伴侣蛋白而防止凝集，并且促进蛋白质折叠和再折叠 (例如，通过表面活性剂诱导膜蛋白折叠）。然而，常用的聚山梨醇酯可能通过氧化或水解而 降解，并且其降解产物可能会对蛋白质稳定性发挥改变效应。另外，归因于膜过滤步骤期间 的复杂行为而可能难以控制调配物中表面活性剂的水平。
[0064]市售单克隆抗体调配物中几乎70 %含有聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80作为稳定 赋形剂。在那些商业制剂内，聚山梨醇酯浓度范围在0.001 % (w/v)聚山梨醇酯80 (Reopro?)和〇. 16% (w/v)聚山梨醇酯20 (Raptiva?)之间，大多数调配物含有约〇. 005到 0.02%聚山梨醇酯20或80。所述聚山梨醇酯之间的一个差异是聚山梨醇酯80(约0.0017% (w/v))与聚山梨醇酯20(约0.007% (w/v))相比的更低临界胶束浓度。此性质因此可以用以 在治疗性蛋白质的溶液中产生介电应力。
[0065]通常，热力学系统的周围环境还可以视为另一热力学系统。从这个观点，可以将系 统和其周围环境视为相互接触的两个系统，长程力也连接其。系统的壳体是两个系统之间 的接触或边界的表面。在热力学形式下，表面被视为具有特定渗透性性质。举例来说，接触 的表面可以经推测为可透电荷，使得周围热力学系统的介电性质延伸。作为一个实例，G-CSF(粒细胞菌落刺激因子）在本发明中用以展现本发明方法的效用。重组人类G-CSF具有 175个残基并且其表达于大肠杆菌(E.coli)中。蛋白质具有与由人类DNA序列分析预测的天 然序列一致的氨基酸序列，不同之处在于添加了于大肠杆菌中表达所需要的N末端甲硫氨 酸。
[0066] G-CSF具有三个酪氨酸、六个苯丙氨酸和两个色氨酸，能够发荧光的芳香族氨基 酸。因为苯丙氨酸和色氨酸两者都是非极性的，所以其与水分子或与缓冲溶液的物质的相 互作用通过与极性的酪氨酸的相互作用不同的机制发生。所测试G-CSF的产品的调配物中 所见的水和其它实体可以与极性和非极性氨基酸两者结合或相互作用。当我们考虑水的构 造如何将此高度极性实体变为非极性实体时，我们认识到，三种芳香族氨基酸中的每一者 在确立用于蛋白质结构验证的稳定方案方面是重要的。
[0067] 本发明的方法因此可以有利地用以提供关于蛋白质的化学结构的信息，或所述方 法可以凭经验用以在一系列变异体或变化的制剂之中基于其与参考蛋白质的总结构符合 性进行评级和选择，这可能为制造重组蛋白和单克隆抗体的工艺开发中所需，其中过程控 制中的微小变化可能会影响其结构。
[0068] 在一个实施例中，乙酸盐缓冲剂用作离子强度的来源，但此不限于任何特定缓冲 剂物质，因为渗透应力可以通过各种渗透剂(包括非离子型渗透剂，例如聚乙二醇)实现。在 本发明的其它方面，其它渗透剂因此可以取代乙酸盐离子型物质。天然渗透剂包括三甲胺 N-氧化物(TMAO )、二甲基巯基丙酸盐、三甲基甘氨酸、肌氨酸、甜菜碱、甘油磷酰胆碱、肌醇 和牛磺酸。渗透剂还可以是甘油、聚乙二醇、缓冲剂(例如乙酸盐缓冲剂）、盐、脲、非离子型、 离子型清洁剂、酸和疏水性分子。
[0069] 在一个实施例中，聚山梨醇酯80用作介电性质的调节来源，但此不限于任何特定 表面活性剂，因为介电性质的变化可以通过各种极性和非极性组分(包括表面活性剂)实 现。
[0070] 测定蛋白质构象结构和完整性的方法与展现后继蛋白质与抗体的生物类似性高 度相关。尽管在使用公开典型二维与三维差异的标准方法方面已经取得了许多进展，但与 蛋白质的免疫原性相关的问题需要对蛋白质的第四维结构进行进一步研究。蛋白质分子中 的官能团与培养基的组分的缔合据报道为一种评估衍生自不同来源的样品之间的结构差 异的快速方法。理想地通过增加最终调配物缓冲液的离子强度产生的渗透应力提供理想溶 液，有高度临床相关的观察结果。物理或化学分解蛋白质的其它方法无法提供充分确立生 物类似产品的安全性所需要的敏感信息。
[0071] 本文中所公开的特别适用于其中产生大量活性蛋白质的工业设置。本发明的方法 还可以用作在具有其它类似性质的蛋白质之间进行区别的另一方法。通过在蛋白质之间基 于其热力学稳定结构进行区别，实现用于测量蛋白质结构类似性的替代性参数。结构差异 可以使用上文所述的手动或自动化方法并且随时间推移记录信号强度来测量。
[0072] 尽管本发明中测试的商业产品当预期用于静脉内注射时是等张的，但本发明使用 至少两个范围，一个更接近于其中产品不会导致溶血，并且另一个更接近于其中其不会导 致皱缩。在这些范围之外，产品将不适用于向人类投与。为了避免皱缩或溶血，注射和输注 应该具有尽可能接近于血浆的重量摩尔渗透浓度。具有与另一溶液相同的渗透压力的溶液 称为等张的。在生理学中，等张通常假定溶液具有与血液相同的重量摩尔渗透浓度。大体积 输注应该具有接近于287-290m0sm/kg的重量摩尔渗透浓度，并且所有注射应该具有尽可能 接近于正常范围（285-295m0sm/kg)的重量摩尔渗透浓度。
[0073]正如所料，较高重量摩尔渗透浓度导致水分子丢失、芳香族荧光基团暴露和荧光 增加。当在284nm下激发溶液时，两种所测试样品展示一致的荧光移位概况。此提供了两种 所测试溶液之间的热力学结构类似性的足够证据。
[0074] 实例
[0075] 实例 1
[0076] 为了测试介电和渗透应力的效应，使Theragrastim和Neupogen经历增加浓度的乙 酸盐和聚山梨醇酯80(非离子型表面活性剂）。在相同溶液条件下比较溶液的荧光性质。在 对每一药品用2M乙酸盐和非格司亭调配物缓冲液执行3倍稀释之后，进行此处理。因此，测 试物的非格司亭浓度对于小瓶产品是0.1mg/mL，并且对于注射器产品是0.2mg/mL。聚山梨 醇酯80的浓度介于0.004%到0.024% (六倍变化）。
[0077] 将Theragrastim中所用的TPI非格司亭原料药用非格司亭调配物缓冲液（IOmM乙 酸盐，5%山梨糖醇，0.004%聚山梨醇酯80,在pH 4.0下）从1.2mg/mL稀释到0.6mg/mL。随后 将0.6mg/mL非格司亭溶液用200mM乙酸盐，5 %山梨糖醇，0.01 %聚山梨醇酯80 (在pH 4.0 下）或IOmM乙酸盐，0.004%聚山梨醇酯80(在pH 4.0下）三倍稀释到0.2mg/mL。用于这些测 试物的最终溶液条件分别是137mM乙酸盐，5 %山梨糖醇，0.007 %聚山梨醇酯80(在pH 4.0 下），或IOmM乙酸盐，1.7%山梨糖醇，0.004%聚山梨醇酯80(在pH 4.0下）。
[0078] 将O · 6mg/mL下的Neupogen药品用200mM乙酸盐，5%山梨糖醇，O · Ol %聚山梨醇酯 80(在pH 4 · 0下）或IOmM乙酸盐，0 · 004%聚山梨醇酯80(在pH 4 · 0下）三倍稀释到0 · 2mg/mL。 用于这些测试物的最终溶液条件分别是137mM乙酸盐，5 %山梨糖醇，0.007 %聚山梨醇酯80 (在pH 4.0下），或IOmM乙酸盐，1.7%山梨糖醇，0.004%聚山梨醇酯80(在pH 4.0下）。
[0079] 产生适当空白溶液，随后通过荧光光谱法获取测试物光谱，并且测定每一溶液的 重量摩尔渗透浓度。137mM乙酸盐，5%山梨糖醇，0.007%聚山梨醇酯80(在pH 4.0下）溶液 的重量摩尔渗透浓度经测定为414m0sm/kg，并且IOmM乙酸盐，1.7%山梨糖醇，0.004%聚山 梨醇酯80(在pH 4.0下）的重量摩尔渗透浓度经发现为151m0sm/kg。
[0080] 使用257nm的激发波长获取每一空白溶液的三个荧光光谱，同时在环境温度下在 100nm/min的扫描速率下监测295-400nm的发射。将三个光谱的平均值保存于仪器的软件 中，用于从随后获取的样品光谱自动减除。图1展示溶液的重量摩尔渗透浓度变化的效应。 对于TPI-非格司亭原料药和NEUPOGEN? (安进(Amgen)的产品）两者，随着乙酸盐含量增 加到约〇.67]?(1141111〇8111/1^的重量摩尔渗透浓度），观察到发射强度的约30%降低，但未观 察到发射波长的显著移位。
[0081] 在环境温度下使用用以获得空白光谱的相同参数获取每一0 . 2mg/mL Theragrastim和Neupogen样品的三个焚光光谱。在仪器的软件中将三个光谱自动平均化， 并且空白溶液从样品光谱自动减除。图2展示聚山梨醇酯80浓度的6倍(0.004 %到0.024 % w/v)增加对TPI-非格司亭(TheragrastimTM)和NEUK)GEN@(安进的产品）的荧光特征的 效应。随着聚山梨醇酯80浓度增加，观察到发射波长从约341nm到约338nm的蓝移。此移位还 伴有荧光强度的显著增加。
[0082] 所测试Theragrast im和Neupogen的重量摩尔渗透浓度介于114 ImOsm/kg到 103m0sm/kg。正常人类血浆的重量摩尔渗透浓度在285-295m0sm/kg范围内。重量摩尔渗透 浓度高于600m0sm/kg的药剂造成红血球皱缩(萎缩），导致显著疼痛。重量摩尔渗透浓度小 于约150m0sm/kg的溶液造成溶血(红血球破裂)和注射位点的疼痛。
[0083] 实例2
[0084]三种蛋白质经历渗透应力和PS-80浓度增加(介电）：（I )TPI-PEG-非格司亭；（2)人 血清白蛋白（HSA);和(3)溶菌酶。以与实例1中关于TP