'uagcagcacauaaugguuugug 3'
[0152] miR-15b：5'uagcagcacaucaugguuuaca 3'
[0153] miR-16：5'uagcagcacguaaauauuggcg 3'
[0154] miR-195：5'uagcagcacagaaauauuggc 3'
[0155] miR_322/424:5'cagcagcaauucauguuuugga 3'
[0156] miR-497：5'cagcagcacacugugguuugua 3'
[0157] 已经表明这些miRNA在诸如脓毒症的病症中被上调，因此造成脓毒症中涉及的败 血性基因表达的抑制。通过抑制这些miRNA中的一个或多个，它们对脓毒症中涉及的基因的 抑制被阻断，这些基因的表达被允许，从而治疗胺毒症。
[0158] microRNA抑制性试剂
[0159]本文所述的试剂与特定miRNA序列相互作用，从而调节它们的功能和/或活性。也 可以使用试剂的组合，其一起具有协同作用或累加作用。该试剂可以特异性结合miRNA序列 并通过反义或siRNA技术沉默它们，或它们可以是与天然miRNA靶序列竞争的用于被讨论的 miRNA抑制的对应miRNA靶序列或其变体或片段。
[0160] 通常，该试剂是antagomir，它是阻止其他分子例如miRNA与mRNA分子上的期望位 点结合的化学工程化寡核苷酸。术语"antagomir"是指单链、双链、部分双链或发夹结构的 核糖核酸（RNA)或脱氧核糖核酸（DNA)或两者或其修饰的寡聚物或聚合物，其对于它的 miRNA靶标而言是反义的。
[0161] antagomir 和其他 miRNA 抑制剂的实例描述于 W02009/20771、W02008/91703、 W02008/046911、W02008/074328、W02007/90073、TO2007/27775、W02007/27894、TO2007/ 21896、TO2006/93526、TO2006/112872、TO2007/112753、TO2007/112754、TO2005/23986S W02005/13901，其全部通过引用并入本文。
[0162] 定制设计的antagomir分子可从例如Applied Biosystems商购。这些分子是设计 以特异性抑制细胞中天然存在的成熟miRNA分子的化学修饰的优化的单链核酸。例如，来自 Applied Biosystems的产品ID AM12607是靶向人miR-33a的Ambi〇iii)Anti-miRTM抑制 剂。
[0163] antagomir还可从Thermo Scientific商购。这些抑制剂包括化学修饰和二级结构 基序。例如，Vermeulen等在美国专利公开2006/0223777中报道了增强这些分子效力的二级 结构元件的鉴定。具体地，在反向互补核周围整合高度结构化的双链侧翼区显著提高了抑 制剂功能，并允许以亚纳摩尔的浓度抑制多个miRNA Antagomir设计中的其他这些改进预 期用于所公开的方法中。
[0164]在一个方面，antagomir包括足够长的核苷酸和足以与目标miRNA互补的区域，从 而antagomir与miRNA形成双链体。给定所讨论的miRNA的序列，可以根据Watson和Crick碱 基配对规则设计antagomir。
[0165] 因此，antagomir可以是具有与所讨论的miRNA的至少8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23或24个连续核苷酸互补的单链核酸序列的反义寡核苷酸，其中 所述反义寡核苷酸与miRNA在生理条件下形成双链体。
[0166] antagomir可以包括长度为至少8个连续核苷酸的反义寡核苷酸。因此，反义寡核 苷酸可以具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个连续核苷酸。寡 核苷酸的长度通常少于30个连续核苷酸。寡核苷酸的长度可以少于25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40 个连续核苷酸。
[0167] 公开的antagomir可以包括具有与目标miRNA至少部分，和在一些方面全部互补的 区域的反义寡核苷酸。antagomir和靶标之间不需要完美互补，但对应性必须足以使该反义 寡核苷酸与miRNA形成双链体，并随后降低其活性。例如，在通常的方面，反义寡核苷酸抑制 miRNA与其mRNA靶标的结合。
[0168] 公开的antagomir可以包括具有与目标miRNA至少65%、70%、71%、72%、73%、 74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 互补的区域的反义 寡核苷酸。
[0169] 通常，公开的antagomir具有与目标miRNA的核苷酸序列互补的至少6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸。在一个方面，公开的antagomir具 有与目标miRNA互补的核苷酸序列。因此，在一个方面，公开的antagomir具有与目标miRNA 互补的至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸。
[0170]在一些方面，在互补区存在核苷酸错配。在通常的方面，互补区将具有不超过1、2、 3、4或5个错配。
[0171 ] 在一些方面，antagomir与目标miRNA"严格互补"。因此，在一个方面，antagomir可 以退火至目标miRNA以形成杂合体，该杂合体仅由严格互补区的Watson-Crick碱基对组成。 因此，在一些方面，antagomir特异性的区别是单核苷酸的差异。在这种情况下，只有在单核 苷酸差异区发现严格互补时，antagomir才抑制miRNA活性。
[0172]公开的antagomir包括核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或两者或其修饰的寡 聚物或聚合物。该术语包括由天然存在的核酸碱基、糖和共价核苷间（骨架)连接以及具有 相似功能的非天然存在部分的寡核苷酸组成的寡核苷酸。这种修饰的或替换的寡核苷酸由 于期望性质，例如，诸如细胞摄入增强、对核酸靶标的亲和性增强，和/或在核酸酶存在下稳 定性增强，而优于天然形式使用。
[0173] antagomir寡核苷酸可以包括未修饰的RNA和DNA以及已经被修饰例如以提高功效 的RNA和DNA，和核苷替代物的聚合物。"未修饰的"RNA是指其中核酸成分（即糖、碱基和磷酸 盐部分)与其天然存在的，通常在人体内天然存在的核酸成分相同或基本上相同的分子。如 在本文所用，"修饰的" RNA是指其中一种或多种核酸成分(即糖、碱基和磷酸盐部分)与其天 然存在的核酸成分不同，通常与在人体内天然存在的核酸成分不同的分子。当称为"修饰的 RNA"时，它们当然包括严格来说不是RNA的分子（由于修饰）。
[0174] 可以修饰公开的antagomir寡核苷酸以增强对核酸酶的抗性。antagomir寡核苷酸 可以包括使其对核酸酶降解稳定的核苷酸修饰。寡聚物可以是totalmer、mixmer、gapmer、 tailmer、headmer或blockmer。"totalmer"是只包含非天然存在的核苷酸的单链寡核苷酸。
[0175] 术语"gapme r"是指由在至少5个天然存在的核苷酸（即未修饰核苷酸)侧翼的修饰 核苷酸片段组成的寡核苷酸。
[0176] 术语"blcokmer"是指两侧是至少5个天然存在的核苷酸的核酸片段的中央修饰的 核酸片段。
[0177] 术语"tailmer"是指具有在5'端的至少5个天然存在的核苷酸接着在3'端的修饰 的核酸片段的寡核苷酸。
[0178] 术语"headmer"是指具有在5'端的修饰的核酸片段接着在3'端的至少5个天然存 在的核苷酸的寡核苷酸。术语"mixmer"是指包含天然和非天然存在的核苷酸两者的寡核苷 酸。然而，与gapmer、tailmer、headmer和blockmer不同，其中不存在超过5个天然存在的核 苷酸的连续序列，例如DNA单元。
[0179] 修饰的核酸和核苷酸代替物可以包括以下的一种或多种：（i) 一个或两个非连接 磷酸酯氧和/或一个或多个连接磷酸酯氧的替换；（ii)核糖成分例如核糖2'羟基的替换，或 用除核糖之外的结构完全替换核糖；（iii)用"去磷酸"接头完全替换磷酸酯部分；（iv)天然 存在的碱基的修饰或替换；（V)核糖-磷酸酯骨架的替换或修饰;或(vi )RNA 3'端或5 '端的 修饰，例如在RNA的3 '端或5 '端去除、修饰或替换末端磷酸酯基团或链接部分，例如荧光标 记部分。
[0180]可以通过用不同取代基替换氧原子之一来修饰核酸中的磷酸盐基团。这种对RNA 磷酸酯骨架的修饰的一种结果可以是增强寡核糖核苷酸对核酸酶降解的抗性。因此，在一 些方面，期望引入造成不带电接头或具有不对称电荷分布的带电接头的变化。
[0181] 修饰的磷酸盐基团的实例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、磷酸硼烷、硼烷磷酸酯、 氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯、其中两个非连接氧均被硫取代的二 硫代磷酸酯。
[0182] 还可以通过用氮(桥联氨基磷酸酯）、硫(桥联硫代磷酸酯)和碳(桥联亚甲基膦酸） 替换连接氧来修饰磷酸酯接头。替换可以发生在末端氧上。
[0183] 可以用包含非磷酸的连接子替换磷酸酯基团。可以替换磷酸酯基团的部分的实例 包括硅氧烷、碳酸盐、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸、磺酰胺、硫甲缩 醛、甲缩醛(formacetal)、肟、亚甲基亚胺、亚甲基甲基亚胺、亚甲基氢偶氮基、亚甲基二甲 基氢偶氮基和亚甲基羟甲基亚胺。替换通常包括亚甲基羰基氨基和亚甲基甲基氨基基团。
[0184] 修饰的RNA可以包括核糖核酸的全部或一些糖基。例如，可以用很多不同"含氧的" 或"脱氧的"取代基修饰或替换2 '羟基基团(OH)。
[0185] "含氧的"2'羟基基团修饰的实例包括烷氧基或芳氧基(0R，例如R = H、烷基、环烷 基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖）；聚乙二醇(PEG)，0(CH2CH2O) nCH2CH2OR; "锁"核酸(LNA)，其中 羟基例如通过亚甲基桥联至相同核糖的4'碳;胺、O-AMINE和氨基烷氧基，O(CH2) nAMINE，（例 如AMINE = Nv4;烷基氨基、二烷基氨基、杂环基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或 二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基）。仅包含甲氧基乙基基团(Μ0Ε)(OCH 2CH2OCH3，PEG衍生物）的 寡核苷酸与用强大的硫代磷酸酯修饰所修饰的那些相比显示核酸酶稳定性。
[0186] "脱氧的"修饰包括氢（例如脱氧核糖）；卤代（例如氟代）；氨基（例如NH2 ;烷基氨 基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸）；NH (CH2CH2NH)nCH2CH AMINE(AMINE = NH2;烷基烷基、二烷基氨基、杂环基氨基、芳基氨基、二 芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基）、-NHC(0)R(R~烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基 或糖），氛基;疏基;烷基-硫代-烷基;硫代烷氧基;和烷基、环烷基、芳基、烯基和炔基，其可 以任选地用例如氨基功能取代。
[0187] 因此，antagomir可以包括2 ' -脱氧、2 ' -脱氧-2 ' -氟代、2 ' -0-甲基、2 ' -0-甲氧基乙 基(2'-〇-厘(^)、2'-〇-氛丙基(2'-〇-厶卩）、2'-〇-二甲基氛乙基(2'-〇-〇獻(^)、2'-〇-二甲基氛 丙基(2'-0-DMAP)、2'-0-二甲基氨乙氧基乙基(2'-0-DMAE0E)或2'-0-N-甲基乙酰氨基(2'-0-ΝΜΑ)。在一些方面，antagomir包括至少一个2 甲基-修饰的核苷酸，且在一些方面， antagomir的所有核苷酸包括2 ' -0-甲基修饰。
[0188] 糖基还可以包含与核糖中对应的碳具有相反立体化学构型的碳。因此，修饰的RA 可以包括，含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。
[0189] 修饰的RNA还可以包括"脱碱基"糖，其在C-P缺少核碱基。这些脱碱基糖还可以进 一步包含在一个或多个组成糖原子上的修饰。所述修饰还可以引起用另一个实体(SRMS)在 寡核苷酸试剂的一个或多个位点完全替换核糖结构。
[0190] 可以修饰寡核苷酸的3 '和5 '端。这种修饰可以在分子的3 '端、5 '端或两端。它们可 以包括整个末端磷酸酯或一个或多个磷酸酯基团原子的修饰或替换。例如，可以将寡核苷 酸的3 '和5 '端与其他功能性分子实体，例如标记部分，如荧光团（例如芘、TAMRA、荧光素、 Cy3或Cy5染料)或保护基团（例如基于硫、硅、硼或酯）结合。功能性分子实体可以通过磷酸 酯基团和/或间隔基与糖连接。间隔基的末端原子可以连接至或取代磷酸酯基团的连接原 子或糖的或C-5'CKNj或C基团。或者，间隔基可以连接至或取代核苷酸取代物（例如 PNA)的末端原子。这些间隔基或接头可以包括例如-(CH2)n-、-(CH2) nN-、-(CH2)n〇-、-(CH2) nS-、0(Cv4CH2O)nV40 V40H(例如n?3或6)、脱碱基糖、酰胺基、羧基、胺、羟基胺、羟基亚胺、硫 醚、二硫化物、硫脲、磺酰胺或吗啉、或生物素和荧光素试剂。
[0191] 末端修饰的其他实例包括燃料、螯合剂(例如吖啶）、交联剂(例如补骨脂素、丝裂 霉素 C)、扑啉(TPPC4、特沙弗林、Sapphyrin)、多环芳烃(例如吩嗪、二氢吩嗪）、人工内切核 酸酶(例如EDTA)、亲脂性载体(例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1，3_ 双-〇 (十六烷基)甘油、香叶草氧基己烷基、十六烷基甘油、冰片、薄荷脑、1，3-丙二醇、十七 烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、〇3-(油酰基)胆石酸、03-(油酰基)胆烯酸、二甲氧三苯甲基或吩 嗪）和肽偶联物（例如触角足基因肽、Tat肽）、烷化剂、磷酸酯、氨基、巯基、TOG(例如roG-^hMPEGjMPEGUjolyaraino、烷基、取代的烷基、放射性标记的标志物、酶、半抗原 （例如 生物素）、转运吸收促进剂(例如阿司匹林、维生素 E、叶酸）、合成的核糖核酸酶(例如咪唑、 双咪唑、组胺、咪唑集群、吖啶-咪唑偶联物、四氮杂大环的Eu3+复合物）。
[0192] 末端修饰包括将甲基膦酸酯添加至3-最末端连接;3 ' C5-铵烷基(ammoalky I )-dT; 3'阳离子基团;或抑制3'-5'外切核酸酶降解的另一个3'偶联物。
[0193] 有助于调节活性的末端修饰包括用磷酸酯或磷酸酯类似物修饰5'端。例如，在一 些方面，寡核苷酸试剂被5 '磷酸化或在5 '末端包括磷酰基类似物。5 '磷酸酯修饰包括其中 与RISC介导的基因沉默相容的那些。合适的修饰包括:5'_单磷酸酯（（H〇M〇)P-〇-5'） ；5'-二磷酸酯（（HO)2(O)P-P-(HO) (0)-0-5,）；5'_三磷酸酯（（H0)2(0)P"O-(HO) (O)P-O-P(HO) (0)-0-5'）； 5'鸟苷帽（7-甲基化或非甲基化）（7m-G-0-5'-(H0) (O)P-O-(HO) (O)P-O-P(HO) (0)-0-5 '）； 5 '腺苷帽(Appp)，和任何修饰或未修饰的核苷酸结构(N-0-5 ' -(HO) (O)P-O- (HO) (O)P-O-P (HO) (O) -0-5 '）； 5f-单硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；（HO) 2 (S)P-0-5 '）； 5 ' -单二 硫代磷酸酯（二硫代磷酸酯；（恥）（批）（5汗-0-5'），5'-硫代磷酸酯（（!10)2(0斤-5-5'）；氧/ 硫替换的单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯的任何其他组合(例如5'-α_三硫代磷酸酯、5'-γ -三硫代磷酸酯等）、5 ' -磷酰胺（（HO) 2 (0)Ρ-ΝΗ-5\ (HO) (NH2) (0) Ρ-0-5 '）、5 ' -烷基膦酸(R =烷基-甲基、乙基、异丙基、丙基等，例如RP(0H)(0)-0-5\(0H)2(0)P-5'-CH2-)、5'-烷基醚 磷酸酯(R =烷基醚=甲氧基甲基(MeOCH2-)、乙氧基甲基等，例如RP(OH) (0)-0-5'_)。
[0194] 腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶是RNA中最常见的碱基。可以修饰或替换这些碱 基以提供具有改进性质的RNA。例如，可以用这些碱基或合成的和天然的核碱基(例如肌苷、 胸腺啼啶、黄噪呤、次黄噪呤、nubularine、异鸟苷或tubercidin)和任何一种以上修饰来制 备耐核酸酶的寡核苷酸(例如寡核糖核苷酸）。或者，可以使用任何以上碱基，例如"不寻常 碱基"和"通用碱基"的取代或修饰类似物。实例包括2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲 基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、5-卤代尿嘧啶和胞嘧 啶、5-丙炔尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶）、4_硫 代尿嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-(2_氨基丙基)尿嘧啶、5-氨基烯丙基尿嘧啶、8-卤代、氨基、硫 代、硫代烷基、羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-三氟代甲基和其他5-取代的尿嘧啶 和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、5-取代的嘧啶、6-偶氮嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤、包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶、二氢尿嘧啶、3-脱氮-5-氮杂胞嘧啶、 2_氨基嘌呤、5-烷基尿嘧啶、7-烷基鸟嘌呤、5-烷基胞嘧啶-脱氮腺嘌呤、N6，N6-二甲基腺嘌 呤、2，6-二氨基嘌呤、5-氨基-烯丙基-尿嘧啶、N3-甲基尿嘧啶、取代的1，2，4-三氮唑、2-吡 啶酮、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、5-甲氧基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲氧基羰基甲基尿 嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿嘧啶