用于治疗脓毒症的MicroRNA抑制的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及miRNA。更具体地，本发明涉及通过使用miRNA抑制剂来治疗脓毒症和 其他疾病的方法。
【背景技术】
[0002] MicroRNA(miRNA)是小的非编码RNA分子，平均22个核苷酸长，其在基因表达的转 录和转录后调节中发挥作用。由真核生物的核DNA编码，miRNA通过在mRNA分子内与互补序 列的碱基配对发挥作用，一般通过翻译抑制或靶向降解造成基因沉默。人基因组可编码超 过1000个miRNA，其可靶向约60%的哺乳动物基因，且在很多人细胞类型中含量很高。各种 疾病状态已经涉及miRNA的异常表达，基于miRNA的治疗正在研究中。
[0003] 例如，Zhu等（Cardiovascular Research，2011，92 : 75-84)发现在心肌细胞中 microRNA-195(miR-195)通过下调Sirtl促进棕榈酸酯诱导的细胞凋亡。
[0004] Wang等(PLoS 0NE，2012,7(6):e38885)发现血清miRNA特征可以预测脓毒症患者 的死亡率。
[0005] 仍然需要鉴定能够特异性靶向治疗或预防各种疾病状态的一个miRNA或miRNA的 组合。
[0006] 发明简述
[0007] 一个方面，本发明涉及通过使用靶向和/或抑制miR-15家族的miRNA活性的miRNA 抑制剂来治疗脓毒症或其他相关疾病的方法。以这种方式，在一个方面，miRNA抑制剂有助 于治疗涉及miR-15家族成员上调的疾病、紊乱或病症，例如脓毒症。
[0008] 在一个方面，提供用于治疗脓毒症的方法，包括施用抑制在脓毒症中上调的miRNA 的活性的试剂。
[0009] 在一个方面，miRNA是miRNA-15家族的成员。
[0010] 在一个方面，miRNA 是 mir-15a、mir-15b、miR-16-l、miR-16-2、miR-195、mir-322/ 424和miR-497中的至少一个。
[0011] 在一个方面，miRNA 是 miR-195。
[0012]在一个方面，试剂保护器官功能。
[0013] 在一个方面，器官功能是肝功能、肺功能、肾功能和微血管功能中的至少一个。
[0014] 在一个方面，试剂降低细胞凋亡。
[0015] 在一个方面，试剂降低内皮细胞、肝细胞、肾细胞和免疫细胞中至少一种的细胞凋 亡。
[0016] 在一个方面，免疫细胞是巨噬细胞。
[0017] 在一个方面，试剂降低炎性反应。
[0018] 在一个方面，炎性反应是在肝、肺、肾和微血管的至少一个中。
[0019] 在一个方面，脓毒症是脂多糖诱导的脓毒症或粪便诱导的脓毒症。
[0020] 根据另一个方面，提供保护器官功能的方法，包括施用抑制miRNA-15家族的miRNA 活性的试剂。
[0021] 在一个方面，miRNA 是 mir-15a、mir-15b、miR-16-l、miR-16-2、miR-195、mir-322/ 424和miR-497中的至少一个。
[0022] 在一个方面，器官功能是肝功能、肺功能、肾功能和微血管功能中的至少一个。
[0023] 根据另一个方面，提供降低细胞凋亡的方法，包括施用抑制miRNA-15家族的miRNA 活性的试剂。
[0024] 在一个方面，miRNA 是 mir-15a、mir-15b、miR-16-l、miR-16-2、miR-195、mir-322/ 424和miR-497中的至少一个。
[0025] 在一个方面，试剂降低内皮细胞、肝细胞、肾细胞和免疫细胞中至少一种的细胞凋 亡。
[0026]在一个方面，免疫细胞是巨噬细胞。
[0027] 根据另一个方面，提供降低炎性反应的方法，包括施用抑制miRNA-15家族的miRNA 活性的试剂。
[0028] 在一个方面，miRNA 是 mir-15a、mir-15b、miR-16-l、miR-16-2、miR-195、mir-322/ 424和miR-497中的至少一个。
[0029] 在一个方面，炎性反应是在肝、肺、肾和微血管的至少一个中。
[0030] 在一个方面，试剂是锁核酸(LNA)寡聚物、吗啉基寡聚物、2'-0_甲基RNA寡聚物、 an t agomi r、抑制m i RNA成熟的空间阻断的寡聚物、或阻断mRNA转录体的m i RNA祀标位点的空 间阻断的寡聚物。
[0031] 根据另一个方面，提供用于治疗脓毒症的方法，包括施用增强在脓毒症中上调的 miRNA的靶基因活性的试剂。
[0032] 根据另一个方面，提供抑制在脓毒症中上调的miRNA活性的试剂用于治疗脓毒症 的用途。
[0033] 在一个方面，miRNA是miRNA-15家族的成员。
[0034] 在一个方面，11111?祖是111；[1-15&、111；[1-1513、11111?-16-1、11111?-16-2、11111?-195、111；[1-322/ 424和miR-497中的至少一个。
[0035] 在一个方面，miRNA 是 miR-195。
[0036]在一个方面，用途是保护器官功能。
[0037]在一个方面，器官功能是肝功能、肺功能、肾功能和微血管功能中的至少一个。 [0038]在一个方面，用途是降低细胞凋亡。
[0039] 在一个方面，用途是降低内皮细胞、肝细胞、肾细胞和免疫细胞中至少一种的细胞 凋亡。
[0040] 在一个方面，免疫细胞是巨噬细胞。
[0041] 在一个方面，用途是降低炎性反应。
[0042] 在一个方面，炎性反应是在肝、肺、肾和微血管的至少一个中。
[0043] 在一个方面，脓毒症是脂多糖诱导的脓毒症或粪便诱导的脓毒症。
[0044]根据另一个方面，提供抑制miRNA-15家族的miRNA活性的试剂用于保护器官功能 的用途。
[0045]在一个方面，11111?祖是111；[1-15&、111；[1-1513、11111?-16-1、11111?-16-2、11111?-195、111；[1-322/ 424和miR-497中的至少一个。
[0046]在一个方面，器官功能是肝功能、肺功能、肾功能和微血管功能中的至少一个。 [0047]根据另一个方面，提供抑制miRNA-15家族的miRNA活性的试剂用于降低细胞凋亡 的用途。
[0048] 在一个方面，miRNA 是 mir-15a、mir-15b、miR-16-l、miR-16-2、miR-195、mir-322/ 424和miR-497中的至少一个。
[0049] 在一个方面，用途是降低内皮细胞、肝细胞、肾细胞和免疫细胞中至少一种的细胞 凋亡。
[0050] 在一个方面，免疫细胞是巨噬细胞。
[0051] 根据另一个方面，提供抑制miRNA-15家族的miRNA活性的试剂用于降低炎性反应 的用途。
[0052] 在一个方面，11111?祖是111；[1-15&、111；[1-1513、11111?-16-1、11111?-16-2、11111?-195、111；[1-322/ 424和miR-497中的至少一个。
[0053]在一个方面，炎性反应是在肝、肺、肾和微血管的至少一个中。
[0054]在一个方面，试剂是锁核酸（LNA)寡聚物、吗啉基寡聚物、2'-0_甲基RNA寡聚物、 an t agomi r、抑制m i RNA成熟的空间阻断的寡聚物、或阻断mRNA转录体的m i RNA祀标位点的空 间阻断的寡聚物。
[0055] 根据另一个方面，提供增强在脓毒症中上调的miRNA的靶基因活性的试剂用于治 疗脓毒症的用途。
[0056] 根据另一个方面，提供用于治疗脓毒症的组合物，其包含抑制在脓毒症中上调的 miRNA活性的试剂。
[0057] 在一个方面，miRNA是miRNA-15家族的成员。
[0058] 在一个方面，11111?祖是111；[1-15&、111；[1-1513、11111?-16-1、11111?-16-2、11111?-195、111；[1-322/ 424和miR-497中的至少一个。
[0059] 在一个方面，miRNA 是 miR-195。
[0060] 在一个方面，试剂用于保护器官功能。
[0061 ]在一个方面，器官功能是肝功能、肺功能、肾功能和微血管功能中的至少一个。
[0062] 在一个方面，试剂用于降低细胞凋亡。
[0063] 在一个方面，试剂用于降低内皮细胞、肝细胞、肾细胞和免疫细胞中至少一种的细 胞凋亡。
[0064]在一个方面，免疫细胞是巨噬细胞。
[0065] 在一个方面，试剂用于降低炎性反应。
[0066] 在一个方面，炎性反应是在肝、肺、肾和微血管的至少一个中。
[0067] 在一个方面，脓毒症是脂多糖诱导的脓毒症或粪便诱导的脓毒痖。
[0068] 根据另一个方面，提供用于保护器官功能的组合物，其包含抑制miRNA-15家族的 miRNA活性的试剂。
[0069] 在一个方面，11111?祖是111；[1-15&、111；[1-1513、11111?-16-1、11111?-16-2、11111?-195、111；[1-322/ 424和miR-497中的至少一个。
[0070] 在一个方面，器官功能是肝功能、肺功能、肾功能和微血管功能中的至少一个。
[0071] 根据另一个方面，提供用于降低细胞凋亡的组合物，其包含抑制miRNA-15家族的 miRNA活性的试剂。
[0072] 在一个方面，11111?祖是111；[1-15&、111；[1-1513、11111?-16-1、11111?-16-2、11111?-195、111；[1-322/ 424和miR-497中的至少一个。
[0073] 在一个方面，组合物用于降低内皮细胞、肝细胞、肾细胞和免疫细胞中至少一种的 细胞凋亡。
[0074]在一个方面，免疫细胞是巨噬细胞。
[0075] 根据另一个方面，提供用于降低炎性反应的组合物，其包含抑制miRNA-15家族的 miRNA活性的试剂。
[0076] 在一个方面，11111?祖是111；[1-15&、111；[1-1513、11111?-16-1、11111?-16-2、11111?-195、111；[1-322/ 424和miR-497中的至少一个。
[0077] 在一个方面，炎性反应是在肝、肺、肾和微血管的至少一个中。
[0078]在一个方面，试剂是锁核酸（LNA)寡聚物、吗啉基寡聚物、2'-0_甲基RNA寡聚物、 an t agomi r、抑制m i RNA成熟的空间阻断的寡聚物、或阻断mRNA转录体的m i RNA祀标位点的空 间阻断的寡聚物。
[0079] 根据另一个方面，提供用于治疗脓毒症的组合物，其包含增强在脓毒症中上调的 miRNA的靶基因活性的试剂。
[0080] 本发明的其他特征和优势将在以下详细描述中变得明显。然而，应当理解，当显示 本发明的方面时，详细描述和具体的实施例仅以说明性的方式给出，因为从所述详细描述 中，在本发明的精神和范围内的各种变化和修饰对于本领域技术人员将是显而易见的。
【附图说明】
[0081 ]将参照附图从以下描述中进一步理解本发明，其中：
[0082] 图IA和IB显示上调miR-195足以诱导内皮细胞中的细胞凋亡。
[0083]图2A和2B显示抑制miR-195降低了内皮细胞中脂多糖诱导的细胞凋亡。
[0084] 图3A、3B和3C显示miR-195抑制对LPS-诱导的脓毒症小鼠模型的肝组织中的细胞 凋亡的影响。
[0085]图4显示miR-195抑制对LPS-诱导的脓毒症小鼠模型的肺组织中的细胞凋亡的影 响。
[0086] 图5A、5B和5C显示miR-195抑制对LPS-诱导的脓毒症小鼠模型的肝组织中的炎性 反应的影响。
[0087]图6显示miR-195抑制对LPS-诱导的脓毒症小鼠模型的肾组织中的炎性反应的影 响。
[0088]图7A、7B和7C显示miR-195抑制对LPS-诱导的脓毒症小鼠模型的器官功能障碍的 影响。
[0089]图8A、8B、8C和8D显示mi R-19 5抑制对腹膜中的粪便-诱导的脓毒症小鼠模型的肝 脏的细胞凋亡和炎症的影响。
[0090] 图9A、9B、9C、9D和9E显示miR-195抑制对腹膜中的粪便-诱导的脓毒症小鼠模型的 肺的细胞凋亡和炎症的影响。
[0091] 图10显示miR-195抑制对腹膜中的粪便-诱导的脓毒症小鼠模型的存活率的影响。
[0092] 图11六、118、11(：、110、1^和11?显示1^1?-195抑制对1^5-诱导的脓毒症小鼠模型的 细胞凋亡、炎症和器官功能障碍的治疗性作用。
[0093]图12显示miR-195抑制对LPS-诱导的脓毒症小鼠模型的微血管功能障碍的治疗性 作用。
[0094] 发明详述
[0095] 本发明涉及与在脓毒症或其他病症中上调（与不存在这些疾病的正常水平相比） 的miRNA序列结合和/或相互作用的试剂。因此，这些试剂可用于治疗病症例如脓毒症、用于 保护器官功能、降低细胞凋亡和降低炎性反应。由本文所述的试剂靶向的特定miRNA属于， 例如 miRNA-15 家族，例如 111化-153、111化-1513、111丨1?-16-1、111丨1?-16-2、111丨1?-195、111化-322/424和 miR-497。
[0096] 除非另有定义，本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人 员通常理解的相同含义。参见例如Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.，J.Wiley&Sons(New York，N.Y.1994);Sambrook等， Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harb〇r，NY 1989)，其各自通过引用并入本文。为本发明的目的，下面定义以下术语。
[0097] 如本文所用，术语"miRNA"是指microRNA分子，其是小的（大约22个核苷酸)非编码 RNA分子，通过结合mRNA序列并靶向它们用于降解来转录后调苄基因表达。特定miRNA用前 缀"mir"加破折号和数字来命名。例如，miRNA-15家族的成员包括mir-15a、mir-15b、miR-16-l、miR-16-2、miR-195、mir-322/424^PmiR-497。
[0098] 本文所述的序列的"变体"是生物活性的序列，其因为在天然序列中一个或多个核 苷酸的插入、缺失、修饰和/或替换具有与天然序列或野生型序列(或其补体)不同的核苷酸 序列。这种变体通常与天然序列或其补体的序列一致性小于1〇〇%。然而，生物活性的变体 通常与对应的天然存在的序列或其补体具有至少约70%的序列一致性，通常至少约75%、 更通常至少约80%、甚至更通常至少约85%、甚至更通常至少约90%、且甚至更通常至少约 95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。任何长度的变体核苷酸片段保留对应天然序列 的生物活性。变体还包括其中在5'或3'端或在天然序列或其补体内添加一个或多个核苷酸 的序列。变体还包括其中一些核苷酸被删除和任选地被一个或多个不同核苷酸替换的序 列。
[0099] 本文的"百分比序列一致性"定义为在比对序列并引入空位(如有必要）以获得最 大百分比序列一致性之后，在候选序列中与目标序列的核苷酸或氨基酸残基相同的核苷酸 或残基的百分比，且不考虑任何保守性替换作为序列一致性的部分。在候选序列中的5'、3' 或内部延伸、缺失或插入均应不被解释为影响序列一致性或同源性。用于比对的方法和计 算机程序是本领域公知的，例如"BLAST"。
[0100]用于本文目的的"活性的"或"活性"是指天然或天然存在的miRNA、miRNA抑制剂或 miRNA靶序列的生物活性，其中"生物"活性是指由天然或天然存在的miRNA、miRNA抑制剂或 miRNA靶序列引起的生物功能(抑制或刺激）。
[0101] 因此，当"生物学活性的"或"生物活性"与"miRNA"、"miRNA抑制剂"或"miRNA靶序 列"组合使用时，是指表现或共有天然miRNA、miRNA抑制剂或miRNA靶序列的效应子功能的 核苷酸序列。例如，抑制miRNA活性的miRNA抑制剂或试剂的生物活性是抑制特定miRNA序列 的抑制性活性。同样，mi RNA序列通常的生物活性是抑制特定mRNA序列的翻译，从而抑制基 因表达。
[0102] 当"生物学活性的"或"生物活性"与变体序列组合使用时，是指变体序列表现或共 有亲本序列的效应子功能。与亲本序列相比，变体的生物活性可以增加、降低、或是相同水 平。
[0103] 术语"抑制"或"抑制性"是指miRNA的功能或活性被降低、限制、阻断或中和。这些 术语涵盖miRNA功能或活性的完全或部分抑制，包括特定miRNA与其祀mRNA的结合。
[0104] "miRNA靶序列"是特定miRNA结合和抑制的mRNA分子。例如，miRNA-15家族可以靶 向并抑制重要抗凋亡蛋白表达。这些蛋白包括但不限于BCL-2、Sirtl、Pim-l等。抗凋亡蛋白 的下调将促进凋亡性细胞死亡，这明显促进导致死亡的脓毒症相关的器官功能障碍。因此， 抑制miR-15家族的成员可以预防脓毒