比较两种生物分子的结构的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年6月4日提交的题目是"生物分子的热力学结构可比性 (THERMODYNAMIC STRUCTURAL COMPARABILITY OF BI0M0LECULES)" 的美国临时专利申请第 61/830,889号的优先权益，其内容以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
[0003] 本发明涉及评估治疗性蛋白质、抗体和肽(各自在本文中称为生物分子)与第二生 物分子(例如，参考生物分子）的类似性(例如，结构类似性）以确保相当安全性和功效的方 法。
【背景技术】
[0004] 生物类似药(还称为后继生物制品）是活性原料药通过活生物体制造或借助于重 组DNA或受控基因表达方法衍生自活生物体的生物医学产品。生物类似药和后继生物制品 是用以描述在关于原创药的专利和排他性到期之后由不同赞助商制造的原创生物医药产 品的官方批准的后续形式的术语。生物类似药在加拿大还称为后续进入生物制品（SEB)。提 及原创药是批准的整体组分。
[0005] 不同于更常见的小分子药物，生物制品通常展现高分子复杂性，并且可能对制造 工艺中的变化相当敏感。生物类似药制造商无法利用原创物的分子无性系和初始细胞库， 也无法利用确切发酵和纯化工艺，也无法利用活性原料药。其可以利用商业化的原创药和 工业技术诀窍。然而，杂质和/或分解产物的差异可能会具有严重健康影响。这已经产生了 如下问题，生物制品的拷贝可能会与产品的初始标商标的形式不同地表现。因此，生物制品 的仅几个后续形式在美国通过使小分子通用名药（即促生育素 (Menotropins )(1997年1月） 和依诺肝素(Enoxaparin) (2010年7月））和另八种生物制品通过505(b) (2)路径的简化程序 而得到了授权。
[0006] 生物类似药经历需要为化学通用名药所需的相当大的额外数据、但不如关于初始 生物技术医学那么全面的审批流程。为了向公众发布，基于通过临床、动物和分析研究汇集 的数据，生物类似药必须显示为与母生物产品接近一致。结果必须表明，其产生相同临床结 果并且可与市场上已有的参考FDA核准的生物产品互换。US FDA已经清楚地阐明游戏规则， 并且"基于逐产品"和基于"证据总体"批准这些产品。这已经导致科学家开发展现与原创物 或常规地称为参考列表药物或RLD的产品的结构类似性的新颖和创新方法。
[0007] 蛋白质工程化和生物医药制造领域中对于用于以热力学稳定状态评估蛋白质结 构类似性以确保生物分子的安全性的方法有大的未满足的需要。本发明通过提供检测在由 渗透和介电变化诱导的热力学应力条件下的荧光的非破坏性方法，实现了此需要。
【发明内容】
[0008] 本发明提供通过以下方式评估第一生物分子与第二生物分子的结构类似性的方 法:检测所述第一和第二生物分子对由渗透和介电变化诱导的热力学应力条件的一或多种 响应，包括检测荧光发射的移位和/或发射强度的变化。在所述方法的一个实施例中，本发 明通过改变周围介质中的重量摩尔渗透浓度或介电条件而对蛋白质结构产生平缓应力，导 致水分子的结合改变和可能离子与官能团（例如色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸）的结合改变。 随后通过重量摩尔渗透浓度和介电条件的变化(包括离子强度的变化）的各种条件下的光 谱移位和发射强度变化，比较两种来源的相同蛋白质。不同应力条件下的类似变化表示高 结构类似性。
[0009] 本发明的方法适用于分析任何功能蛋白，所述功能蛋白包含至少一种荧光团，包 括色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸，能够提供荧光响应的芳香族氨基酸。
[0010] 利用三种芳香族氨基酸的荧光性质的方法可以用以评估复杂蛋白质或蛋白质混 合物的结构类似性。在本发明的一个实施例中，所述方法可以应用于评估多克隆抗体制剂、 单克隆抗体、抗体片段(例如Fab )、抗体衍生的构筑体(例如s cFv和单抗体域）、蛋白质治疗 剂(其可以是酶、工业酶、肽和蛋白质消化物)和其任何变异体或衍生物的生物类似性，其限 制条件为这些生物分子含有能够提供荧光响应的芳香族氨基酸。
[0011] 在本发明的另一个方面，所述方法使用渗透应力分析(OSA)来改变蛋白质的结构 以基于如下假设展现结构类似性，如果施加应力下的变化相同，那么初始结构也应该相同。 本发明的此方法可以应用于其中关于蛋白质结构的信息是有用参数的蛋白质产品研究或 开发的任何方面。在本发明的各个方面，所述方法用以测定在筛选期间蛋白质变异体或在 选择过程的早期制备的替代性候选物的固有结构，测定在最终选择过程中候选物的固有结 构，测定在医药开发中不同调配物下的样品结构变化，或测定在不同储存和应力条件下的 样品结构。
[0012] 在本发明的另一个方面，所述方法使用由表面活性剂的浓度变化引起的介电应力 来改变蛋白质的结构以基于如下假设展现结构类似性，如果施加应力下的变化相同，那么 初始结构也应该相同。本发明的此方法可以应用于其中关于蛋白质结构性结构(protein structural structure)的信息是有用参数的蛋白质产品研究或开发的任何方面。在本发 明的各个方面，所述方法用以测定在筛选期间蛋白质变异体或在选择过程的早期制备的替 代性候选物的固有结构，测定在最终选择过程中候选物的固有结构，测定在医药开发中不 同调配物下的样品结构变化，或测定在不同储存和应力条件下的样品结构。
[0013] 在本发明的另一个方面，所述方法用以展现重组治疗性蛋白质的生物类似性。
[0014] 在本发明的另一个方面，所述方法用以确立重组治疗性蛋白质的相当安全性。
【附图说明】
[0015] 当与附图结合阅读时，将更好地理解本发明的以上
【发明内容】
以及以下具体实施方 式。出于说明本发明的目的，图中展示目前优选的实施例。然而，应理解，本发明不限于所展 示的精确布置、实例和工具。
[0016] 图1展示溶液的重量摩尔渗透浓度变化的效应。
[0017] 图2展示聚山梨醇酯80浓度的6倍(0.004%到0.024%w/v)增加对TPI-非格司亭 (TPI -Fi I gras t im) (Theragras t im?)和NEUP0GEN?中的非格司亭的荧光特征的效应。
[0018] 图3展示在增加张力下TPI-PEG-非格司亭的结果。
[0019]图4展示在增加 PS-80浓度下TPI-PEG-非格司亭的结果。
[0020]图5展示在增加张力下HSA的结果。
[0021 ]图6展示在增加 PS-80浓度下HSA的结果。
[0022]图7展示在增加张力下溶菌酶的结果。
[0023] 图8展示在增加 PS-80浓度下溶菌酶的结果。
【具体实施方式】
[0024] 定义
[0025] "生物分子"意指通过生物过程制备的化学实体，其可以包含天然或重组蛋白质。
[0026] "蛋白质"意指肽或多肽分子，其可以包含单个亚单位或多个亚单位。
[0027]关于生物分子的术语"结构上类似"和"结构类似性"在本文中可互换地使用，并且 是指生物分子的在第一生物分子与第二生物分子(例如，参考生物分子)之间类似的一或多 种结构性质，包括例如包含生物分子的溶液的焚光发射波长和/或焚光强度。在第一和第二 生物分子的一或多种结构性质 100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91 %、 90%、85%、80%或75%-致时，第一生物分子可以视为结构上类似于第二生物分子。在一 些实施例中，在第一结构性质在第一与第二生物分子之间100%、99%、98%、97%、96%、 95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%或75% -致并且第二结构性质在第一与第二 生物分子之间 100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80% 或75 % -致时，第一生物分子视为结构上类似于第二生物分子。
[0028] "渗透剂"意指已知改变溶液的重量摩尔渗透浓度并且因此能够破坏蛋白质内的 共价相互作用(包括氢键、静电键、范德华力(Van der Waals force)、疏水性相互作用或二 硫键以及与水分子的键结)的药剂。渗透剂的实例包括聚乙烯和缓冲剂、盐、脲、非离子型和 离子型清洁剂、酸(例如盐酸(HCl)、乙酸(CH3C00H)、卤化乙酸)和疏水性分子(例如，磷脂）。
[0029] "渗透应力分析(0SA)"意指缓冲液的导致重量摩尔渗透浓度改变的组成变化，和 此变化对所观察到的蛋白质特性的效应。
[0030] "生物类似性"意指新开发的药物与原创药或参考列表药物(RLD)之间以比较模式 在结构、临床响应、毒性和副作用方面展现类似性。
[0031] "重组产品"意指细胞或生物体中所产生的、其DNA已通过插入或并入引起生物分 子的表达的基因序列而经修饰的生物分子。
[0032] 蛋白质结构的评估可以视为生物类似分子的安全性的最终测试。表达于遗传修饰 生物体中的重组蛋白可以产生超出一级或二级结构和甚至超出三级结构的结构变化形式； 蛋白质分子如何与带电的或另外在溶液中的其它实体缔合通常决定了其活性、毒性和副作 用。
[0033] 本发明探测受由更高浓度的渗透剂、更确切地说离子型渗透剂产生的施加渗透应 力影响的折