同的选择性。经过一维简化 的组分可以在二维上根据不同的选择性实现互补分离，结构相似的化合物可能在二维上可 达到有效分离，从而提高制备的效率和化合物纯度。
[0022] 本发明利用液相色谱制备的方法成功从中药三棱中提取分离得到纯度达到98% 的天然小分子化合物，该方法工艺简单，时间周期短，试剂耗费量小，制备量大，稳定可控， 重复性好，实用性高，适用于大规模工业化生产的需要。
[0023] 现在药理研究表明，三棱具有多种药理作用并被广泛应用于心脑血管疾病、妇科 如子宫肌瘤各类疾病的治疗。本发明得到的天然小分子化合物性质稳定，通过细胞在线实 时监测的方法观测其在体外的抗肿瘤作用，发现该化合物对肺癌A549细胞和肝癌Η印_g2 细胞具有抑制作用，即体外实验抗肿瘤作用明显，具有良好的抗癌药物开发潜力，为抗癌天 然药物的开发提供了新的材料来源和理论依据。
【附图说明】
[0024] 图1所示的是本发明三棱中抗肿瘤活性组分提取方法的一维高压液相色谱分离 图；
[0025] 图2所示的是本发明三棱中抗肿瘤活性组分提取方法的二维高压液相色谱分离 图；
[0026] 图3所示的是本发明得到的目的组分的HPLC验纯图；
[0027] 图4所示的是本发明目的产物对肺癌A549细胞的抑制作用，其中上方线为空白对 照孔、下方线为实验孔；
[0028] 图5所示的是本发明目的产物对肝癌Hep_G2细胞的抑制作用，其中上方线为空白 对照孔、下方线为实验孔。
【具体实施方式】
[0029] 以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示 性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语 具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
[0030] 1、原料、材料：
[0031] 三棱采摘自保定安国并经过鉴定；A549细胞、Hep_G2细胞由中国医学科学院血液 病医院提供。
[0032] 2、试剂：
[0033] 乙醇够自天津市北方天医化学试剂厂；分析级正己烷购自天津康科德科技有限公 司；色谱级乙酸乙酯购自Honeywell公司；DMS0购自Sigma公司；F-12K培养基购自Life TechnologiesCorporation;MEM培养基贝勾自LifeTechnologiesCorporation。
[0034] 3、仪器设备：
[0035] 分析纯水由密立博纯水仪生产；超微粉碎机购自山东三清不锈钢设备有限公司； 台式冷冻离心机购自Thermo公司；恒温鼓风干燥箱购自上海一恒科学仪器有限公司；旋转 蒸发仪上海亚容生化仪器厂；色谱柱购自博纳艾吉尔有限公司；制备型高效液相色谱仪购 自江苏汉邦科技有限公司；细胞实时监测仪购自艾森生物（杭州）有限公司；细胞培养箱 购自立德泰勅（上海）科学仪器有限公司。
[0036] 实施例1 :
[0037] 本实施例从三棱中提取抗肿瘤活性组分的方法，包括以下步骤：
[0038] ⑴取干燥的三棱为原料，放入超微粉碎机中进行超微粉碎，同时粉碎全过程用4°C 的水作为超微破碎机内部冷却液，超微粉碎时间为12min，得到超微粉。
[0039] ⑵取上述三棱超微粉3Kg，经过三次乙酸乙酯提取，第一次提取：3kg超微粉加入 24L乙酸乙酯，72°C提取70min，提取结束，25°C、6000rpm离心30min，分别收集上清、沉淀。 第二次提取：第一次提取沉淀加入12L乙酸乙酯，72°C提取70min，提取结束，25°C、6000rpm 离心30min，分别收集上清、沉淀。第三次提取：第二次提取沉淀加入9L乙酸乙酯，72°C提 取70min，提取结束，25°C、6000rpm离心30min，收集上清，三次上清液合并并浓缩干燥，为 粗提组分。
[0040] ⑶将干燥至恒重的粗提组分用流动相（40 %乙醇-正己烷溶液）配制成80mg/mL 的溶液，溶解后过〇. 45μm的有机滤膜，得