、5-甲基氨基氨基-2-硫代 尿嘧啶、3-(3_氨基-3羧基丙基)尿嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N 4-乙酰基胞嘧啶、 2_硫代胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊基腺嘌呤、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、N-甲 基鸟嘌呤、或0-烷基化的碱基。antagomir可以包括有助于增强核酸酶抗性的核苷酸间连接 (例如手性硫代磷酸酯连接）。
[0195] 硫代磷酸酯（或S-寡聚物)是其中一个非桥联氧原子被硫替换的正常DNA或RNA的 变体。核苷酸间键的硫化急剧降低了内切和外切核酸酶(包括5 '到3'和3 '到5'的DNA POLl 外切核酸酶、核酸酶SI和PI、核糖核酸酶、血浆核酸酶和蛇毒磷酸二酯酶）的作用。此外，交 联脂双层的潜力增加。由于这些重要的改进，硫代磷酸酯在细胞调节中的应用正在增加。
[0196] 硫代磷酸酯通过两条主要途径制备:通过二硫化碳中元素硫的溶液对氢膦酸酯的 作用，或通过用四乙基秋兰姆二硫化物(TETD)或3H-1，2-苯并二硫代-3-酮-1，1-二氧化物 (BDTD)硫化亚磷酸三酯这一最近的方法。
[0197] 增强抗性的一种方式是鉴定切割位点并修饰这种位点以抑制切割。例如，二核苷 酸5' -UA-3'、5' -UG-SW7 -CA-SW7 -UlK^或5' -CC-3'可以作为切割位点。因此，可以通过修 饰5'核苷酸获得增强的核酸酶抗性，所述5'核苷酸形成例如至少一种5'-尿嘧啶-腺嘌呤-3' )二核苷酸，其中所述尿嘧啶是修饰的核苷酸；至少一种5'-尿嘧啶-鸟嘌 呤-3' (5' -UG-3')二核苷酸，其中所述5'-尿嘧啶是2'-修饰的核苷酸;至少一种5'-胞苷-腺 嘌呤-3' (5' -CA-3')二核苷酸，其中所述5'-胞苷是2'-修饰的核苷酸;至少一种5'-尿嘧啶-尿嘧啶-3' (5' -UU-3')二核苷酸，其中所述5'-尿嘧啶是-修饰的核苷酸;或至少一种5'-胞 苷-胞苷-3' )二核苷酸，其中所述5'-胞苷是-2'修饰的核苷酸。因此，antagomir 可以包括至少2种、3种、4种或5中此类二核苷酸。在一些方面，antagomir的所有嘧啶带有 2'-修饰，因此antagomir具有对内切核酸酶的增强的抗性。
[0198] antagomir可以具有二级结构，但在生理条件下，它通常基本上是单链的（至少在 与miRNA互补的antagomir区域内）。基本上是单链的antagomir是以下程度的单链:小于约 50 % (例如小于约40 %、30 %、20 %、10 %或5% )的antagomir与其自身形成双链体。因此，在 生理条件下，antagomir通常不会在互补区内形成发夹环、凸起或内环。
[0199] 在一个典型的方面，antagomir不包括有义链。在一些方面，antagomir是部分双 链，但至少在于miRNA互补的antagomir区域内是单链。术语"部分双链"是指其中一条链包 含的核苷酸少于其互补链的双链结构。一般这种部分双链的试剂将具有小于75 %的双链结 构、通常小于50%、更通常小于25%、20%或15%的双链结构。
[0200] 在一个典型的方面，antagomir适于体内递送至细胞，例如至生物体的细胞。在另 一个方面，antagomir适于体外递送至细胞，例如至培养物或悬浮液中的细胞系的细胞。 Antagomir可以包括选择以提高稳定性、分布或试剂的细胞内摄入的配体。例如，配体可以 是增强antagomir进入细胞的亲脂性部分，例如胆固醇。
[0201 ] Antagomir还可以被阳离子脂质颗粒包封。阳离子脂质饱和影响包封的核酸的分 子内递送。阳离子脂质包括1，2_双十八烷氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1，2_二油 氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷（DODMA)、1，2_二亚油氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷 (DLinDMA)和I，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基-3-氛基丙烷(DLenDMA)。
[0202] 在一些方面，公开的antagomir可以包括氨基糖苷类配体，其可以是antagomir具 有改进的杂交性质或改进的序列特异性。示例性的氨基糖苷包括糖基化的多聚赖氨酸;半 乳糖基化的多聚赖氨酸;新霉素 B;妥布霉素;卡那霉素 A;和氨基糖苷类的吖啶偶联物，例如 Neo-N-吖啶、Neo-S-叮啶、Neo-C-叮啶、Tobra-N-吖啶和KanaA~N-吖啶。使用吖啶类似物可 以增加序列特异性。例如，新霉素 B对RNA的亲和性高于DNA，但序列特异性低于DNA。在一些 方面，氨基糖苷类配体的胍基类似物(胍基糖苷)与寡核苷酸试剂相连。在胍基糖苷中，氨基 酸的氨基与胍基交换。连接胍基类似物可以增强寡核苷酸试剂的细胞渗透性。
[0203] 在细胞内可以从具有编码antagomir的核酸的表达载体表达公开的antagomir。核 酸序列可以可操作地与表达控制序列，例如启动子相连。本领域技术人员理解，可以在真核 细胞内从合适的DNA RNA载体表达任何核酸。
[0204] 因此，可以从插入DNA或RNA载体的转录单元表达公开的antagomir。重组载体可以 是DNA质粒或病毒载体。表达寡核苷酸试剂的病毒载体可以基于但不限于以下来构建:腺病 毒群、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、或甲病毒。能够表达寡核苷酸试剂的重组载体可以如上 所述递送，并在靶细胞中保留。或者，可以使用提供核酸分子瞬时表达的病毒载体。如有需 要，这种载体可以重复施用。一旦表达，公开的antagomir与目标miRNA相互作用并抑制其活 性。在典型的方面，至少部分的antagomir与内源miRNA形成双链体，其阻止内源miRNA与其 革巴mRNA结合，造成祀mRNA的翻译增加。表达寡核苷酸试剂的载体的递送可以是全身性的，例 如通过静脉内或肌内施用、通过向从受试者前移植的靶细胞施用接着再引入受试者，或通 过允许引入期望革E细胞的任何其他手段(综述参见Couture等，Trends in Genetics 12: 510，1996)〇
[0205] 试剂还可以是小分子抑制剂。如本文所用，术语"小分子"是指抑制或降低所讨论 的miRNA活性的小有机化合物、无机化合物或其组合;该术语可以包括单体或初级代谢物、 次级代谢物、生物胺、类固醇、或合成或天然的非肽类生物分子。
[0206] 例如，Huang和他的同事开发了一种在人活细胞中鉴定miRNA通路的抑制剂的方法 (Angew Chem Int Ed Engl.2008;47(39):7482_4)。具体地，他们设计了筛选分析以寻找选 择性抑制miRNA的小分子或化合物。他们选择了 miR-21作为靶试剂，因为据记录其在预防细 胞死亡中起作用-从而允许与癌症相关的未检查的细胞增殖-及其在各种癌症中的升高的 水平。他们的分析包括与miRNA互补的与报告基因例如荧光素酶结合的DNA结合序列。在正 常条件下，miRNA与互补序列结合并抑制报告基因例如荧光素酶的翻译。然后在样品中加入 候选试剂以确定所述候选试剂是否降低miRNA对报告基因表达的抑制。
[0207] 因此，提供一种方法，其涉及提供具有带有在允许目标miRNA与寡核苷酸结合的条 件下与目标miRNA互补的DNA结合序列的寡核苷酸的样品，将样品与候选试剂接触，检测 miRNA/寡核苷酸的结合水平，将结合水平与对照比较，与对照相比miRNA/寡核苷酸的结合 降低则鉴定miRNA抑制剂。
[0208]可以使用常规方法检测miRNA与寡核苷酸的结合。在一个典型的方面，将与目标 miRNA互补的DNA结合序列可操作地与报告构建体例如荧光素酶或GFP连接，其中目标miRNA 与寡核苷酸的结合抑制报告基因的表达。一般可以从天然产物的大文库或合成(或半合成） 提取物或化学文库中根据本领域已知的方法鉴定候选试剂。药物发现和开发领域的技术人 员将理解，测试提取物或化合物的精确来源对于本发明的筛选程序不是关键的。因此，事实 上可以使用本文所述的示例性方法筛选任何数量的化学提取物或化合物。这种提取物或化 合物的实例包括但不限于基于植物、真菌、原核生物或动物的提取物、发酵液、和合成化合 物，以及已有化合物的修饰。还可以获得用于制备随机或定向合成(例如半合成或全合成） 任何数量的化学化合物(包括但不限于基于糖、脂质、肽、多肽和核酸的化合物）的各种方 法。可商购合成化合物文库，例如从Brandon Associates (Merrimack，NH)和Aldrich Ch emical(Mi lwaukee，WI)。或者，可从各种来源（包括Biotics( Sussex，UK)、Xenova (Slough,UK)NHarbor Branch Oceangraphics Institute(Ft.Pierce，Fla.)和PharmaMar， U. S. A. (Cambridge，Mass.))商购细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的文库。 此外，如有需要，根据本领域已知的方法例如通过标准提取和分级方法产生天然和合成制 备的文库。此外，如有需要，使用标准化学、物理或生物方法容易地修饰任何文库或化合物。
[0209] 当发现粗提取物具有期望活性是，需要进一步分级主要是阳性的提取物 (positive lead extract)以分离引起观察到的效果的化学组分。因此，提取、分级和纯化 过程的目的是仔细表征并鉴定粗提取物中具有刺激或抑制miRNA活性的化学个体。本文所 述的用于在化合物混合物中检测活性的相同分析可用于纯化活性成分并测试其衍生物。分 级并纯化这种异源提取物的方法是本领域已知的。如有需要，根据本领域已知的方法化学 修饰表明是用于治疗的有用试剂的化合物。随后可使用疾病或病症(如本文公开的那些）的 动物模型分析鉴定为具有治疗价值的化合物。
[0210] 候选试剂涵盖各种化学类别，但最通常是有机分子，例如分子量大于100且小于约 2500道尔顿的小有机化合物。候选试剂包含与蛋白质结构上相互作用(尤其是氢键)所需的 官能团，一般包括至少一个胺基、羰基、羟基或羧基，例如官能化学基团中的至少两个。候选 试剂通常包含环状碳或杂环结构和/或用一个或多个以上官能团取代的芳族和多环芳烃结 构。候选试剂还在生物分子中发现，所述生物分子包括肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、 衍生物、结构类似物或其组合。在进一步的方面，候选试剂是肽。
[0211]在一些方面，候选试剂是蛋白质。在一些方面，候选试剂是天然存在的蛋白质或天 然存在蛋白质的片段。因此，可以使用例如包含蛋白质的细胞提取物或蛋白质细胞提取物 的随机或定向消化产物。以这种方式，可以制备用于本文的方法筛选的原核和真核蛋白的 文库。文库可以是细菌、真菌、病毒和脊椎动物蛋白和人蛋白。
[0212]使用本领域已知的方法，可以用化学合成和/或酶连接反应构建antagomir，例如 单链核苷酸试剂。例如，可以使用天然存在的核苷酸或设计以增加分子的生物稳定性或增 加 an t a g 〇 m i r和革El核酸之间形成的双链体的物理稳定性的各种修饰核苷酸(例如可以使用 硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)化学合成antagomir。本文描述了其他合适的核酸 修饰。或者，可以使用表达载体制备antagomir，其中核酸以反义方向亚克隆至所述表达载 体(即从插入核酸转录的RNA对于目标祀miRNA而言将是反义的方向）。
[0213] 本文所述的试剂可以配制成组合物，其可以进一步包含一种或多种药学上可接受 的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂、助剂或其混合物。
[0214] 以冻干制剂或水溶液的形式通过以下制备试剂的治疗性组合物:将具有合适纯度 的期望试剂与任选的药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂混合（Remingtor/ s Pharmaceutical Sciences，16 th edition，Osol，A.ed.( 1980)，其全文通过引用并入本 文）。如上所述，可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度对接受者无毒。
[0215] 这种载体的其他实例包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白例如 人血清白蛋白、缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油 酯混合物、水、盐、或电解质例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体 二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质和聚乙二醇。用于局部或基于凝 胶的试剂形式的载体包括多糖，例如羧甲基纤维素钠或甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙 烯酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和木蜡醇。对于所有施用，可以使用常 规的储库形式。这种形式包括例如微胶囊、纳米胶囊、脂质体、膏药、雾化形式、鼻喷剂、舌下 片和缓释制剂。
[0216] 通常将试剂以以下浓度配制入这种载体:对于质粒DNA，约0.01 mg/ml-约IOOmg/ ml，例如约0 · 1-约lmg/ml，或通常约0.4mg/ml，对于反义寡聚物，例如约1-约10mg/ml，或通 常约 4mg/ml。
[0217]用于体内施用的试剂通常是无菌的。这容易达成，例如在冻干和重组之前或之后 通过无菌过滤膜过滤。如果全身施用，一般将试剂以冻干形式或在溶液中储存。如果是冻干 形式，一般将试剂与其他用于在使用时用合适的稀释剂重组的成分一起配制。本文所述的 试剂的液体制剂的实例是用于皮下注射的装在单剂量小瓶中的无菌、透明、无色无防腐剂 溶液。用于重复使用的防腐的药物组合物主要根据试剂的指示和类型可以包含，例如:所述 试剂;在溶液中能将pH保持在试剂的最大稳定性范围（通常约4-8)内的缓冲剂;主要使试剂 对于振荡诱导的聚集稳定的洗涤剂/表面活性剂;等渗剂（isotonif ier);选自苯酸、苯甲醇 和苄乙氧铵卤化物，例如氯化物的防腐剂;和水。
[0218] 如果所用洗涤剂是非离子的，它可以包含例如聚山梨醇酯（例如P0LYS0RBATE? (TWEEN?) 20、80等)或泊洛沙姆（例如POLOXAMER? 188)。使用非离子表面活性剂使制剂暴 露于剪切面应力而不引起试剂变性。此外，可以在雾化装置例如在肺部给药、无针喷射枪中 所用的那些中使用这种包含表面活性剂的制剂（参见例如其全文通过引用并入本文的EP 257,956)〇
[0219] 可以存在等渗剂以确保本文所述的试剂的液体组合物的等渗性，包括多元糖醇， 通常是三元或更多元糖醇，例如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。这 些糖醇可以单独或组合使用。或者，可以使用氯化钠或其他合适的无机盐使溶液等渗。
[0220] 缓冲剂取决于所需的pH可以是例如醋酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、或磷酸盐缓冲 剂。将一种类型的本发明液体制剂的PH缓冲至约4-8的范围，通常约生理pH。
[0221]防腐剂苯酚、苯甲醇和苄乙氧铵卤化物，例如氯化物是可以使用的已知抗菌剂。
[0222] 本文所述的治疗性组合物一般置于具有无菌接入端口的容器，例如具有可用皮下 注射针刺穿的塞的输液袋或瓶。通常以重复地静脉（i.v.)、皮下（s.c.)或肌内（i.m.)注射 施用制剂，或作为适于鼻内或肺内递送的雾化制剂施用(对于肺内递送，参见例如其全文通 过引用并入本文的EP 257,956)。
[0223] 包含用于治疗本文所述的疾病的试剂的制造物品，例如试剂盒包含至少容器和标 签。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可以由各种材料例如玻璃或塑料制 成。容器容纳有效诊断或治疗病症的组合物，并可以具有无菌接入端口（例如，容器可以是 具有可用皮下注射针刺穿的塞的输液袋或瓶）。组合物中的活性剂是本文所述的试剂。容器 上的或与容器相关的标签说明该组合物用于治疗选择的病症。制造物品可以进一步包含含 有药学上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲生理盐水、林格氏液或葡萄糖溶液的第二容器。 它可以进一步包括从商业和使用者角度所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤 器、针、注射器和带有使用说明的包装说明书。制造物品还可以包含含有本文所述的另一种 药学活性剂的第二或第三容器。
[0224] 本文所述的试剂还可以缓释制剂的形式施用。缓释制剂的合适实例包括含有试剂 的固体疏水性聚合物的半透基质，所述基质是成型制品的形式，例如膜或微胶囊。缓释基质 的实例包括聚酯、水凝胶（例如 Langer等，J. BiomecL Mater .Res. 15:167-277 (1981)和 Langer，Chem.Tech. 12:98-105(1982)描述的聚（2-轻乙基-甲基丙稀酸酯）或聚（乙稀醇））、 聚交酯（美国专利号3,773,919 4? 58,481)上-谷氨酸和丫乙基-1^-谷氨酸盐的共聚物 (Sidman等，Biopolymers 22:547_556( 1983))、不可降解的乙稀-醋酸乙稀酯（Langer等，以 上）、可降解的乳酸_乙醇酸共聚物，例如Lupron Dep〇t?(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙 瑞林组成的可注射的微球)和聚-D-(-) -3-羟基丁酸(EP 133，988)。这些文献的每一个的全 文通过引用并入本文。
[0225] 缓释组合物还包括脂质体包埋剂。包含本文所述的试剂的脂质体通过本身已知的 方法制备：DE 3,218,121 ;Epstein等，Proc .Natl .Acad .Sci .USA 82:3688-3692(1985); Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030-4034(1980);EP 52,322;EP 36,676;EP 88， 046;EP 143,949;EP 142,641;日本专利申请83-118008;美国专利号4,485,045和4,544， 545;和EP 102,324,其各自通过引用并入本文。通常脂质体是小（约200-800埃)单层型，其 中脂质含量大于约30mol%胆固醇，调整选择的比例用于最佳疗法。
[0226] 考虑其他相似的递送方法，例如通过纳米胶囊、微粒、微球、纳米颗粒、脂质颗粒、 囊泡等。通常，试剂配制为包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或例如纳米颗粒中用于递 送，且可以进一步包括暴露以协助位点特异性递送试剂的靶向分子。
[0227]脂质体的形成和使用是本领域技术人员已知的（参见例如Couvreur等，FEB