对数生长期细胞。
[0069] 2、细胞增殖的检测：
[0070] 分别调整B16、A375、A875和SK-MEk2细胞株细胞悬液浓度为IXloVml，加入96孔 培养板内，每孔10化L，置37°C、0)2体积分数为5 %的解箱内培养2地。吸除旧培养基，分别加 入含本发明实施例1~5 W及对比例1~2制得的中药制剂(药物浓度为lOOmg/ml、50mg/ml、 25mg/ml、5mg/ml)的无血清DMEM培养基，并设空白对照组和调零组，每组均设3复孔，继续培 养24h。加入10化WST~8溶液，培养化。在490nm处检测各孔的吸光值。细胞增殖抑制率= [1-(加药组OD平均值-调零孔OD平均值）/(空白对照组OD平均值-调零孔OD平均值）]X 100%。每个实验进行3次W上的重复实验，W确保实验的准确性。
[0071] 3、细胞调亡的检测
[0072] 分别调整B16、A375、A875和SK-MEk2细胞株细胞悬液浓度为IXloVml，加入96孔 培养板内，每孔l(K)yL。待细胞生长达融合状态后，吸除旧培养基，分别加入含本发明实施例 1~5 W及对比例1~2制得的中药制剂(药物浓度为lOOmg/ml、50mg/ml、25mg/ml、5mg/ml)的 无血清DMEM培养基，并设空白对照组，空白对照组加含0.1 %DMS0的培养基，药物作用24h 后，将细胞上清吸至离屯、管内，细胞经膜酶消化后，移至与细胞上清相同的离屯、管内，在4°C 溫度下W1000巧m的转速离屯、5min，弃上清，用PBS洗1遍，弃上清，用Binding buffer洗1遍， 并^19.5化Binding buffer重悬，0.5化Annexin V~FITC混匀后室溫避光解育10分钟， 用Binding buffer洗1遍，并Wl9]iL Binding buffer重悬，加化LPI混匀后流式细胞仪上机 检测。
[0073] 4、实验结果
[0074] 表1本发明中药制剂对四种黑色素瘤细胞株细胞增殖影响的检测结果
[0075]
[0076]
[OOW]利用WST~8法对各组的细胞增殖与毒性进行检测，得到本发明中药制剂对四种黑 色素瘤细胞株细胞增殖的影响结果如表1所示，结果显示:与对比例1~2相比，本发明实施 例1~5制得的中药制剂体外对四种黑色素瘤细胞株(B16、A375、A875和SK-MEk2)细胞增殖 均显示了较强的抑制作用，W25~lOOmg/ml浓度最为显著；在药物浓度为lOOmg/ml的培养 基中，实施例5制得的中药制剂对B16细胞、A375细胞、A875细胞和SK-MEk2细胞的抑制率分 别达到了81.1%、97.0%、97.9%和88.9%。
[0078] 表2本发明中药制剂对四种黑色素瘤细胞株细胞调亡影响的检测结果
[0079]
[0080]
[0081]
[0082] 采用AnnexinV和PI双染流式细胞术检测，得到本发明中药制剂对四种黑色素瘤细 胞株细胞调亡的影响结果如表2所示，结果显示:与对比例1~2相比，本发明实施例1~5制 得的中药制剂对四种黑色素瘤细胞株(B16、A375、A875和SK-MEk2)细胞调亡均显示了较强 的诱导细胞调亡作用，W50~lOOmg/ml浓度最为显著；在药物浓度为50~lOOmg/ml的培养 基中，实施例5制得的中药制剂对B16细胞、A375细胞、A875细胞和SK-MEL-2细胞的调亡率分 别达到了 79.0 %、93.0 %、92.4 %和81.7 %，从而本发明中药制剂对人黑色素瘤细胞株 A375、A875均显示了较强的诱导细胞调亡作用，适宜开发成黑色素瘤治疗药物。
[0083] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在 不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够W其他的具体形式实现本发明。因此，无论 从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权 利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。
[0084] 此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加 W描述，但并非每个实施方式仅包 含一个独立的技术方案，说明书的运种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当 将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可W经适当组合，形成本领域技术人员 可W理解的其他实施方式。
【主权项】
1. 一种治疗黑色素瘤的中药制剂，其特征在于，由以下质量份的原料制成:蒲公英12~ 18份、白芍7~14份、香橼5~8份。2. 根据权利要求1所述的治疗黑色素瘤的中药制剂，其特征在于，由以下质量份的原料 制成:蒲公英14~17份、白芍9~12份、香橼5~7份。3. 根据权利要求1所述的治疗黑色素瘤的中药制剂，其特征在于，由以下质量份的原料 制成:蒲公英16份、白芍10份、香橼6份。4. 根据权利要求1~3任一所述的治疗黑色素瘤的中药制剂的制备方法，其特征在于， 包括以下步骤： (1) 将蒲公英洗净，加入8~10倍量的蒸馏水，浸泡2~3小时后，武火煮沸，文火煎煮3~ 4小时，过滤得第一次提取液和第一次药渣;往第一次药渣中再次加入6~8倍量的蒸馏水， 武火煮沸，文火煎煮2~3小时，过滤得第二次提取液和第二次药渣;最后，往第二次药渣中 加入4~6倍量的蒸馏水，武火煮沸，文火煎煮1~2小时，过滤得第三次提取液和第三次药 渣，将第三次药渣丢弃;合并三次提取液，过滤得滤液，将所得滤液浓缩成60°C下相对密度 为1.15~1.16的稠霄，即为蒲公英有效成分，备用； (2) 将白芍洗净，浸入4~5倍量的体积浓度为75~80%的乙醇溶液浸泡1~2小时，加热 提取3小时，回收乙醇，过滤得滤液，将所得滤液浓缩为65°C下相对密度为1.12~1.14的稠 膏，即为白芍有效成分，备用； (3) 将香橼洗净，浸入6~8倍量的体积浓度为65~75%的乙醇溶液中，浸泡1~2小时后， 粉碎提取3次，lOmin/次，提取后的药渣再用8~10倍量的热水粉碎提取3次，lOmin/次，两次 提取物合并得到香橼提取液； (4) 将步骤（1)制得的蒲公英有效成分、步骤(2)制得的白芍有效成分以及步骤(3)制得 的香橼提取液混合，然后在真空度0.06~0.08MPa下减压浓缩至50°C时相对密度为1.08~ 1.10的膏体，经喷雾干燥成粉状，最后按照常规制剂工艺制成颗粒剂，即得所述的治疗黑色 素瘤的中药制剂。5. 根据权利要求4所述的治疗黑色素瘤的中药制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤 (4)中，喷雾干燥采用的喷雾干燥机的进风温度为165~172°C、出风温度为82~83°C。6. 如权利要求1~3任一所述的中药制剂在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种治疗黑色素瘤的中药制剂及其制备方法及应用，所述中药制剂由以下质量份的原料制成：蒲公英12～18份、白芍7～14份、香橼5～8份；水热提取蒲公英有效成分；醇热提取白芍有效成分；香橼洗净，入乙醇溶液浸泡，粉碎提取，药渣再用热水粉碎提取，合并得香橼提取液；将蒲公英有效成分、白芍有效成分及香橼提取液混合，减压浓缩，喷雾干燥，制成颗粒剂。本发明以清热解毒、消肿散结、利尿通淋的蒲公英为主药，以平肝止痛、养血调经、敛阴止汗的白芍和舒肝理气、宽中、化痰的香橼为辅药，各味药材相互协同，共奏清热解毒、消肿散结、舒肝、理气、养血的功效，对于黑色素瘤的治疗可以显著抑制黑色素瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡。
【IPC分类】A61K36/752, A61P35/00
【公开号】CN105456444
【申请号】CN201510896275
【发明人】刘彩虹
【申请人】刘彩虹
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月3日